Introduction
관상 동맥 질환과 그 합병증은 전세계 사망의 주요 원인 중입니다. 현재 치료 전략을 재 확립 혈류에 어느 좁아진 혈관을 확장시키고 또는 바이 패스를 작성하여 초점. 정맥자가 이식을 이용하여 관상 동맥 우회술 (CABG) 먼저 1968 년에 설명하고, 수년에 걸쳐 정제하고있다. 외에도 왼쪽 전방의 재관류는 관상 동맥을 내림차순에서, 복재 정맥 도관은 가장 일반적으로 1을 사용합니다. 그러나, 이식 개통은 복재 정맥 이식 (SVG)의 약점 남아있다. 한 해 수술 후 이식 개통은 십년 2,3 후 61 %로 떨어지고, 85 %이다. SVG 개통 손실의 병태 생리 학적 기전과 원인을 공개하는 것은 그러므로 중요한 작업입니다.
이 동영상은 정맥 이식편 손실을 조사하기 위해 쥐의 정맥 개재 모델을 보여줍니다. 이 방법의 전반적인 목표는 기본 병인 학적 탐구한다및 질병의 진행 동안 -physiological 과정은 약물이나 치료 옵션 테스트에 적합한 모델을 개발한다. 동맥 시스템으로 표면 상복부 정맥 이식함으로써,이 모델은 밀접하게 관상 동맥 우회술의 임상을 모방. 외과 외상, 허혈, 벽 스트레스는 병적 인 혈관 변화의 중요한 트리거하고 설명하는 모델을 모방하고 있습니다.
다른 모델과 종은 정맥 이식편 개통 손실을 조사 할 수 있습니다. 이러한 돼지 4, 양 5 개 (6), 원숭이 (7)과 같은 대형 동물 모델은 인간의 용기와 해부학 적 구조와 유사하므로 팔을 테스트 할 이러한 바이 패스 스텐트 삽입하거나 새로운 수술 기법과 같은 복잡한 치료 전략을, 수 있습니다. 그러나, 특수 하우징, 장비 및 인력이 필요합니다. 또한, 고비용 및 수술 중에 마취 추가의 필요성은 광범위한 응용을 방해. SM래트를 포함한 모든 동물은 특수 하우징을 필요로하지 않으며, 취급이 용이하며, 관리 비용을 갖는다. 마우스 모델 9,10-에 비해 래트 모델 결과의 더 조작성을 이용하므로 적은 변동을 가지고있다. 쥐 생리 학적 및 유전 마우스 (11, 12)보다 인체에 더 유사하다. 또한 대부분의 야생형 마우스는 II 에러를 입력하는 경향이 마우스 모델을 한정 myointima 13 개발한다. 예 하대 정맥 등 주요 마우스 정맥의 조직학은 단지 몇 세포 층으로 구성되어 있으며, 초기 평가 어려운 (13)를 렌더링합니다. 다른 단점은 그래프트 복구 후 후속 분석 가능한 조직의 작은 양이다.
동영상에서 설명한 모델 수행 재현성 저렴하고, 용이하고, 신속하고 확실하게 설정할 수있다. 이 같은 바이러스 벡터와 같은 고가의 실험 치료제를 평가에 특히 적합경제적 인 방식으로 유전자 치료를위한.
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Protocol
동물 실험 동물의 원리, 실험 동물 자원 연구소에 의해 제조 및 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 출판에 대한 가이드를 준수 인도적인 치료를 받았다. 모든 동물 프로토콜은 책임있는 지방 자치 단체 ( "AMT 사의 대 아퍼 싶게 Verbraucherschutz, Hansestadt (보건 및 소비자 보호를위한 사무실) 함부르크")에 의해 승인되었다.
1. 동물 관리
- 실험 동물 연구소에서 300-350g 무게 루이스 쥐 (LEW / CRL) 쥐와 ROSA / 루시 페라 - LEW 형질 전환 쥐를 얻습니다.
- 통풍 캐비닛에 기존의 조건에서 쥐를 유지하고 그들에게 표준 쥐 차우와 멸균 임의 량의 물을 공급.
- 기증자와받는 사람과 syngenic LEW / CRL 쥐와 ROSA / 루시 페라 - LEW 형질 전환 쥐를 사용하여 이식 이식을 수행합니다.
기증자 쥐 2. 준비
- 입회를 사용하여이온 챔버는 이소 플루 란 (2.5-3 %)와 쥐를 마취시키다합니다.
