Introduction
Type 1 diabetes (T1D) er en autoimmun sykdom som kjennetegnes av ødeleggelsen av insulin-produserende holmen β celler av autoreaktive T-celler 1. Diagnosen T1D er vanligvis laget ved måling av hyperglykemi (blodsukker> 200 mg / dl) i en tynn, ung person, som kan presentere seg med ketoacidose som bevis på insulinmangel. På tidspunktet for diagnose av T1D, er det bevis for betydelig tap av β cellefunksjon og masse (50-90%) 2. I kliniske studier, flere immunmodulerende legemidler som ble innstiftet ved diagnosetidspunktet resulterte i stabiliseringen av β-celle funksjon (og antagelig masse), men ingen har resultert i klinisk remisjon av sykdommen, et funn som har hevet call for utvikling av biomarkører for tidligere påvisning av sykdommen og for langsgående sporing av effektiviteten av kombinasjonsterapier 3,4. Arbeidet med internasjonale konsortier, sliks Human Islet Research Network Consortium ved National Institutes of Heath 5, har understreket behovet for å utvikle biomarkører som fokuserer på β-celle stress og død i T1D.
I tråd med dette arbeidet, har vår gruppe og andre nylig utviklet biomarkør analyser som måler sirkulerende, epigenetiske modifiserte DNA-fragmenter som oppstår i hovedsak fra å dø betacellene 6-9. I alle de publiserte analyser til dags dato, har fokuset vært på kvantifisering av det menneskelige genet som koder preproinsulin (INS), som viser større grad av unmethylated CpG steder i kodingen og promoter regioner sammenlignet med andre celletyper. Frigjøringen av unmethylated INS DNA-fragmenter ble antatt som oppstår i hovedsak fra å dø (nekrotiske, apoptotiske) betaceller. Våre nyere studier viser at i ungdommen, økninger i både unmethylated og denaturert INS DNA ved posisjon -69 bp (i forhold til than Transkripsjonell starte stedet) ble observert i nyoppstått T1D, og sammen tjente som spesifikke biomarkører for denne populasjonen 6. Disse biomarkør analyser involverer isolering av celle-fri DNA fra serum eller plasma ved hjelp av kommersielle kits ring, etterfulgt av en bisulfitt omdannelse av det isolerte DNA (for å omdanne ikke-denaturert cytosines til uraciler, forlater denaturert cytosines intakt).
I denne rapporten beskriver vi de tekniske aspektene av serumprøve samling, isolering av celle-fri DNA fra serum, bisulfitt konvertering, og resultatene av dråpe digital PCR (heretter, digital PCR) for forskjellig metylert INS DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å tolke data på riktig måte, bruker vi plasmid kontroller for både unmethylated og denaturert mål INS DNA i hver digital PCR-kjøring. Disse kontrollene sikre at signaler som tilsvarer metylert og unmethylated DNA skiller seg klart. Figur 1 viser 2-D-spredningsdiagrammer svarende til dråper for plasmid kontroller inneholdende bisulfitt-omdannet unmethylated INS-DNA (figur 1A), metanoldenaturert INS-DNA (figur 1B), og en 1: 1 blanding av de to plasmider (figur 1C). Plasmid inneholdende unmethylated INS indikeres av dråpene positive for den 6-karboksyfluorescein (FAM) signal, mens plasmid som inneholder metylert INS indikeres av dråpene som var positive for den VIC signal. I 1: 1 plasmid blanding, blir en populasjon av dobbel-positive dråper sett, svarende til dråper som inneholder begge arter avDNA. For å skille positive dråper fra negative dråper, blir data inngjerdet ved hjelp av disse 2-D plott. Merk at i figur 1 A, er det en svak forskyvning av de FAM-positive dråper inn i VIC-kanalen, noe som indikerer at sonden for det metylerte INS DNA oppviser noen kryssreaktivitet for unmethylated INS DNA. Tilsvarende, i figur 1B, er det en meget svak forskyvning av de VIC-positive dråper i FAM-kanalen, noe som indikerer kryss-reaktivitet av sonden for unmethylated DNA med denaturert DNA. En stor fordel med digital PCR er det fortsatt kan diskriminere bestemte signaler selv når probene er ikke 100% bestemt. For riktige Poisson statistiske beregninger av programvaren, bør hver PCR reaksjon fordele seg i minst 10.000 totalt dråper, viser en klynge av negative dråper, og viser en klar amplitude forskjell mellom negative og positive dråper (for pålitelig gating). For å demonstrere linearitet av våre primere, vi performed blandinger av de to plasmider over flere størrelsesordener. Som vist i figur 2, kan varierende konsentrasjoner av en plasmid være lineært detektert i nærvær av en konstant mengde av det andre plasmidet. For nye laboratorier utfører denne prosedyren, anbefaler vi å bygge en lignende blanding eksperiment for å sikre at analysen opererer i en lineær deteksjon mote.
