Introduction
Type 1 diabetes (T1D) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door de vernietiging van insuline producerende eilandjes β cellen door autoreactieve T-cellen 1. De diagnose van type 1 wordt gewoonlijk plaats na meting van hyperglycemie (bloedglucose> 200 mg / dl) in een slanke jonge individu, dat met ketoacidose zou voorstellen als bewijs van insulinedeficiëntie. Ten tijde van de diagnose van type 1, blijken er aanzienlijk verlies van β celfunctie en massa (50-90%) 2. In klinische studies, verschillende immuun modulerende geneesmiddelen die op het ogenblik van de diagnose werd ingesteld resulteerde in de stabilisatie van β celfunctie (en vermoedelijk massa), maar niets hebben geleid tot klinische remissie van de ziekte, een bevinding dat de oproep voor de ontwikkeling heeft verhoogd van biomerkers voor vroege detectie van de ziekte en de lengterichting volgen van de effectiviteit van combinatietherapieën 3,4. Inspanningen van internationale consortia, zoals eenis de Human Islet Research Network Consortium bij de National Institutes of Heath 5, hebben benadrukt de noodzaak om biomarkers die zich richten op β cel stress en dood in T1D ontwikkelen.
9 - In lijn met deze inspanningen, hebben onze groep en anderen onlangs biomarkeranalyses Deze maatregel circuleren, epigenetisch gemodificeerd DNA fragmenten die in de eerste plaats het gevolg zijn van stervende cellen β 6 ontwikkeld. In alle gepubliceerde onderzoeken tot nu toe heeft de nadruk gelegd op de kwantificering van het menselijk gen dat codeert voor prepro (INS), die een grotere mate van ongemethyleerde CpG posities in de coderende en promotergebieden vergelijking met andere celtypen blijkt. De bevrijding van niet-gemethyleerd INS DNA-fragmenten werd de hypothese als in de eerste plaats als gevolg van het sterven (necrotische, apoptotische) β-cellen. Onze recente studies is gebleken dat in de jeugd, verhogingen in zowel niet-gemethyleerd en gemethyleerd DNA INS op positie -69 bp (ten opzichte van thij transcriptionele site en start) werden waargenomen in nieuwe-onset T1D, en samen diende als specifieke biomarkers voor deze populatie 6. Deze biomarkeranalyses omvatten de isolatie van celvrije DNA uit serum of plasma met behulp commerciële kits rotatie, gevolgd door een bisulfiet omzetting van het geïsoleerde DNA (die niet-gemethyleerde cytosines omzetten uracils, waardoor gemethyleerde cytosines intact).
In dit rapport beschrijven we de technische aspecten van het serum monstername, isolatie van cel-vrij DNA uit serum, bisulfiet conversie, en de prestaties van de druppel digitale PCR (voortaan digitaal PCR) voor het differentieel gemethyleerd INS DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om gegevens op de juiste wijze te interpreteren, maken we gebruik van plasmide controles voor zowel de niet-gemethyleerde en gemethyleerde doelwit INS DNA in elk digitaal PCR run. Deze controles zorgen ervoor dat signalen die overeenkomen met gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA zijn duidelijk te onderscheiden. Figuur 1 toont de 2-D spreidingsdiagrammen overeenkomt met druppeltjes van plasmide controles met bisulfiet geconverteerd niet-gemethyleerd INS DNA (figuur 1A), gemethyleerd INS DNA (figuur 1B), en een 1: 1 mengsel van de twee plasmiden (figuur 1C). Een plasmide dat ongemethyleerde INS aangeduid met de druppeltjes positief voor de 6-carboxyfluoresceïne (FAM) signaal, terwijl plasmide bevattende gemethyleerd INS aangeduid met de druppeltjes positief voor de VIC signaal. In de 1: 1 mengsel plasmide, wordt een populatie van dubbel-positieve druppeltjes gezien, overeenstemt met druppeltjes die beide soortenDNA. Om positieve druppeltjes te onderscheiden van negatieve druppeltjes, worden de gegevens gated met behulp van deze 2-D plots. Merk op dat in figuur 1A is er een lichte verschuiving van de