- 그 뒷면에있는 쥐를 놓고 입과 코를 커버하는 안면 마스크로 마취를 유지한다. 뒷다리 다리를 곤란과 반사의 부재를 확인하여 마취의 충분한 깊이를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 일부 수의사 연고를 적용합니다.
- 뒷다리를 확산하고 테이프를 사용하여 자신의 위치를 고정.
- 헤어 트리머 사타구니 모발을 면도하고, 80 % 에탄올을 다음 포비돈 요오드를 사용하여 전체 영역을 소독. 두 번 소독 단계를 반복합니다.
참고 : 외과 영역, 거즈, 및 수술 도구를 소독해야한다. 절차를 통해 멸균 필드를 유지하고 단일 사용, 무균 수술 장갑, 마스크와 모자를 착용하십시오. - 현미경 하에서, 원격 교육의 inguinalis을 따라 수직 절개를 수행합니다. 부드럽게 피하 조직을 분리하는 두 개의 집게를 사용하고 오라에서 표면 상복부 정맥을 노출대퇴 정맥에 진. 조심스럽게 주위 조직에서 피상적 인 상복부 정맥을 격리 할 것.
- 이 마이크로 클램프를 사용하여 표면 상복부의 정맥에서 혈액의 흐름을 중지합니다.
- 조심스럽게 집게로 분리 된 정맥을 올리고 microscissors과 용기를 절단하여 정맥의 약 0.5 ~ 1 cm 세그먼트를 수확. 혈액의 손실을 방지하기 위해 용기 밑둥 마이크로 클램프를 떠난다. 멸균 거즈에 정맥의 제거 조각을 놓습니다. 조심스럽게 수확 정맥의 일단 내부에 30 G 바늘을 배치하고 헤파린과 용기 (50 단위 / ml)로 세척하십시오.
참고 :주의 정맥을 처리 및 리프팅, 절단 및 세척시 손상을 방지. 헤파린의 적절한 양의 이식을 세척해야합니다. - 받는 사람 쥐에 이식 혈관 경련을 방지하기 위해 때까지 얼음에 1 % 리도카인에서 선박 세그먼트를 유지합니다.
- 5 % 이소 플루 란으로 마취를 증가시킴으로써 도너 래트를 안락사. 2 ~ 3 분, 연산 후원격 교육 알바 따라 복부 욕실, 다이어프램을 극복하고, 혈액 순환을 중지 마음을 제거합니다.
받는 사람 쥐 3. 준비
- 마취 및 공여 쥐와 같은 방법으로 수신자 쥐를 고정한다.
- 헤어 트리머 다리의 내측부를 면도 포비돈 요오드 및 80 % 에탄올을 3 회 소독.
- 마취 깊이를 모니터링하고 뒷다리 곤란 때 반사의 유무를 확인하여 충분하다는 것을 보장한다.
- 사타구니 배에 무릎에서 평균 대퇴부 절개를 수행합니다. 현미경으로, 그 주변에서 대퇴 동맥을 분리하는 2 집게를 사용합니다.
- 혈액의 흐름을 중지 마이크로 클램프를 사용합니다. 말초 클램프 다음 먼저 근위 클램프를 놓습니다.
- microscissors와 클램프 대퇴 동맥의 짧은 세그먼트를 잘라 그것을 폐기합니다. 인 차이를 만들어 microscissors와 나머지 동맥 루터 단축정맥 이식편보다 큰 1-2mm. 30 G 바늘을 사용하여 헤파린과 동맥 그루터기를 플래시합니다.
참고 : 외막 약간 용기 밑둥을 넘어 돌출하는 경우, 용기의 말을 통해 살짝 당겨 조각을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. - 동맥 젊고 아름다운 여자 사이의 단계 2.8에서 수확 정맥을 놓고는 간극에 적절하게 맞도록 길이를 조정합니다. 정맥의 방향을합니다.
- 먼저 10-0 prolene의 봉합을 사용하여 근위 문합을 수행합니다. (그림 1D) 표시된 순서대로 하나의 스티치를 실시한다. 복부 측면에 3 개의 봉합을 추가하기 전에 각 측면에 봉합 시작합니다. 그 후, 문합을 완료하기 위해 용기의 지느러미 편에서 3 바늘을 배치합니다.
- 단계 3.8에 기재된 근위 문합과 동일한 기술을 사용하여 그래프트 원위 혈관을 연결한다. 또, 각 측면에 봉합사로 시작하고 복부 SID 세 봉합 배치전자와 지느러미 쪽.