Deretter fikk vi serum av tre pasienter med nyoppstått T1D (innen 2 dager etter diagnose) og tre kontrollpersoner uten T1D (se tabell 1 for kliniske karakteristika). Protokoller ble godkjent av Indiana University Institutional Review Board. Foreldre av fagene gitt skriftlig informert samtykke. Figur 3 viser kvantifisering av unmethylated og metylert INS DNA kopiere numre / mL serum, konvertert til log 10 fra disse kontrollene og T1D fag. Dataene viser at jeg ndividuals med T1D oppviser forhøyede nivåer av både denaturert og unmethylated INS-DNA sammenlignet med kontroller, tilsvarende data som er rapportert tidligere 6.
Figur 1: Representative 2-D Tomter av Plasmid kontroller. Plasmid standarder ble generert ved kloning fragmenter av sulfitt-konvertert INS DNA husing unmethylated eller denaturert cytosin i posisjon -69 bp forhold til INS transcriptional starte nettstedet. Vist er to-D-plottene ved hjelp av plasmid inneholdende unmethylated (A) og metanoldenaturert (B) INS-DNA og for en 1: 1 blanding av de to plasmider (C). Piler identifisere unmethylated, denaturert, og unmethylated + metylert (dobbelt-positive) INS DNA-holdige dråper. FAM = Target 1; VIC = Target 2.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvantifisering av DNA-mål ved hjelp av kontroll Plasmid blandinger. Plasmid standarder som inneholder klonede fragmenter av sulfitt-konvertert INS DNA husing unmethylated eller denaturert cytosin i posisjon -69 bp forhold til INS transcriptional starte nettstedet ble blandet på de ulike kombinasjonene som blir vist, og deretter utsatt for multipleks digital PCR. Figuren viser mengdebestemmelse av mål-DNA-fragmenter, presentert som kopier / ul; r 2 = 0,989 for unmethylated INS DNA og r 2 = 0,998 for denaturert INS DNA. Klikk her for åse en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Circulating Unmethylated og denaturert INS DNA nivåer i Knapper og fag med T1D. Serumprøver ble samlet inn fra fire ungdommer med nyoppstått T1D og fra 4 sykdomsfrie, ubeslektede kontroller, deretter bearbeidet for måling av differensielt denaturert INS DNA ved digital PCR. Vist er et resultat av digitale PCR-analyser for unmethylated (A) og metanoldenaturert (B) INS DNA. Data vises som individuelle poeng og gjennomsnitt ± SEM. Statistikk ble analysert ved en to-tailed para Studenter t-test. Klikk her for å se en større versjon av this figuren.
| Controls | T1D ved utbruddet | |
| Alder (år) | 10,3 ± 1,3 | 9.2 ± 1.0 |
| Kvinne mann | 1: 3 | 1: 3 |
| BMI Z-Score | 0,30 ± 0,9 | 0,74 ± 0,9 |
| HbA 1C (%) | 11,1 ± 0,6 | |
| C-peptid (pmol / L) | 285,5 ± 37,0 |
Tabell 1: Demografi av kontroller og Individer med T1D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metylering av cytosines av DNA metyltransferaser tillater epigenetisk kontroll av transkripsjon på mange gener. INS-genet hos mennesker er nesten utelukkende uttrykt i holmen β-celler, og det synes å være en sammenheng mellom frekvensen av metylering av cytosines i INS-genet til lyddemping av dens transkripsjon 11. Som sådan er de fleste celletyper viser vesentlig høyere frekvenser av metylering av INS-genet ved forskjellige cytosines i forhold til p-celler 11 - 13. Det er blitt foreslått at utbredelsen av β celledød kan overvåkes ved analyse av serumnivåene av cellefritt unmethylated INS DNA, noe som ville oppstå i stor grad fra å dø p-celler som frigjør deres DNA 12.
Den bisulfite reaksjonen omdanner unmethylated cytosines inn uraciler, forlater denaturert cytosines uendret 14. Sekvense eller PCR-analyse of bisulfitt-omdannet DNA tillater derfor bestemmelse av hvorvidt den opprinnelige cytosin var denaturert eller ikke. Metylering spesifikke PCR bruker dye-basert teknologi utnytter forskjeller i PCR effektivitet på grunn av tre 'base-pair mismatch mellom grunning og mal, og dermed gjør det mulig forskjellsbehandling av unmethylated vs. denaturert cytosines følgende bisulfite konvertering av DNA 15. Følgelig ble fargestoffbasert PCR anvendt for å kvantifisere det relative forholdet mellom unmethylated til metylert INS i tidlige studier av T1D fag 12,16. Imidlertid har fargestoffbasert PCR-teknologi flere ulemper, blant annet begrenset spesifisitet, mangel på absolutt mengdebestemmelse av DNA-fragmentkonsentrasjonen, og den manglende evne til å multiplekse (dvs. påvise både denaturert og unmethylated DNA-arter i samme reaksjon). Andre grupper har utført direkte sekvensering av celle-fri DNA-fragmenter, er en teknikk som gjør det mulig for overvåking av flere differensielt metylerte CpG områder med mye storer spesifisitet 9. Imidlertid krever sekvense teknikk store prøvevolumer, er ikke lett mottakelig for bruk av banked prøver, og er dyrt.
