Introduction
冠状动脉疾病及其并发症是世界范围内死亡的主要原因之一。当前的治疗策略集中在重新建立血流，或者通过扩张变窄容器或通过创建旁路。使用自体静脉冠状动脉旁路移植术（CABG）于1968年首次描述，并不断得到完善，多年来。除了左前的血运重建降支动脉，隐静脉导管是最常用的1。然而，移植通畅仍然隐静脉移植（SVG）的致命弱点。手术一年后，通畅率85％，下降幅度为61％，十年后2,3。因此揭幕SVG通畅损失的病理生理机制和原因的一项重要任务。
本视频演示了大鼠静脉插入模型，探讨静脉移植物损失。这种方法的总体目标是发掘潜在的病理生物学并在疾病进展和-physiological流程，制定药物或治疗方法测试一个合适的模型。通过移植的腹壁浅静脉进入动脉系统，这种模式密切模仿冠状动脉旁路移植术的临床设置。手术创伤，局部缺血，和壁应力是病理血管变化重要触发器和在所述的模型模仿。
不同型号和种类都可以探讨静脉移植通畅的损失。大动物模型，如猪4，羊5，狗6和猴7，类似于人类血管和解剖结构，从而使复杂的治疗策略，如旁路支架或新的外科技术，待测试8。然而，需要特殊的房屋，设备，人员和工作人员。此外，高的成本和手术过程中需要额外的麻醉师阻碍其更广泛的应用。钐所有的动物，包括老鼠，很容易处理，不需要特殊的住房，并有管理的成本。相比于小鼠模型9,10，大鼠模型具有较好的可操作性的成果优势，从而减少可变性。老鼠是生理和基因更类似于人类比老鼠11,12。此外，大多数的野生型小鼠仅开发有限myointima 13，其使小鼠模型容易发生II型误差。主小鼠静脉，如下腔静脉的组织学，只由几个细胞层的并呈现早期评估困难13。另一个缺点是可用于接枝恢复之后的后续分析的组织的量小。
在此视频描述的模型是可重复的，价格低廉，且容易执行，并且它可以快速而可靠地建立。它特别适合用于评估昂贵的实验治疗剂，如病毒载体用于基因疗法，以经济的方式。
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Protocol
动物遵照指南实验动物的原则，通过实验动物资源研究所编制和美国国立卫生研究院公布收到的人文关怀。所有动物方案是由主管地方当局（“献给金额UND GESUNDHEIT Verbraucherschutz，Hansestadt（办公室健康与消费者保护）汉堡”）的批准。
1.动物护理
- 获取Lewis大鼠（LEW / CRL）大鼠和ROSA /荧光素酶LEW转基因大鼠实验动物研究所体重300-350克
- 保持常规条件下的老鼠在通风柜和养活他们的标准大鼠饲料和蒸压水随意。
- 执行使用ROSA /荧光素酶LEW转基因大鼠作为捐助者和同系LEW / CRL大鼠作为收件人移植术。
2.捐助者大鼠的制备
- 使用吸纳离子腔麻醉异氟烷（2.5-3％）的老鼠。
- 放置在它的后面的大鼠和保持与覆盖嘴和鼻子的面罩的麻醉。按捏后脚和验证的情况下反射的检查麻醉足够的深度。涂一些药膏兽医的眼睛，以防止干燥，而在麻醉下。
- 传播后腿和用胶布固定自己的位置。
- 剃腹股沟头发与头发剪，并使用聚维酮碘，随后通过80％乙醇消毒的整个区域。重复消毒一步的两倍。
注：手术区，纱布，及手术器械应灭菌。维持无菌区整个过程和穿一次性使用的，无菌手术手套，口罩，和帽。 - 在显微镜下，进行沿LINEA inguinalis垂直切口。用两个镊子皮下组织轻轻分开，并从其ORI暴露腹壁浅静脉杜松子酒的股静脉。小心地从周围组织中分离出腹壁浅静脉。
- 停止使用两个微夹子固定腹壁浅静脉血流。
- 通过仔细地抬起与镊子分离静脉，并通过容器与microscissors切割收获静脉的大致0.5到1厘米的段。留在容器残端微夹具防止血液流失。放置在无菌纱布取下的一块静脉。小心地将一地下30针收获静脉的一端内侧和冲洗用肝素容器（50单位/ ml）。
注意：小心使用静脉，避免吊装，切割，和冲洗过程中的损坏。确保肝素适量的冲洗移植。 - 保持在冰上在1％利多卡因的血管区段，直到移植到受体鼠，以防止一个容器痉挛。
- 通过增加麻醉5％异氟醚安乐死供体鼠。后2-3分钟，运恩沿着白线腹部，划破膜片，并取出心脏停止流通。
3.收件人鼠的制备
- 麻醉并固定收件人大鼠以相同的方式作为供体鼠。
- 剃腿的内侧与毛发修剪器，并使用聚维酮碘和80％乙醇消毒三次。
- 监测麻醉深度，并确保它是按捏后脚时验证的情况下的反射的足够了。
- 从膝盖到腹股沟褶执行中值股骨切口。在显微镜下，用2镊子股动脉从周围环境中分离出来。
- 使用微夹钳阻止血液的流动。放置近侧夹紧第一，其次远侧夹子。
- 剪出夹紧股动脉microscissors短段和丢弃。缩短剩下的树桩动脉与microscissors，创造一个差距是1-2毫米比静脉移植大。利用地下30针冲洗动脉残端与肝素。
注：如果外膜伸出略微超出血管断端，使用镊子小幅拉过来的船只将其取出一块。 - 从步骤2.8动脉树桩之间放置收集静脉和调整长度，使其合适地配合到间隙。注静脉的方向。
- 首先用一个10-0普理灵缝合执行近端吻合。在所示（ 图1D）的顺序进行单针。开始与腹侧增加三个缝合线之前的每个侧面缝合。之后，放置在容器的背侧三针来完成吻合术。
- 与使用相同的技术，作为在步骤3.8中描述的近端吻合接枝连接远侧血管。再次，开始在每个横向侧的缝合线，然后将三道缝线上的腹侧的side和背侧。
