Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Måling af Differentielt Methyleret Published: December 21, 2016 doi: 10.3791/54838

Introduction

Type 1-diabetes (T1D) er en autoimmun sygdom, der er kendetegnet ved destruktionen af insulin-producerende holm β celler ved autoreaktive T-celler 1. Diagnosen T1D er typisk fremstillet ved måling af hyperglykæmi (blodglukose> 200 mg / dl) i et magert, ungt individ, som kan udgøre med ketoacidose som bevis for insulinmangel. På tidspunktet for diagnosen T1D, der er bevis for væsentligt tab af β-cellefunktion og masse (fra 50 - 90%) 2. I kliniske undersøgelser, flere immunmodulerende lægemidler, der blev anlagt på tidspunktet for diagnosen resulterede i stabiliseringen af ​​β-celle funktion (og formentlig masse), men ingen har resulteret i klinisk remission af sygdom, en konstatering af, at der er rejst krav om udvikling af biomarkører for tidligere opdagelse af sygdommen og for den langsgående sporing af effektiviteten af kombination terapier 3,4. Indsatsen af ​​internationale konsortier, sådaner den menneskelige Islet Research Network Consortium ved National Institutes of Heath 5, har understreget behovet for at udvikle biomarkører, der fokuserer på β celle stress og død i T1D.

I overensstemmelse med disse bestræbelser, har vores gruppe, og andre for nylig udviklet biomarkør assays, der måler cirkulerende, epigenetisk modificerede DNA-fragmenter, der opstår primært fra døende p-celler 6-9. I alle de offentliggjorte assays til dato, har der været fokus på kvantificering af det humane gen, der koder præproinsulin (INS), hvilket viser større grader af ikke-methylerede bindingssteder for CpG i de kodende og promotorområder i forhold til andre celletyper. Befrielsen af umethylerede INS DNA-fragmenter blev hypotese som opstår primært fra at dø (nekrotiske, apoptotiske) p-celler. Vores seneste undersøgelser viste, at i ungdommen, stigninger i både umethylerede og methylerede INS DNA ved position -69 bp (i forhold til than transskriptionsstartstedet) blev observeret i nye debut T1D, og sammen fungerede som specifikke biomarkører for denne population 6. Disse biomarkør assays involverer isoleringen af ​​cellefri DNA fra serum eller plasma under anvendelse af kommercielle spin-kits, efterfulgt af en omdannelse med bisulfit af det isolerede DNA (at konvertere ikke-methyleret cytosiner til uraciler, efterlader methylerede cytosiner intakt).

I denne rapport beskriver vi de tekniske aspekter af serum prøvetagning, isolering af celle-frit DNA fra serum, bisulfit konvertering og ydeevne dråbe digital PCR (herefter, digital PCR) for forskelligt methylerede INS DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

At fortolke data korrekt, bruger vi plasmid kontrol for både umethylerede og methylerede mål INS DNA i hver digital PCR-kørsel. Disse kontroller sikrer, at signaler svarende til methylerede og umethyleret DNA klart adskiller. Figur 1 viser de 2-D scatter plots svarende til dråber for plasmid kontroller indeholdende bisulfit omdannet umethyleret INS DNA (figur 1A), methyleret INS DNA (figur 1b), og en 1: 1 blanding af de to plasmider (fig 1C). Plasmid indeholdende umethylerede INS er angivet med dråberne positive for 6-carboxyfluorescein (FAM) signal, hvorimod plasmid, der indeholder methyleret INS er angivet med dråberne positive for VIC signal. I 1: plasmid-blanding 1, er en population af dobbelt-positive dråber set, svarende til dråber, der indeholder begge arter afDNA. For at skelne positive dråber fra negative dråber, er data gated ved hjælp af disse 2-D plots. Bemærk, at i figur 1A, er der en lille forskydning af de FAM-positive smådråber ind i VIC kanal, hvilket indikerer, at probe for den methylerede INS DNA udviser nogen krydsreaktivitet for umethyleret INS DNA. Tilsvarende i figur 1 B, er der en meget lille forskydning af VIC-positive dråber i FAM-kanalen, hvilket indikerer krydsreaktivitet af sonden for methyleret DNA med methyleret DNA. En væsentlig fordel ved digital PCR er det kan stadig diskriminere specifikke signaler selv når prober er ikke 100% nøjagtig. For passende Poisson statistiske beregninger af softwaren, skal hver PCR-reaktion fordeles i mindst 10.000 samlede dråber, vise en klynge af negative dråber, og viser en tydelig amplitude forskel mellem negative og positive dråber (for pålidelig gating). For at demonstrere linearitet af vores primere, vi serformed blandinger af de to plasmider på tværs af flere størrelsesordener. Som vist i figur 2, kan lineært detekteres varierende koncentrationer af et plasmid i nærværelse af en konstant mængde af det andet plasmid. For nye laboratorier udfører denne procedure, anbefaler vi at konstruere en lignende blanding eksperiment for at sikre, at analysen fungerer i en lineær detektering mode.

