Introduction
A diabetes de tipo 1 (DM1) é uma doença auto-imune que se caracteriza pela destruição do produtoras de insulina β células por células T auto-reactivas 1. O diagnóstico de DM1 é tipicamente feito na medição (glucose no sangue> 200 mg / dl) em hiperglicemia, um indivíduo jovem magra, que pode apresentar-se com cetoacidose como evidência da deficiência de insulina. No momento do diagnóstico de DM1, existe evidência substancial de perda de função celular e β massa (50-90%) 2. Em estudos clínicos, vários fármacos imunomoduladores que foram instituídos no momento do diagnóstico resultou na estabilização da função das células β (e, presumivelmente, de massa), mas nenhum deles resultou em remissão clínica de doença, uma descoberta que elevou a chamada para o desenvolvimento de biomarcadores para a detecção precoce da doença e para o acompanhamento longitudinal da eficácia da combinação de terapias de 3,4. Os esforços dos consórcios internacionais, como ado Consórcio Rede de Investigação Islet Humano dos Institutos Nacionais de Heath 5, têm enfatizado a necessidade de desenvolver biomarcadores que incidem sobre o stress celular β e morte em DM1.
Em linha com estes esforços, o nosso grupo e outros têm desenvolvido recentemente ensaios de biomarcadores que medem circulantes, fragmentos de DNA epigenetically modificados que surgem principalmente de morrer células p 6-9. Em todos os ensaios publicados até à data, o foco tem sido sobre a quantificação do gene humano que codifica preproinsulina (INS), o que demonstra maiores graus de locais de CpG não metiladas nas regiões de codificação e o promotor, em comparação com outros tipos de células. A libertação de fragmentos de DNA INS não metiladas foi levantada a hipótese como decorrente principalmente de morrer (necróticas, apoptóticos) células beta. Os nossos estudos recentes mostraram que na juventude, as elevações da ADN INS ambos não metilado e metilado na posição -69 pb (em relação a tele transcricional começar local) foram observados em novo início DM1, e juntos servido biomarcadores como específicos para esta população 6. Estes ensaios de biomarcadores envolvem o isolamento de ADN isento de células a partir do soro ou plasma utilizando estojos comerciais de rotação, seguida de uma conversão de bissulfito de DNA isolado (para converter citosinas não metiladas em uracilos, deixando as citosinas metiladas intacta).
Neste relatório, nós descrevemos os aspectos técnicos da coleta de amostra de soro, o isolamento de DNA livre de células a partir do soro, a conversão de bissulfito, eo desempenho de PCR digital de gota (de agora em diante, PCR digital) para DNA INS diferencialmente metilado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para interpretar os dados de forma adequada, usamos controles plasmídeo tanto para o DNA não metilado e metilado INS alvo em cada corrida PCR digital. Estes controlos asseguram que os sinais correspondentes para ADN metilado e não metilado são claramente distinguíveis. A Figura 1 mostra os gráficos de dispersão 2-D correspondentes às gotas para os controlos de plasmídeo contendo converteu-bissulfito não metilado ADN INS (Figura 1A), ADN INS metilado (Figura 1B), e uma mistura 1: 1 dos dois plasmídeos (Figura 1C). O plasmídeo não metilado contendo INS está indicado pelas gotículas positivos para o sinal de 6-carboxifluoresceína (FAM), enquanto que o INS plasmídeo contendo metilado é indicado pelas gotículas positivos para o sinal VIC. Na mistura 1: 1 de plasmídeo, uma população de gotículas de duplo-positivos é vista, correspondente às gotas que contenham ambas as espécies deADN. Para distinguir gotículas positivos de negativos gotas, os dados são fechadas utilizando estas parcelas 2-D. Note-se que na Figura 1A, existe um ligeiro deslocamento das gotículas FAM-positiva para o canal VIC, indicando que a sonda para o ADN metilado INS apresenta alguma reactividade cruzada para o ADN não metilado INS. Do mesmo modo, na Figura 1B, existe uma muito ligeira mudança das gotículas VIC-positivas no interior do canal FAM, indicando a reactividade cruzada da sonda para o ADN não metilado com ADN metilado. Uma grande vantagem de PCR digital é ainda possível discriminar sinais específicos, mesmo quando as sondas são 100% não específica. Para Poisson cálculos estatísticos apropriados pelo software, cada reacção de PCR deverá particionar em pelo menos 10.000 gotículas totais, exibir um conjunto de gotículas negativos, e mostram uma diferença de amplitude clara entre gotículas negativos e positivos (para gating confiável). Para demonstrar a linearidade dos nossos iniciadores, que Performed misturas dos dois plasmídeos em diversas ordens de magnitude. Como mostrado na Figura 2, variando as concentrações de um plasmídeo pode ser detectada de forma linear na presença de uma quantidade constante de o segundo plasmídeo. Para os novos laboratórios de realizar este procedimento, recomendamos a construção de uma experiência de mistura semelhante para assegurar que o ensaio está a funcionar de uma forma de detecção linear.