Som et resultat av disse begrensninger, vår gruppe og andre har anvendt digital-PCR, en teknikk som gir absolutt mengdebestemmelse av DNA-fragmenter, krever bare mikrolitermengder av serum fra friske eller doserte prøver, er mottagelig for multipleksing viser større sensitivitet enn tradisjonelle kvantitativ PCR , og er mindre kostbart enn direkte sekvensering. Digital PCR teknologi innebærer bruk av konvensjonelle primer / probe assays og en MicroFluidics basert partisjonering av en vann-i-olje-PCR-reaksjon til ~ 20.000 dråper. Etter termiske sykluser av den partisjonert reaksjonen, blir dråpene deretter analysert med et strømningscytometer for å identifisere små dråper med positive og negative signaler. Poisson statistikk brukes til å beregne absolutte mengder (kopitall) av hver DNA-arter. Den konseptuelle details av digital PCR har blitt beskrevet andre steder 17.
Denne protokollen beskriver måling av β celledød hos mennesker ved å måle differensielt metylert INS-DNA ved hjelp av digital PCR. Våre data presentert her og andre steder 6 viser at primer / probe-kombinasjoner som gjenkjenner differensial metylering av cytosin i posisjon -69 (relativt til transkripsjonsstartsetet av INS) oppviser tilstrekkelig spesifisitet for enten unmethylated cytosin (FAM sonde) eller det metylerte cytosin ( VIC-probe) (se figur 1A og B). Blandinger av plasmider som inneholder både denaturert og unmethylated INS-fragmenter ved posisjon -69 bp (dvs. bisulfitt-omdannet DNA med enten uracil eller cytosin i posisjon -69 bp) oppviser dråper som inneholder den ene eller den andre plasmid, eller begge plasmider (dobbel-positive signaler i figur 1C). Den Poisson statistisk beregning benytter the dråpe tall som er positive for en gitt sonde (enten single-positive eller dobbel-positive) for å utlede kopiantall av hvert denaturert eller unmethylated DNA fragment.
Når utnytte menneskelig serum for måling av differensielt denaturert cytosines i posisjon -69 bp i celle-fritt DNA (figur 3), våre data viser to viktige funksjoner: (1) nivåer av denaturert INS er 5-10 ganger høyere i disse fagene enn unmethylated INS (uavhengig av diagnose), og (2) absolutte nivåer av både unmethylated og denaturert INS er høyere hos pasienter med nyoppstått T1D sammenlignet med kontroller. Mens høyere nivåer av denaturert INS forhold til unmethylated INS sannsynlig gjenspeiler større byrden av celle-fri DNA som kommer fra ikke-beta-celler, høyere nivåer av begge arter av INS i nyoppstått T1D fagene gjenspeiler trolig både en økning i utbredt β celledød (unmethylated INS), og muligens død / omsetning av andre celletyper som er forbundet med sykdomstilstanden (f.eks medfødte og ervervede immunceller). Videre spekulasjoner om økning av begge arter av INS i nyoppstått T1D fagene ble diskutert tidligere seks. Uavhengig av kildene i begge arter av INS i serum fra disse individene, er det bemerkelsesverdig at måling av forhold mellom unmethylated til denaturert INS (som rapportert av andre forskere hjelp av fargestoffbasert PCR) ville ikke ha plukket opp av den store forskjellen i absolutte nivåene beskrevet her og i vår siste utgivelse 6, og dermed understreker kraften i digital PCR for denne type biomarkør analyse.
Noen forholdsregler og begrensninger bør bemerkes. Vi føler det er viktig at blodet blir behandlet innen 4 timer fra samlingen og enten brukes umiddelbart etter DNA isolasjon eller oppbevart ved -80 ºC for fremtidig bruk. I upubliserte studier, har vi observed noe tap av DNA bedring etter 4 timer på samlingen, kanskje på grunn av DNA nedbrytning, som sett i studier av langtidslagring av prøver 18. På grunn av økt følsomhet for digital PCR, bør man være spesielt forsiktig for å unngå forurensning av prøvene som ellers ikke ville være merkbar i tradisjonell qPCR. Til slutt, en nøkkel begrensning av teknikken er analysen av prøver hvor dråpe generasjon ikke overstiger ~ 10.000 dråper. Slike prøver ikke gir pålitelig Poisson statistikk, og kan derfor betraktes som uninterpretable. Flere årsaker til en slik lav dråpe generasjon kan inneholde tekniske feil i prøvehåndtering, tekniske problemer med dråpegeneratoren, eller spørsmål knyttet til kvaliteten på reagenser som brukes.
Oppsummert beskriver denne rapporten detaljert protokoll for måling av forskjellig metylert, cellefritt INS DNA i posisjon -69 bp av digital PCR. Protokollen er beskrevet her kan tilpasses til en hvilken som helstDNA art hvor påvisning av differensielt denaturert cytosines er ønskelig, enten fra sirkulasjon eller fra isolerte celler og vev, og kan gi absolutt mengdebestemmelse av DNA-fragmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