Dernæst vi opnåede serum af tre fag med nye debut T1D (inden for 2 dage efter diagnosen) og tre kontrol individer uden T1D (se tabel 1 for kliniske karakteristika). Protokoller blev godkendt af Indiana University Board Institutional Review. Forældre til emner, der er fastsat skriftligt informeret samtykke. Figur 3 viser kvantificering af umethylerede og methylerede INS DNA kopiere numre / pi serum, omregnet til at logge 10 fra disse kontroller og T1D fag. Dataene viser, at i ndividuals med T1D udviser forhøjede niveauer af både methylerede og umethyleret INS DNA sammenlignet med kontroller, svarende til data, der tidligere 6 rapporteret.

figur 1
Figur 1: Repræsentative 2-D Plots af plasmid Controls. Plasmid standarder blev genereret ved at klone fragmenter af bisulfit omdannet INS DNA huser methyleret eller methyleret cytosin i position -69 bp i forhold til INS transskriptionsstartstedet. Vist er 2-D plots anvendelse af plasmid indeholdende methyleret (A) og methylerede (B) INS-DNA og for en 1: 1 blanding af de to plasmider (C). Pile identificerer umethylerede, methylerede og ikke-methylerede + methyleret (dobbeltklikke positiv) INS-DNA-indeholdende dråber. FAM = Mål 1; VIC = Mål 2.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Kvantificering af DNA-mål ved hjælp Kontrol Plasmid Blandinger. Plasmid standarder indeholdende klonede fragmenter af bisulfit omdannet INS DNA huser methyleret eller methyleret cytosin i position -69 bp i forhold til INS transskriptionsstartstedet blev blandet ved de forskellige kombinationer vist, derefter udsat for multiplex digital PCR. Figuren viser kvantificering af mål DNA-fragmenter, der præsenteres som kopier / pi; R2 = 0,989 for umethyleret INS DNA og R2 = 0,998 for methyleret INS DNA. Klik her for atse en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Cirkulerende methyleret og methyleret INS DNA-niveauer i Controls og Emner med T1D. Serumprøver blev indsamlet fra fire unge med nyopdaget T1D og fra 4 sygdomsfri, uafhængige kontrol, derefter bearbejdet til måling af forskelligt methyleres INS DNA ved digital PCR. Vist er resultaterne af digitale PCR assays for umethyleret (A) og methylerede (B) INS-DNA. Data vises som individuelle punkter og middelværdi ± SEM. Statistik blev analyseret ved en to-halet parametriske Students t-test. Klik her for at se en større version af this figur.

Controls T1D ved debut
Alder (år) 10,3 ± 1,3 9,2 ± 1,0
Kvinde mand 1: 3 1: 3
BMI Z-Score 0,30 ± 0,9 0,74 ± 0,9
HbA 1C (%) 11,1 ± 0,6
C-peptid (pmol / L) 285,5 ± 37,0

Tabel 1: demografi Knapper og Patienter med T1D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Methylering af cytosiner ved DNA methyltransferaser muliggør den epigenetiske kontrol af transkription i mange gener. INS-genet hos mennesker næsten udelukkende udtrykkes i islet β celler, og der synes at være en sammenhæng mellem frekvensen af methylering af cytosiner i INS genet til silencing af dens transkription 11. Som sådan fleste celletyper viser væsentligt højere frekvenser af methylering af INS-genet på forskellige cytosiner i forhold til p-celler 11-13. Det er blevet foreslået, at forekomsten af β celledød kunne overvåges ved analyse af serumniveauerne af cellefri umethyleret INS DNA, hvilket ville opstå stort set fra døende p-celler som frigør deres DNA 12.