- 피브린 접착제 성분 1, 2와 부하이 1 ML의 주사기를 조심스럽게 집게로 이식을 들어 올려 구성 요소 (2) 다음, 이식에서 피브린 접착제 성분 1의 약 100 μl를 놓습니다.
주 : 1의 비율 : 구성 요소 1과 2는 1에 적용되어 있는지 확인합니다. - 다시 위치에 이식을 놓고 이식의 상단에 구성 요소 1과 2의 추가 100 μl를 놓습니다. 접착제는 이식 및 문합 부전과 정맥 이식편의 과도한 팽창을 방지하기 위해 문합을 모두 다루고 있는지 확인하십시오.
- 조심스럽게 근위 다음에 말초 클램프를 엽니 다.
- 이식 된 정맥 이식편의 말초 동맥에서 볼 수 펄스를 확인하여 성공적인 수술을 확인합니다.
- 피부 폐쇄를 방해하는 과도한 접착제를 제거합니다. 경화 접착제를 들어 올려 microscissors와 과잉을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 5-0 prolene의 봉합으로 피부 층을 닫습니다.
- 4-5m를 주입g / kg 카프로 펜 피하 쥐가 일어나 허용하기 전에. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 복구 될 때까지 하나의 새장에 동물을 유지합니다.
- 다음 3 일간 진통제로 마시는 물 (100 ㎖ 당 50 mg의 설피 린)에 설피 린을 추가하고 매일 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
4. 이중 초음파 검사
참고 : 사용 duxplex 초음파 쥐 (14)에 비 침습적 혈액의 흐름을 시각화합니다.
- 유도 챔버 (이소 플루 란 2 %)에서 쥐를 마취. 그 뒷면에있는 쥐를 놓고 코를 덮는 보호구로 마취를 유지한다.
- 허벅지의 지역 주위에 머리를 제거하기 위해 헤어 가위 헤어 제거 크림을 사용합니다.
- 허벅지에 초음파 젤을 적용합니다. 기포가 없는지 확인합니다. 석사 400 변환기를 사용하여 이중 초음파 영상을 획득 (중심 주파수 : 30 M/ 초 230-400 프레임의 프레임 레이트와 Hz에서).
5. 조직 병리학
참고 : 수확이 형태 계측 학적 분석 15 메이슨의 트리 크롬 염색과 용기를 얼룩합니다.
- 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 수거 용기를 고정하고 에탄올 농도 증가에 탈수. 파라핀의 샘플을 포함하고 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 조각으로 잘라.
참고 : 파라 포름 알데히드는 독성이 특별한주의하여 취급해야합니다. - 트리 크롬 염색 용액을 염색하기 전에 슬라이드 Deparaffinize. , 스테인드 슬라이드를 탈수 자일 렌 그들을 취소 한 매체를 장착 그들을 탑재합니다. 슬라이드를 건조시킨 후, 현미경으로 샘플을 볼 수 있습니다.
6. 생물 발광 영상 (BLI)
참고 : 수술 후 이식은 생물 발광 신호 1을 측정하여 생체 내에서 시간이 지남에 따라 추적했다6.
- PBS 22 ㎖에 D-루시페린 칼륨 염 1 g을 용해시키고 복강 래트 (375 ㎎ / ㎏ 체중)에 주입. 루시페린이 동물에서 순환하는 15 분을 기다립니다.
- 실시간 생물 발광 정량화 시스템으로 쥐를 놓고 생물 발광 신호를 액세스 할 수 있습니다.
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Representative Results
쥐의 정맥 개재 모델은 myointima 증식 및 혈관 이식 실패의 개발을 연구하기에 적합합니다. 동물 수술에서 잘 회복하고 우수한 신체 조건 포스트 동작을 보여줍니다. 그림 1은 키 수술 단계를 보여줍니다. 원격 교육의 inguinalis을 따라 피부를 절개 한 후, 상복부 표면 정맥과 대퇴 동맥 (그림 1A)를 식별된다. 이 초기 이식 실패 및 개통 손실을 초래할 수있는 이식의 수확은 이식 (그림 1B)를 손상시키지 않고, 신중하게 수행해야합니다. 받는 동물 (도 1C)에 그래프트 위치 후에 봉합 스티치가도 1d에 도시 된 순서로 수행된다. 완성 된 정맥 개재 이식은 창백 (그림 1E)를 표시하고 빨간색이되고 재관류 (그림 1 층) 후 맥동을 표시해야합니다.