FAM-positieve druppeltjes in de VIC kanaal, wat aangeeft dat de sonde voor de INS gemethyleerd DNA vertoont enige kruisreactiviteit voor de INS ongemethyleerde DNA. Ook in figuur 1B, is er een zeer geringe verschuiving van de VIC-positieve druppeltjes in het FAM kanaal aangeeft kruisreactiviteit van de probe voor de ongemethyleerde DNA met gemethyleerd DNA. Een groot voordeel van digitale PCR kan nog specifieke signalen discrimineren ook als probes zijn niet 100% specifiek. Voor de juiste Poisson statistische berekeningen door de software, moet elke PCR-reactie verdelen in minstens 10.000 totale druppeltjes, een cluster van negatieve druppels weer te geven en te laten zien een duidelijke amplitude verschil tussen negatieve en positieve druppels (voor een betrouwbare gating). Lineariteit te demonstreren onze primers, we performed mengsels van de twee plasmiden tussen verschillende ordes van grootte. Zoals getoond in figuur 2, kunnen variërende concentraties van een plasmide lineair worden gedetecteerd in de aanwezigheid van een constante hoeveelheid van de tweede plasmide. Voor nieuwe labs deze procedure, raden wij construeren een soortgelijk mengsel experiment dat de test werkt in een lineaire detectie mode.
Vervolgens kregen we serum van drie onderwerpen met nieuwe-onset T1D (binnen 2 dagen na diagnose) en drie controle individuen zonder T1D (zie tabel 1 voor klinische kenmerken). Protocollen zijn goedgekeurd door de Indiana University Institutional Review Board. De ouders van de proefpersonen gaven schriftelijk toestemming. Figuur 3 toont de kwantificering van niet-gemethyleerd en gemethyleerd INS DNA te kopiëren nummers / ul serum, omgezet in log 10 van deze controles en T1D onderwerpen. De gegevens tonen dat i ndividuals met T1D vertonen verhoogde niveaus van zowel gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA INS vergelijking met controles, vergelijkbaar met gegevens die eerder 6 gemeld.
Figuur 1: Vertegenwoordiger van 2-D Plots van plasmide Controls. Plasmide standaards werden gegenereerd door het kloneren van fragmenten van bisulfiet geconverteerd INS DNA herbergen ongemethyleerde en gemethyleerde cytosine op positie -69 bp ten opzichte van de INS transcriptionele start plaats. Voorbeeld 2-D plots middels plasmide dat ongemethyleerde (A) en gemethyleerde (B) INS DNA en een 1: 1 mengsel van de twee plasmiden (C). Pijlen identificeren van de ongemethyleerde, gemethyleerde en niet-gemethyleerd + gemethyleerd (dubbel- positief) INS DNA-bevattende druppeltjes. FAM = Target 1; VIC = Target 2.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: kwantificering van DNA Doelen gebruik van Control Plasmid mengsels. Plasmide standaarden met gekloneerde fragmenten van bisulfiet geconverteerd INS DNA herbergen ongemethyleerde en gemethyleerde cytosine op positie -69 bp ten opzichte van de INS transcriptionele start plaats werden gemengd in verschillende combinaties getoond, daarna onderworpen aan digitale multiplex PCR. De figuur toont de kwantificering van doelwit DNA-fragmenten, gepresenteerd als kopieën / ul; r 2 = 0,989 voor gemethyleerd DNA INS en r 2 = 0,998 voor gemethyleerd DNA INS. Klik hier ombekijk een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: De doorgeven niet-gemethyleerd en Brandspiritus INS DNA-spiegels in Controls en Proefpersonen met T1D. Serummonsters werden uit 4 jeugd met nieuwe-onset T1D verzameld en van 4 ziekte-vrije, niet-verwante controles, dan verwerkt voor het meten van differentieel gemethyleerd INS DNA door digitale PCR. Getoond worden de resultaten van digitale PCR assays voor ongemethyleerde (A) en gemethyleerde (B) INS DNA. De gegevens worden weergegeven als afzonderlijke punten en de gemiddelde ± SEM. Statistieken werden geanalyseerd door een tweezijdig parametrische Studenten t-test. Klik hier om een grotere versie van thi bekijkens figuur.