Em seguida, obteve-se soro de três indivíduos com DM1 de início recente (dentro de 2 dias de diagnóstico) e três indivíduos de controlo sem DM1 (ver Tabela 1 para características clínicas). Protocolos foram aprovados pela Universidade de Indiana Institutional Review Board. Os pais de indivíduos forneceram consentimento informado por escrito. A Figura 3 mostra a quantificação de ADN não metilado e metilado INS copiar números / ul de soro, convertido em log 10 a partir destes controlos e sujeitos DM1. Os dados mostram que i ndivíduos com DM1 apresentam níveis elevados de DNA INS tanto metilado e não metilado, em comparação com os controles, semelhantes aos dados reportados anteriormente 6.
Figura 1: Representante Lotes 2-D de Controles de plasmídeos. Padrões de plasmídeos foram gerados por clonagem de fragmentos de ADN convertidos INS-bissulfito abrigando a citosina não metilada ou metilado na posição -69 pb em relação ao INS transcricional iniciar local. Mostram-se parcelas de 2-D, utilizando plasmídeo não metilado contendo (A) e metilado (B) ADN INS e para uma mistura 1: 1 dos dois plasmídeos (C). As setas identificam o não metilado, metilado e não metilado + metilado (um duplo positivo) INS-DNA contendo gotículas. FAM = Meta 1; VIC = Target 2.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quantificação de Metas de DNA usando o controle de plasmídeo misturas. Padrões de plasmídeo contendo os fragmentos clonados de ADN convertido INS-bissulfito abrigando a citosina não metilada ou metilado na posição -69 pb em relação ao INS transcricional iniciar local foram misturados em várias combinações indicadas, em seguida, submetidos a PCR multiplex digital. A figura mostra a quantificação de fragmentos de DNA alvo, apresentadas como cópias / mL; r 2 = 0,989 para o ADN não metilado INS e r 2 = 0,998 para o ADN metilado INS. Por favor clique aqui paraver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os níveis circulantes não metilado e de DNA INS metilatados Controles e indivíduos com DM1. As amostras de soro foram coletadas de 4 juventude com novo início DM1, e de 4, controles independentes livres da doença, então processado para medição de DNA INS diferencialmente metilado por PCR digital. São mostrados os resultados de ensaios de PCR digital para não metilado (A) e metilado (B) ADN INS. Os dados são apresentados como pontos individuais e médios ± SEM. As estatísticas foram analisadas por um teste de duas caudas Estudantes paramétricos t. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do this figura.
| controles | DM1 de início | |
| Idade (anos) | 10,3 ± 1,3 | 9,2 ± 1,0 |
| Feminino / Masculino | 1: 3 | 1: 3 |
| IMC Z-Score | 0,30 ± 0,9 | 0,74 ± 0,9 |
| HbA 1C (%) | 11,1 ± 0,6 | |
| C-Peptide (pmol / L) | 285,5 ± 37,0 |
Tabela 1: Demografia de Controles e Indivíduos com DM1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A metilação de citosinas de ADN metiltransferases permite o controlo da transcrição epigenética em muitos genes. O gene INS em seres humanos é expressa quase exclusivamente em células ilhéu β, e parece haver uma correlação entre a frequência de metilação de citosinas no gene INS para o silenciamento de 11 a sua transcrição. Como tal, a maioria dos tipos de células apresentam frequências substancialmente mais elevados de metilação do gene INS em vários citosinas, em comparação com células p 11-13. Tem sido proposto que a prevalência de morte celular β pode ser monitorizada por análise dos níveis séricos de ADN não metilado INS isento de células, que surgem em grande parte da morte de células beta, que libertam o seu ADN 12.
A reacção bissulfito converte citosinas não metiladas em uracilos, deixando as citosinas metiladas 14 inalteradas. Sequenciamento ou análise de PCR oF-bissulfito de ADN convertido por conseguinte, permite a determinação de se a citosina metilada original ou não. -Metilação específicas de PCR utilizando a tecnologia à base de corantes explora diferenças na eficiência da PCR devido a incompatibilidades "-pares de bases 3 entre iniciadores e modelo, e, assim, permite distinção de não metilado vs. citosinas metiladas após a conversão de bissulfito de DNA 15. Deste modo, por PCR à base de corantes foi utilizada para quantificar a proporção relativa de não metilado para INS metilado em estudos iniciais de DM1 submete 12,16. No entanto, a tecnologia de PCR com base em corantes tem várias desvantagens, incluindo a especificidade limitada, falta de quantificação absoluta de concentrações de fragmentos de ADN, e a incapacidade de multiplex (ou seja, detectar ambas as espécies de ADN metilado e não metilado na mesma reacção). Outros grupos têm realizado seqüenciamento direto de fragmentos de DNA de células livres, uma técnica que permite o monitoramento de vários locais CpG diferencialmente metilados com muito grandeespecificidade er 9. No entanto, a técnica de sequenciação requer grandes volumes de amostra, não é facilmente passível de utilização de amostras inclinadas, e é caro.
Como resultado destas limitações, o nosso grupo e outros já empregues PCR digitais, uma técnica que proporciona a quantificação absoluta dos fragmentos de ADN, requer apenas quantidades de microlitros de soro a partir de amostras frescas ou inclinadas, é passível de multiplexação, mostra uma maior sensibilidade do que a PCR quantitativa tradicional e é menos caro do que o sequenciamento direto. A tecnologia de PCR digital envolve a utilização de ensaios de iniciador / sonda convencional e um particionamento baseada microfluidos de uma reacção de PCR de água-em-óleo em gotículas de ~ 20000. Após ciclos térmicos da reacção particionado, as gotículas são depois analisadas por um citómetro de fluxo para identificar as gotas com sinais positivos e negativos. estatística de Poisson é usado para calcular as quantidades absolutas (número de cópias) de cada espécie de DNA. O d conceitualetails de digital de PCR foram descritas na literatura 17.
Este protocolo descreve a medição da morte celular β em seres humanos através da medição de DNA INS diferencialmente metilada por PCR digital. Os dados apresentados aqui e noutros lugares 6 mostram que as combinações de primer / sonda que detectam metilação diferencial de citosina na posição -69 (relativamente ao local de início da transcrição de INS) exibem especificidade suficiente para quer a citosina não metilada (sonda FAM) ou a citosina metilada ( sonda VIC) (ver Figura 1A e B). Misturas de plasmídeos contendo fragmentos de INS tanto metilados e não metilados na posição -69 pb (isto é, bissulfito-convertido quer ADN possuindo uracilo ou citosina na posição -69 pb) contendo sinais de gotículas apresentam um ou outro plasmídeo, ou ambos os plasmídeos (duplo-positivos na Figura 1C). O cálculo estatístico Poisson utiliza thnúmeros de gotas e que são positivas para uma dada sonda (se single-positivo ou duplo positivo) para obter os números de cópias de cada fragmento de ADN metilado ou não metilado.
Quando se utiliza soro humano para a medição de citosinas metiladas diferencialmente na posição -69 pb de ADN isento de células (Figura 3), os nossos dados demonstram duas características principais: (1) os níveis de Ins metilados são 5-10 vezes mais elevado nestes indivíduos do INS não metilado (independentemente do diagnóstico), e (2) os níveis absolutos de ambos os INS não metilados e metilados são mais elevados em indivíduos com DM1 de início recente em relação aos controles. Considerando que os níveis mais elevados de INS metilados em comparação com INS não metilado provavelmente reflectem a maior carga de ADN isento de células que emana a partir de células não-p, os níveis mais elevados de ambas as espécies de INS em indivíduos DM1 de início recente reflecte provavelmente tanto um aumento no β prevalente morte celular (EM não metiladoS), e, possivelmente, a morte / volume de outros tipos de células que estão associados com o estado de doença (por exemplo, células do sistema imune inato e adaptativo). Ainda mais a especulação sobre as elevações de ambas as espécies de INS em indivíduos DM1 de início recente foi discutido anteriormente 6. Independentemente das fontes de ambas as espécies de INS no soro a partir desses indivíduos, é notável que a medição da proporção do não metilado para INS metilado (como relatado por outros investigadores usando-dye, baseado na PCR) não teria pego as diferenças significativas nos níveis absolutos descrito aqui e na nossa recente publicação 6, enfatizando, assim, o poder de PCR digital para este tipo de análise biomarcador.
Algumas precauções e limitações devem ser observados. Nós sentimos que é importante que o sangue é processado dentro de 4 horas de recolha e seja usado imediatamente para o isolamento de ADN ou armazenadas a -80 ºC para uso futuro. Em estudos não publicados, temos observed alguma perda de recuperação de ADN após 4 horas de recolha, talvez devido à degradação de ADN, como observado em estudos de armazenamento de longo prazo de amostras 18. Devido ao aumento da sensibilidade da PCR digitais, cuidados especiais devem ser tomados para evitar a contaminação das amostras que de outra forma não seria perceptível no tradicional qPCR. Finalmente, uma limitação chave da técnica é a análise de amostras em que a geração de gotícula não superior a 10.000 ~ gotículas. Tais amostras não fornecem as estatísticas Poisson fiáveis, e como tal, podem ser considerados não interpretáveis. Várias causas dessa baixa geração de gotículas podem incluir erros técnicos no manuseamento das amostras, problemas técnicos com o gerador de gotículas, ou questões relacionadas com a qualidade dos reagentes utilizados.
Em resumo, este relatório descreve o protocolo detalhado para a medição de DNA diferencialmente metilado, livre de células INS na posição -69 pb por PCR digital. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado a qualquerespécies de ADN para os quais é desejada a detecção de citosinas metiladas diferencialmente, quer de circulação ou a partir de células e tecidos isolados, e pode proporcionar a quantificação absoluta dos fragmentos de ADN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