Bisulfitreaktionen omdanner ikke-methylerede cytosiner i uraciler, efterlader methylerede cytosiner uændrede 14. Sekventering eller PCR-analyse of bisulfit-konverterede DNA tillader derfor afgørelsen af, om den oprindelige cytosin var methyleret eller ej. Methylering-specifik PCR ved hjælp dye-baseret teknologi udnytter forskelle i PCR effektivitet på grund af 3 'basis-pair misforhold mellem primere og skabelon, og derved tillader skelnen af umethyleret vs. methylerede cytosiner efter bisulfit konvertering af DNA 15. Følgelig blev farvestof-baserede PCR anvendt til at kvantificere det relative forhold mellem ikke-methyleret til methyleret INS i tidlige studier af T1D emner 12,16. Imidlertid farvestofbaserede PCR-teknologi har flere ulemper, herunder begrænset specificitet, mangel på absolut kvantificering af DNA-fragment koncentrationer, og den manglende evne til at multiplekse (dvs. detektere både methylerede og ikke-methylerede DNA-species i den samme reaktion). Andre grupper har udført direkte sekventering af cellefrie DNA-fragmenter, en teknik der tillader overvågning af flere differentielt methylerede CpG sites med meget storis specificitet 9. Men sekventering teknik kræver, store prøvevolumener, er ikke let modtagelig for brug af opsparede prøver, og er dyre.

Som et resultat af disse begrænsninger, vores gruppe og andre har ansat digital PCR, en teknik, der giver absolut kvantificering af DNA-fragmenter, kræver kun mikroliter mængder serum fra friske eller opsparede prøver, er modtagelig for multipleksing, viser større følsomhed end traditionel kvantitativ PCR , og er billigere end direkte sekventering. Digital PCR-teknologi involverer anvendelse af konventionelle primer / probe-assays og en mikrofluidik-baserede opdeling af en vand-i-olie PCR-reaktion i ~ 20.000 dråber. Efter termisk cykling af det inddelte reaktion, er dråberne efterfølgende analyseret ved et flowcytometer til at identificere små dråber med positive og negative signaler. Poisson statistik bruges til at beregne absolutte mængder (kopi numre) af hver DNA-arter. Den konceptuelle details af digital PCR er blevet beskrevet andetsteds 17.

Denne protokol beskriver måling af β celledød hos mennesker ved at måle differentielt methyleret INS DNA ved digital PCR. Vores data præsenteres her og andetsteds 6 viser, at primer / probe-kombinationer, der registrerer forskellen methylering af cytosin i position -69 (relativt til det transkriptionelle startsted af INS) udviser tilstrækkelig specificitet for enten methyleret cytosin (FAM probe) eller den methylerede cytosin ( VIC probe) (se figur 1A og B). Blandinger af plasmider indeholdende både methylerede og ikke-methylerede INS-fragmenter ved position -69 bp (dvs. bisulfit omdannet DNA med enten uracil eller cytosin i position -69 bp) udviser dråber indeholdende det ene eller det andet plasmid, eller begge plasmider (dobbelt-positive signaler i figur 1C). Den Poisson statistisk beregning udnytter the droplet tal, der er positive for en given probe (enten enkelt-positive eller dobbelt-positiv) til at udlede kopiantal af hver methyleret eller ikke-methyleret DNA-fragment.