| controls | T1D bij aanvang | |
| Leeftijd (jaren) | 10,3 ± 1,3 | 9.2 ± 1.0 |
| Vrouwelijk mannelijk | 1: 3 | 1: 3 |
| BMI Z-Score | 0.30 ± 0.9 | 0,74 ± 0,9 |
| HbA 1C (%) | 11,1 ± 0,6 | |
| C-peptide (pmol / L) | 285,5 ± 37,0 |
Tabel 1: Demografie van de controles en Personen met T1D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Methylering van cytosinen van DNA-methyltransferase maakt de epigenetische controle van transcriptie van veel genen. De INS-gen bij de mens is bijna uitsluitend tot expressie gebracht in eilandje β-cellen, en er lijkt een correlatie tussen de frequentie van methylering van cytosines in de INS gen silencing van de 11 transcriptie. Als zodanig, de meeste celtypen hebben substantieel hogere frequenties van methylatie van de INS-gen bij verschillende cytosines vergelijking met cellen P 11-13. Er is voorgesteld dat de prevalentie van β celdood kan worden gecontroleerd door analyse van de serumniveaus van celvrij INS ongemethyleerde DNA, die grotendeels sterven β cellen die hun DNA vrij te 12 zou ontstaan.
De reactie bisulfiet omgezet ongemethyleerde cytosinen in uracils, waardoor gemethyleerde cytosinen ongewijzigd 14. Sequencing of PCR-analyse of-bisulfiet omgezet DNA staat daarom vast te stellen of de oorspronkelijke cytosine was gemethyleerd of niet. Methylatie-specifieke PCR met behulp van dye-gebaseerde technologie maakt gebruik van verschillen in de PCR-efficiëntie ten gevolge van 3 'base-pair mismatch tussen primers en template, en daarmee maakt onderscheid van het niet-gemethyleerd vs. gemethyleerde cytosines volgende bisulfiet omzetting van DNA-15. Dienovereenkomstig dye-gebaseerde PCR werd gebruikt om de relatieve verhouding van ongemethyleerde tot gemethyleerd INS kwantificeren in vroege studies van type 1 onderwerpt 12,16. Echter, op kleurstof gebaseerde PCR-technologie heeft een aantal nadelen, waaronder beperkte specificiteit ontbreken van absolute kwantificering van DNA- fragment concentraties, en het onvermogen om multiplexen (dwz detecteren zowel gemethyleerd en gemethyleerd DNA soorten in dezelfde reactie). Andere groepen hebben directe sequentiebepaling van celvrij DNA-fragmenten, een techniek die controle mogelijk maakt van verschillende differentieel gemethyleerde CpG sites met zeer grote uitgevoerder specificiteit 9. De sequentie techniek vereist grote monstervolumes, is lastig om het gebruik van opgeslagen monsters en is duur.
Als gevolg van deze beperkingen, onze onderzoeksgroep en andere digitale PCR, een techniek die absolute kwantificering van DNA-fragmenten verschaft zijn toegepast, vereist slechts microliter hoeveelheden serum van vers of dwarshelling monsters vatbaar is voor multiplexen, toont grotere gevoeligheid dan de traditionele kwantitatieve PCR en is goedkoper dan directe sequentiebepaling. Digitale PCR-technologie omvat het gebruik van gebruikelijke primer / probe assays en microfluidics-gebaseerde afscherming van een water-in-olie PCR-reactie in ~ 20.000 druppeltjes. Na thermale cycli van het onderverdeelde reactie worden de druppeltjes vervolgens geanalyseerd met een stroomcytometer druppeltjes identificeren met positieve en negatieve signalen. Poisson statistieken wordt gebruikt om absolute hoeveelheden (aantal kopieën) van elke soort DNA te berekenen. De conceptuele dIJZE digitale PCR zijn elders 17 beschreven.
Dit protocol beschrijft de meting van β celdood bij de mens door meting differentieel gemethyleerd DNA door INS digitale PCR. De hier gepresenteerde gegevens en elders 6 tonen dat primer / probe combinatie die differentiële methylatie van cytosine gedetecteerd op positie -69 (ten opzichte van de transcriptionele startplaats van INS) vertonen voldoende specificiteit voor zowel de niet-gemethyleerde cytosine (FAM sonde) of gemethyleerde cytosine ( VIC sonde) (zie figuur 1 A en B). Mengsels van plasmiden die zowel gemethyleerd en gemethyleerd INS fragmenten op positie -69 bp (dwz bisulfiet geconverteerde DNA met ofwel uracil of cytosine op positie -69 bp) vertonen druppeltjes die één of ander plasmide of beide plasmiden (dubbel-positieve signalen figuur 1C). De Poisson statistische berekening maakt gebruik van the druppel nummers die positief zijn voor een bepaalde probe (of single-positief of double-positief) op de kopie aantallen van elk gemethyleerd of niet-gemethyleerd DNA-fragment af te leiden zijn.
Bij het gebruik humaan serum voor het meten van differentieel gemethyleerde cytosinen op positie -69 bp celvrij DNA (Figuur 3), onze gegevens tonen twee belangrijke kenmerken: (1) niveaus van gemethyleerde INS zijn 5-10-voudig hoger in deze vakken dan gemethyleerde INS (ongeacht diagnose), en (2) absolute niveaus van zowel ongemethyleerde en gemethyleerde INS hoger bij patiënten met nieuw ontstaan T1D vergelijking met controles. Dat de hogere niveaus van gemethyleerde INS opzichte ongemethyleerde INS waarschijnlijk weerspiegelen de grotere last celvrij DNA afkomstig van niet-β-cellen hogere niveaus van beide soorten INS in nieuw ontstaan T1D onderwerpen weerspiegelt waarschijnlijk beide een grotere voorkomende β celdood (niet-gemethyleerd INS) en mogelijk de dood / omzet van andere celtypen die zijn geassocieerd met de ziektetoestand (bv aangeboren en adaptieve immuuncellen). Verdere speculaties over de verhogingen van beide soorten van INS in new-onset T1D onderwerpen is eerder 6 besproken. Ongeacht de bron van beide soorten INS in serum van deze personen is het opvallend dat de meting van verhoudingen van ongemethyleerde aan gemethyleerde INS (gerapporteerd door andere onderzoekers gebruiken kleurstoffen gebaseerde PCR) zou niet pakte de aanzienlijke verschillen in absolute niveaus beschreven en in onze recente publicatie 6, waardoor de nadruk op de kracht van digitale PCR voor dergelijke biomarker analyse.
Een aantal voorzorgsmaatregelen en beperkingen dient te worden opgemerkt. Wij vinden het belangrijk dat bloed binnen 4 uur van verzameling verwerkt en ofwel direct gebruikt voor DNA isolatie of bewaard bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. In gepubliceerde studies, hebben we observed enig verlies van DNA herstel na 4 uur van verzameling, misschien als gevolg van DNA degradatie, zoals in studies van langdurige opslag van de monsters 18. Vanwege de verhoogde gevoeligheid van de digitale PCR, moet speciale zorg worden genomen om besmetting van de monsters die anders niet merkbaar in de traditionele qPCR zou zijn voorkomen. Ten slotte is een belangrijke beperking van de techniek is de analyse van monsters waarbij druppeltje generatie niet meer dan ~ 10.000 druppeltjes. Deze monsters leveren geen betrouwbare Poisson statistieken, en als zodanig kan worden beschouwd te interpreteren. Meerdere oorzaken van dergelijke lage druppel generatie kunnen zijn technische fouten in de steekproef van de behandeling, technische problemen met de druppel generator, of kwesties met betrekking tot de kwaliteit van de gebruikte reagentia.
Kortom, dit rapport beschrijft de gedetailleerd protocol voor het meten van differentieel gemethyleerde, celvrij INS DNA op positie -69 bp door digitale PCR. De hier beschreven protocol kan worden aangepast aan elkeDNA soorten waarvoor de detectie van differentieel gemethyleerde cytosines gewenst is, hetzij uit de circulatie of geïsoleerde cellen en weefsels, en kan geen absolute kwantificering van DNA-fragmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