성공적인 INTEGRATI 대퇴 동맥 이식 개통으로 정맥에 이식은 비 침습적 이중 초음파를 사용하여 (그림 2A)를 확인할 수 있습니다 후. 동계 및 배낭 음성 래트에 루크 양성 쥐의 혈관을 이식함으로써, 생물 발광 이미징시 (도 2b) 위에 그래프트 존재를 모니터링하는데 사용될 수있다.
Myointima 증식은 시간이 지남에 따라 이식에 점진적으로 개발하고 있습니다. 메이슨의 트리 크롬과 조직 학적 염색은 내부 탄성 얇은 판 (그림 2C) 내부 myointima 형성을 보여줍니다. (내부 탄성 박판 내의 영역에 의해 내강의 단면 영역을 분할) 내강의 폐색의 계산은, 이와 myointima 증식 재생 가능한 다이나믹 확인, 28 일 후 수술 후 7 일째에서 이식편 개통의 점진적인 손실을 밝혀 이 쥐 모델에서 (그림 2D).
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그림 1 : 수술의 계획을 자세히 설명합니다. 사타구니 지역의 (A) 해부학. (B) 수확 상복부의 표면 정맥 이식편. 받는 사람 동물의 동맥 젊고 아름다운 여자의 정맥 이식을 배치 (C). (D) 문합 스티치의 주문. 정맥 이식 건설 후 (E) 사이트. 정맥 개재 이식의 재관류 후 (F) 사이트. 검은 색 화살표는 상복부의 표면 정맥을 표시합니다. 스케일 바 = 5 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 동물 모델의 특성. 정맥 개재의 (A) 이중 초음파 검사 IMMED를 접목 iately 이식 (0 D) 및 이십팔일 후 작업 (28D) 후. 0일 및 수술 후 이십팔일에서 루크 음성 쥐에 이식 루크 양성 이식에서 (B) BLI. (C) 대표 그래프트 단면은 일 7 일, 14 일, 21 일 후에 수확하고, 28의 메이슨 트리 크롬으로 염색. (상단 패널 : 스케일 바 = 400 μm의 저급 패널 : 스케일 바 = 100 μm의) (D) 비율의 내강 소멸은 전 루멘에서 새 내부 루멘을 나누어 계산한다. 집단 간 차이는 페로 니의 사후 테스트와 분산 (ANOVA)의 편도 분석에 의해 평가되었다. P <0.01. 오차 막대는 표준 편차 (SD)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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추가 파일 1 : 외과 절차의 도식 그림. 원격 교육의 inguinalis 따라 세로 절개 하부 상복부 정맥을 노출 공여 쥐에 대해 수행된다. 혈액 유동은 두 개의 마이크로 클램프 정지하고, 0.5 ~ 1.0 cm 길이의 정맥 세그먼트가 수확된다. 수신자 래트에서 중간 대퇴 절개 대퇴 정맥, 동맥 및 신경을 노출을 행한다. 대퇴부 동맥 클램핑 후, 용기 부분은 제거하고, 수확 된 정맥 이식 대체. 보충 파일 1을 보려면 여기를 클릭하십시오 (또는 다운로드 마우스 오른쪽 단추로 클릭).
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Discussion
이 동영상은 정맥 이식편 손실을 조사 및 기본 병리학 적 과정의 탐사 및 새로운 약물이나 치료 옵션의 테스트를 위해 허용하는 쥐의 정맥 개재 모델을 보여줍니다.
마취는 수술 절차의 중요한 측면이다. 이것은 특히 장시간 작업 중에, 안전하고 쉬운 방법으로 연속 inhalative 마취 시스템은 좋습니다. 이 동작은 이상 1 시간 소요 트레이닝 단계 동안 매우 중요 할 수있다.
수술에 관하여, 수확 주입 17 일 동안 정맥 이식편을 손상하지 중요하다. 용기의 외막을 파지하여 정맥 이식편에 대한 손상을 방지하고 후속 혈전 형성 및 이식 실패를 피할 수있다. 이식편 개통 정맥 이식편 또는 dista 혈류 관찰을 통해 맥동 그래프트 구조 정맥 직후 결정될 수있다리터 동맥뿐만 아니라 이중 초음파 검사를 통해.
절차의 또 다른 중요한 측면은 정맥 이식편의 과도한 팽창을 방지하기위한 것이다. 동맥압 시스템 정맥 이식편 갑자기 노출 이후의 과잉 팽창 증가 벽 장력에 이르게하고, 흐름 패턴의 변화. 이러한 혈전증, 문 합부 부족, 조기 이식 실패의 원인이다. 피브린 접착제와 정맥 이식을 지원하는 것은 통제되지 않은 풍선을 방지하고 기계 파괴의 내막과 미디어를 보호 할 수 있습니다. 흡수성 콜라겐 커버 피브린 접착제를 대체하고 perivenous 18 커버로서 사용될 수있다.
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 의심 할 여지없이 정맥 이식과 동맥 사이의 문합이다. 이 이식편의 조기 고장의 원인이 될 수 문합의 축소로 이어질 것 같은 배려, 용기의 두 벽을 관통하지 않도록주의해야합니다. 또한, 특수 attentioN은 봉합의 현지화로 지불해야합니다. 동맥과 정맥에 봉합 위치의 일치 성이 이식 개통을 보장하며 부족을 방지 할 수 있습니다. 이를 용이하게하기 위해, 봉합도 1d에 도시 된 순서로 수행 될 수있다.
초보자는 먼저 미세 수술 장비 및 해부학 적 구조의 작은 크기 숙지해야하기 때문에 기술적 인 어려움의 정도는, 기술의 한계로 간주 될 수있다. 그러나 사용되는 다른 모델은 동일한 어려움을 전시, 우리는이 비디오는 짧은 시간 내에이 기술을 마스터 초보자 외과 의사를 도움이 될 것으로 생각합니다.
정맥 이식 실패 수많은 작은 동물 모델이 문헌에 기재되어있다. 그러나, 대부분의 모델 전용 분석 (13) 조직의 매우 작은 양을 제공한다. 이 방법의 장점은 얻을 수 조직의 비교적 큰 양이다. 하나의 이식은 여러 부분으로 분할 될 수있는ND 이에 필요한 실험 동물의 수를 감소시키는 다른 분석을 위해 사용된다.
징크 핑거 클레아 기술의 최근 발전은 녹아웃 생쥐 (19)의 생성을 활성화. 적합한 녹아웃 생쥐를 선택함으로써, 이식편 개통 손실은 다양한 질병 상태에서 연구 될 수있다. 예를 들어, 레닌 녹아웃 고혈압 래트 (20)을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 이러한 유전 적 배경이 상이한 세팅 또는 myointima 증식의 개발에 특정한 유전자의 영향에 정맥 이식 실패의 메카니즘에 대한 정보가 이삭이 동물 모델과 조합 될 수있다.
결론적으로,이 영상에 기재된 모델 수행 재현성 저렴하고, 용이하고, 신속하고 확실하게 설정할 수있다. 정맥 이식 실패의 주요 원인입니다 Myointima 증식은 진보적 내강 폐색의 결과로, 사주를 통해 빠른 속도로 개발했다. 성공적으로 테스트 치료이 모델에 옵션이 더 큰 동물 모델에서 확인 할 수있다.
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Acknowledgments
저자는 그녀의 기술 지원을 크리스티안 Pahrmann 감사합니다. 본 연구는 독일 재단 FUER Herzforschung에 의해 투자되었다 (F / 14분의 28). DW는 심장 및 폐 이식을위한 국제 사회에서의 여행 수상에 의해 지원되었다. TD는 그렇지-크로네-는 Fresenius 재단 (2012_EKES.04)에서 그렇지 크로네 우수 장학금을 받았다. SS는 독일 연구 협회로부터 연구비를받은 (DFG, DE2133 / 2-1, TD 및 SCHR992 / 3 일, SCHR992 / 4-1, SS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat LEW/Crl | Charles River | Stock number 004 | |
| Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk |
Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan | NBPR rat number 0299 | http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/ |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | AbbVie | PZN 10182054 Art.Nr.: B506 | Isoflurane |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| hair removal creme | Rufin cosmetic | 27618 | |
| Povidone-Iodine | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Heparin | Rotexmedica | PZN: 3862340 | 25.000 I.E./ ml |
| Xylocain 1% | AstraZeneca | PZN: 1137907 | Lidocain |
| EVICEL | J&J Med.Ethicon Biosur | PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE | fibrin glue |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system | VisualSonics | duplex sonography | |
| Ecogel 100 ultrasound gel | Eco-med | 30GB | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth | L-8220 | |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Xenogen Ivis 200 | Perkin Elmer | bioluminescence imaging | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Resorcine-Fuchsine Weigert | Waldeck | 2.00E-30 | Trichrome staining |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 | |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
References
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