Når du bruger humant serum til måling af forskelligt methylerede cytosiner ved position -69 bp i celle-fri DNA (figur 3), vores data viser to vigtige funktioner: (1) niveauer af denatureret INS er 5-10 gange højere i disse fag end umethyleret INS (uanset diagnose), og (2) det absolutte niveauer af både methyleret og methyleret INS er højere hos personer med nyopdaget T1D sammenlignet med kontroller. Ud fra følgende betragtninger højere niveauer af denatureret INS sammenlignet med umethyleret INS sandsynligvis afspejler større byrde af celle-fri DNA stammer fra ikke-p-celler, de højere niveauer af begge arter af INS i nye debuterende T1D fag sandsynligvis afspejler både en stigning i udbredt β celledød (methyleret INS), og muligvis død / omsætning af andre celletyper, der er forbundet med sygdomstilstanden (f.eks medfødte og adaptive immunceller). Yderligere spekulation på stigninger i begge arter af INS i nye debuterende T1D emner blev drøftet tidligere 6. Uanset kilderne til begge arter af INS i serum fra disse individer, er det bemærkelsesværdigt, at måling af forhold mellem umethyleret til methyleret INS (som rapporteret af andre forskere bruger farvestofbaseret PCR) ville ikke har plukket op de betydelige forskelle i absolutte niveauer beskrevet her og i vores seneste publikation 6, hvilket understreger styrken i digital PCR for denne type biomarkør analyse.

Nogle forholdsregler og begrænsninger bør bemærkes. Vi føler, at det er vigtigt, at blod er behandlet inden 4 timer for indsamling og enten anvendes straks til DNA isolering eller opbevares ved -80 ºC til fremtidig brug. I upublicerede studier, har vi observed vist tab af DNA bedring efter 4 timers for indsamling, måske på grund af DNA-nedbrydning, som det ses i undersøgelser af langtidsopbevaring af prøver 18. På grund af den øgede følsomhed af digital PCR, bør der udvises særlig forsigtighed for at undgå forurening af prøver, der ellers ikke ville være mærkbar i traditionel qPCR. Endelig en vigtig begrænsning af teknikken er analysen af ​​prøver, hvor generation dråbe ikke overstiger ~ 10.000 dråber. Sådanne prøver giver ikke pålidelige Poisson statistikker, og som sådan kan betragtes som tolke. Flere årsager til denne generation lav dråbe kan indeholde tekniske fejl i prøvehåndtering, tekniske problemer med dråben generator, eller spørgsmål vedrørende kvaliteten af ​​reagenser.

Sammenfattende beskriver denne rapport detaljeret protokol til måling af differentielt methylerede, celle-fri INS DNA ved position -69 bp ved digital PCR. Den her beskrevne protokol kan tilpasses enhverDNA-species der ønskes påvisning af differentielt methylerede cytosiner, også fra cirkulation eller fra isolerede celler og væv, og kan give absolutte kvantificering af DNA-fragmenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Red Top Vacutainer  Beckon Dickinson 366441 no additive, uncoated interior, 10 ml
Cryovial Tube Simport T310-3A polypropylene, screw cap tube, any size
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51106
Poly(A) Sigma P9403 disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl 
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
DPBS (with CaCl2 and MgCl2) Sigma D8662
0.2 ml PCR 8-strip Tubes MidSci AVST
8-strip Caps, Dome MidSci AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo D5031
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Biorad 1863024
Buffer Control for Probes Biorad 1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix Life Technologies AH21BH1
EcoR1 New England Biolabs R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted Eppendorf 951020346
Pierceable Foil Heat Seal Biorad 1814040
PX1 PCR Plate Sealer Biorad 1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System Biorad 1864101
Automated Droplet Generation Oil for Probes Biorad 186-4110
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator Biorad 186-4108
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Biorad 186-4120
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator Biorad 186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler Biorad 1851197
QX200 Droplet Reader Biorad 186-4003
ddPCR Droplet Reader Oil Biorad 186-3004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

Tags

Genetik Biomarkør Islet Diabetes Insulin Digital PCR Epigenetik
Måling af Differentielt Methyleret<em&gt; INS</em&gt; DNA Arter i humane serumprøver som biomarkør for Islet β Cell Død
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tersey, S. A., Nelson, J. B.,More

Tersey, S. A., Nelson, J. B., Fisher, M. M., Mirmira, R. G. Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet β Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54838, doi:10.3791/54838 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter