Introduction
Сахарный диабет 1 типа (СД1) является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется разрушением инсулин-продуцирующих бета - клеток островка с помощью аутореактивных Т - клеток 1. Диагноз СД1, как правило, производится при измерении (глюкозы в крови> 200 мг / дл) гипергликемия в обедненной, молодого человека, который мог бы представить с кетоацидозом как свидетельство дефицита инсулина. На момент постановки диагноза СД1, имеются данные о существенной потере функции β клеток и массы (от 50 - 90%) 2. В клинических исследованиях, несколько иммунных модулирующих препаратов, которые были возбуждены в момент постановки диагноза привело к стабилизации функции β клеток (и, предположительно массы), но ни привели к клинической ремиссии заболевания, один важный вывод, поднял призыв к развитию биомаркеров для ранней диагностики заболевания и для продольного отслеживания эффективности комбинированной терапии 3,4. Усилия международных консорциумов, такаяS Человек Островок Исследовательская сеть Консорциума в национальных институтах Heath 5, подчеркнули необходимость разработки биомаркеров , которые сосредоточены на бета стресса и гибели клеток в СД1.
В соответствии с этими усилиями, наша группа и другие недавно разработали биомаркеров анализы на котором эта мера циркуляционные, эпигенетически модифицированные фрагменты ДНК , которые возникают в основном из умирающих -клеток 6 - 9. Во всех опубликованных анализов на сегодняшний день, внимание было сосредоточено на количественному кодирующего гена препроинсулин человека (INS), который демонстрирует большую степень неметилированных сайтов CpG в кодировании и промоторной области по сравнению с другими типами клеток. Освобождение неметилированных фрагментов ДНК ИНС была выдвинута гипотеза , как возникающие главным образом от смерти (некротические, апоптозе) -клеток. Наши недавние исследования показали , что в молодости, возвышенностей в обоих неметилированной и метилированной ДНК INS в положении -69 б.п. ( по отношению к тон сайт начала транскрипции) наблюдались в впервые выявленного СД1, и вместе служили в качестве специфических биомаркеров для этой группы населения 6. Эти биомаркеры анализы включают изоляцию бесклеточной ДНК из сыворотки или плазмы с использованием коммерческих наборов спин, с последующим превращением бисульфита выделенной ДНК (чтобы преобразовать без метилируется цитозина в урацила, оставляя метилированных цитозина нетронутыми).
В этом докладе мы опишем технические аспекты сбора образцов сыворотки, выделения бесклеточной ДНК из сыворотки, бисульфита преобразования, и производительность капельным цифровой ПЦР (далее, цифровой ПЦР) для дифференциально метилированной INS ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы интерпретировать данные надлежащим образом , мы используем плазмиды управления для обоих неметилированной и денатурированного ДНК - мишени INS в каждом цифровом PCR перспективе. Эти элементы управления убедитесь, что сигналы, соответствующие денатурированного и неметилированной ДНК четко различимы. На рисунке 1 показаны диаграммы рассеяния 2-D , соответствующие капель плазмиды управления , содержащих бисульфит преобразованного неметилированную СИН ДНК (Фигура 1А), метиловым INS ДНК (Фигура 1В), и смесь 1: 1 из двух плазмид (фиг.1С). Плазмида , содержащая неметилированную INS обозначается капельками положительным для сигнала 6-карбоксифлуоресцеин (FAM), в то время как содержащий плазмиду , содержащую метилированный СИН обозначается капельками положительным для сигнала VIC. В 1: плазмидной смеси 1, популяция двойных положительных капель видно, что соответствует капель, содержащих оба видаДНК. Чтобы отличить положительные капли от отрицательных капель, данные закрытого типа с использованием этих 2-D графики. Обратите внимание , что на рисунке 1А, наблюдается небольшое смещение FAM-положительных капель в канал VIC, указывая , что зонд для метилированного INS ДНК проявляет некоторую перекрестную реактивность для неметилированной INS ДНК. Аналогичным образом , на фигуре 1В, существует очень небольшое смещение ИКС-положительных капель в канал FAM, что указывает на перекрестную реактивность зонда для неметилированной ДНК с метилированной ДНК. Основным преимуществом цифровой ПЦР он все еще может различить специфические сигналы, даже если зонды не являются 100% специфичностью. Для получения соответствующих Пуассона статистических расчетов с помощью программного обеспечения, каждая реакция ПЦР должна распределяться по меньшей мере 10000 полных капель, отображать скопление отрицательных капель, и показывают четкую разницу амплитуд между отрицательными и положительными капель (для надежного стробирования). Для демонстрации линейности наших праймеров, мы рerformed смеси двух плазмид через несколько порядков. Как показано на фиг.2, различные концентрации одной плазмиды могут быть линейно обнаружены в присутствии постоянного количества второй плазмиды. Для новых лабораторий для выполнения этой процедуры, мы рекомендуем построить подобный эксперимент смесь, чтобы гарантировать, что анализ работает в линейном режиме обнаружения.
Затем мы получили сыворотку из трех пациентов с впервые выявленным СД1 ( в течение 2 -х дней с момента постановки диагноза) и трех лиц управления без СД1 (см таблицу 1 для клинических признаков). Протоколы были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Индианы. Родители испытуемых дали письменное информированное согласие. На рисунке 3 показана количественная оценка неметилированным и метилированной ДНК INS число копий / мкл сыворотки, преобразованное в log 10 из этих элементов управления и предметов СД1. Данные показывают, что I ndividuals с СД1 наблюдаются повышенные уровни как денатурированного и неметилированной INS ДНК по сравнению с контрольной группой , аналогичные данным , полученным ранее 6.
Рисунок 1: Представитель 2-D участки плазмидной Controls. Стандарты плазмид были получены путем клонирования фрагментов бисульфит-конвертированы INS ДНК укрывает неметилированной или метилированного цитозина в положении -69 б.п. по отношению к ИНС сайт начала транскрипции. Показаны 2-D графики с использованием плазмиды , содержащие неметилированную (А) и метилированных (В) СИН ДНК и в течение 1: 1 смесь двух плазмид (С). Стрелки идентифицировать неметилированную, денатурат и неметилированную + метилированный (дважды положительный) INS ДНК-содержащие капельки. FAM = Задача 1; ВИК = Задача 2.исх = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Количественный мишеней ДНК с использованием управления плазмид смесей. Стандарты плазмида , содержащая клонированных фрагментов бисульфит-конвертированы СИН ДНК укрывает неметилированной или метилированных цитозина в положении -69 п.о. по отношению к ИКС сайт начала транскрипции , были смешаны в различных комбинациях , показанных, а затем подвергали мультиплекс цифровой ПЦР. На рисунке показано количественное определение фрагментов ДНК-мишени, представленных в виде копий / мкл; R 2 = 0,989 для неметилированной INS ДНК и R 2 = 0,998 для денатурированного INS ДНК. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобыпросмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Циркуляционный неметилированным и метилированный INS ДНК уровней в органах управления и субъектов с СД1. Образцы сыворотки были собраны из 4 молодых людей с впервые выявленным СД1 и от 4 - незараженных, не связанных между собой элементов управления, а затем обрабатываются для измерения дифференциально метилированной ДНК INS цифровой ПЦР. Показаны результаты цифровых ПЦР - анализов для неметилированной (А) и метилированных (В) INS ДНК. Данные отображаются в виде отдельных точек и среднее значение ± SEM. Статистика анализировали с помощью двухвостый параметрические Students т испытание. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию Тхис фигурой.
| управления | СД1 при наступлении | |
| Возраст (лет) | 10,3 ± 1,3 | 9,2 ± 1,0 |
| Женщина мужчина | 1: 3 | 1: 3 |
| ИМТ Z-счет | 0,30 ± 0,9 | 0,74 ± 0,9 |
| HbA 1C (%) | 11,1 ± 0,6 | |
| С-пептида (пмоль / л) | 285,5 ± 37,0 |
Таблица 1: Демографические управления и субъектов с СД1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метилирование цитозина по метилтрансферазам ДНК позволяет эпигенетического контроля транскрипции у многих генов. Ген INS у человека почти исключительно выражается в островок бета клеток, и, как представляется, корреляция между частотой метилирования цитозина в гене INS , чтобы заставить замолчать его транскрипции 11. Таким образом , большинство типов клеток показывают значительно более высокие частоты метилирования гена INS при различных цитозина по сравнению с бета - клеток 11 - 13. Было высказано предположение , что распространенность бета гибели клеток можно контролировать с помощью анализа сывороточных уровней бесклеточной неметилированной INS ДНК, которые возникли бы в значительной степени от гибели бета - клеток, выделяющих их ДНК 12.
Бисульфит реакция преобразует неметилированные цитозина в урацила, оставляя метилированных цитозина без изменений 14. Секвенирование или ПЦР-анализ оПоэтому F бисульфит преобразованного ДНК позволяет определить, был ли исходный цитозин метилированной или нет. Метилирование-специфической ПЦР с использованием технологии на основе красителя использует различия в эффективности ПЦР вследствие 3 'пар оснований несоответствию праймеров и матрицы, и тем самым позволяет различие неметилированным против метилированных цитозина следующий бисульфита преобразование ДНК 15. Соответственно, на основе красителя ПЦР использовали для количественной оценки относительного соотношения неметилированная к метилированной ИНС в ранних исследованиях СД1 субъектов 12,16. Тем не менее, на основе красителя технологии ПЦР имеет ряд недостатков, в том числе ограниченную специфичность, отсутствие абсолютного количественного концентраций фрагментов ДНК, а также неспособность мультиплексировать (т.е. обнаруживать как метилированных и неметилированные видов ДНК в той же реакции). Другие группы проводили прямое секвенирование фрагментов ДНК бесклеточных, технику, которая позволяет осуществлять мониторинг нескольких дифференциально метилированных сайтов CpG с гораздо большаяэр специфичность 9. Тем не менее, метод секвенирования требует больших объемов образцов, не легко поддаются использованию насыпным образцов, и дорого стоит.
В результате этих ограничений, наша группа и другие использовали цифровой ПЦР, метод, который обеспечивает абсолютную количественную ДНК-фрагментов, требует только микролитра количества сыворотки из свежих или насыпным образцов, поддается мультиплексирование, показывает более высокую чувствительность, чем традиционные количественной ПЦР , и является менее дорогостоящим, чем прямое секвенирование. Цифровые технологии ПЦР включает в себя использование обычных праймера / зонда анализов и микрофлюидики на основе разделение реакции вода-в-масле ПЦР в ~ 20000 капель. После термоциклирования секционированной реакции, капельки затем анализируют с помощью цитометра потока, чтобы идентифицировать капельки с положительными и отрицательными сигналами. статистика Пуассона используется для вычисления абсолютных величин (число копий) каждого вида ДНК. Концептуальное details цифровой ПЦР были описаны в другом месте 17.
Этот протокол описывает измерение смерти -клеток в организме человека путем измерения дифференциально метилированных ДНК INS цифровой ПЦР. Наши данные , представленные здесь , и в другом месте 6 показывают , что комбинаций праймеров / зондов , которые обнаруживают дифференциальное метилирование цитозина в положении -69 ( по сравнению с сайтом начала транскрипции ИНС) обладает достаточной специфичностью в отношении любого неметилированной цитозина (FAM зонда) или метилированного цитозина ( VIC зонд) (рис 1А и В). Смеси плазмид , содержащих как метилированных и неметилированные фрагменты INS в позиции -69 б.п. (т.е. бисульфит преобразованного ДНК, либо урацил или цитозин в положении -69 б.п.) имеют капель , содержащих одну или другую плазмиду или обе плазмиды (дважды положительные сигналы на фиг.1C). Статистический расчет Пуассона использует е месточисла капельные е, которые положительно для данного зонда (будь то с одним положительным или двойной положительный) для получения числа копий каждого фрагмента метиловым или неметилированной ДНК.
При использовании сыворотки человека для измерения дифференциально метилированных цитозина в положении -69 пар оснований в ДНК бесклеточной (рисунок 3), наши данные показывают две основные функции: (1) уровни метилированных INS 5-10 раз выше по этим предметам чем неметилированной INS (независимо от диагноза), и (2) абсолютные уровни обоих неметилированных и метилированных INS выше у пациентов с впервые выявленным СД1 по сравнению с контрольной группой . В то время как более высокие уровни метилированных ИНС по сравнению с неметилированной INS , вероятно , отражают большую нагрузку ДНК клеток , свободных , исходящим из не -клеток, более высокие уровни обоих видов ИНС в вновь выявленных случаев заболевания субъектов СД1 , вероятно , отражает как увеличение распространенных р гибель клеток (неметилированным INS), и , возможно , смерть / оборот других типов клеток, которые связаны с состоянием заболевания (например, врожденные и адаптивные иммунные клетки). Далее спекуляции на отметках обоих видов ИНС в вновь выявленных случаев заболевания субъектов СД1 обсуждалась ранее 6. Вне зависимости от источников обоих видов ИНС в сыворотке крови от этих лиц, следует отметить , что измерение соотношений неметилированным к метилированной INS (по данным других исследователей с использованием красителя на основе ПЦР) не подобрали существенных различий в абсолютных величинах описанные здесь и в нашей недавней публикации 6, подчеркивая тем самым силу цифровой ПЦР для этого типа анализа биомаркеров.
Некоторые меры предосторожности и ограничения следует отметить. Мы считаем, что очень важно, что кровь обрабатывается в течение 4 ч сбора и либо непосредственно использовали для выделения ДНК или хранили при -80 ° С для дальнейшего использования. В неопубликованных исследованиях, мы имеем наблerved некоторую потерю восстановления ДНК после 4 ч сбора, возможно , из - за деградации ДНК, как показано в исследованиях долгосрочного хранения образцов 18. Из-за повышенной чувствительности цифровой ПЦР, особое внимание следует соблюдать осторожность во избежание загрязнения образцов, которые иначе не могут быть заметны в традиционном кПЦР. Наконец, ключевым ограничением метода является анализ образцов, в которых генерация капель не превышает ~ 10000 капель. Такие образцы не содержат достоверных статистических данных Пуассона, и как таковой можно считать интерпретируемы. Несколько причин такого поколения низкой капельной может содержать технические ошибки в обработке образцов, технические проблемы с генератором капель, или вопросы, связанные с качеством используемых реагентов.
Таким образом, в настоящем докладе описывается подробный протокол для измерения дифференциально метилированных, бесклеточной ДНК INS в положении -69 п.о. цифровой ПЦР. Протокол, описанный здесь, может быть адаптирована к любойвиды ДНК, для которых обнаружение дифференцированно метилированных цитозина желательно, будь то из обращения или из изолированных клеток и тканей, а также может обеспечить абсолютную количественную ДНК-фрагментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