- 负载两个1毫升注射器用纤维蛋白胶成分1和2小心提起用镊子接枝拖放大约100μl的纤维蛋白胶部件1的接枝下，接着部件2。
注：确保组件1和2在1应用：1的比例。 - 放置接枝背部在其位置，并在移植物的顶部下降一个额外的100μl的组分1和2的。可以肯定的胶水涵盖接枝并且为了防止吻合不全和静脉移植物的过度膨胀的吻合术。
- 小心地打开远端夹紧，随后近端。
- 确认通过检查在移植静脉和移植物的远端动脉可见光脉冲一个成功的手术。
- 除去过多的胶水，阻碍皮肤缝合。使用镊子解除固化胶水和microscissors去除多余的。关闭皮肤层用5-0普理灵缝线。
- 注射4-5米克/公斤卡洛芬皮下注射使鼠醒来了。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。保持动物在一个单一的笼子里，直到它完全恢复。
- 添加安乃近到饮用水（每100毫升50毫克安乃近）作为止痛药为以下3天，每日监测动物。
4.多普勒超声
注：使用超声duxplex可视化血流非侵入性大鼠14。
- 麻醉中的感应腔（异氟烷2％）大鼠。将在它的后面大鼠和与覆盖鼻面罩维持麻醉。
- 使用电推剪及脱毛霜去除周围的大腿区域的头发。
- 应用超声波凝胶大腿。确保有没有气泡。使用MS 400传感器获取多普勒超声图像（中心频率：30男赫兹）与230-400帧/秒的帧速率。
5.组织病理学
注：嘉实和染色与马松染色的容器形态分析15。
- 过夜固定在4％低聚甲醛的收获容器和在增加的乙醇浓度脱水它。嵌入石蜡的样品，并将其切成用切片机5微米厚的切片。
注：多聚甲醛是有毒的，应特别小心。 - 用三色染色液染色之前Deparaffinize的幻灯片。脱水染色切片，用二甲苯清除它们，在安装中安装它们。干燥载玻片后，用显微镜观看样本。
6.生物发光成像（BLI）
注：移植术后通过测定生物发光信号1跟踪随着时间的推移在体内6。
- 溶解1g D-荧光素钾盐在22ml的PBS中，并将其注入腹膜内到大鼠（375毫克/千克体重）。等待15分钟的荧光素在动物中循环。
- 将老鼠变成一个实时定量生物发光系统并访问生物发光信号。
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Representative Results
大鼠静脉插入模型适用于研究myointima增生静脉移植失败的发展。动物从手术中恢复良好，显示出出色的身体条件后的操作。 图1示出了关键的手术步骤。沿着LINEA inguinalis切开皮肤后，上腹部浅静脉和股动脉被确定（ 图1A）。应仔细进行接枝的收获，而不会损坏接枝（ 图1B），因为这可能导致早期移植物衰竭和通畅损失。在受体动物（ 图1C）定位接枝后，吻合针迹在图1D中所示的顺序执行。完成后的静脉移植介入出现面色苍白（ 图1E），并应成为红色，并显示灌注（ 图1F）后的脉动。
成功的集成公司在静脉进入股动脉和移植物通畅的移植后可以确认非侵入性使用双面超声（ 图2A）。通过移植一个吕克阳性大鼠的静脉进入一个同基因吕克负鼠，生物发光成像可以被用于监测在一段时间（ 图2B）接枝的存在。
Myointima增生移植随着时间的推移逐步发展起来的。用Masson三色组织染色表明内弹性膜（ 图2C）内myointima形成。管腔闭塞的计算，（分割管腔的截面积由区域内弹性膜内）显示移植物通畅的从第7天至28天手术后逐渐损失，从而确认myointima增生的再生动态在此大鼠模型中（ 图2D）。
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图1：详细的手术过程的计划。 （一）腹股沟区解剖。 （B）收获上腹浅静脉移植。 （三）配售受体动物的动脉树桩之间的静脉移植。 （D）吻合针顺序。静脉移植后施工（E）站点。静脉移植干预的再灌注后（F）站点。黑色箭头标记胃脘浅静脉。的比例尺= 5毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：动物模型的表征。静脉插入的（A）双功能超声嫁接IMMED iately移植（0D）和28天术后（28D）之后。从0天及手术后的28日内移植到吕克负鼠吕克阳性的移植物（B）BLI。 21天7，14，后（C）的代表性的接枝截面收获，和28以及用Masson三色染色。 （上图：在比例尺= 400微米;下图：在比例尺= 100微米）（D）的百分比管腔闭塞通过从前者管腔除以新内腔计算。间差异通过方差分析（ANOVA）和Bonferroni的post-hoc检验的单向分析评估。 P <0.01。误差棒为标准偏差（SD）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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补充文件1：手术过程的示意图。沿着LINEA inguinalis的垂直切口捐助大鼠进行，露出腹壁下静脉。血流停止用两个微钳，和静脉段长0.5-1.0厘米收获。在收件人大鼠，中位数股骨切口进行，暴露股静脉，动脉，神经。夹紧股动脉之后，血管段被除去，并通过将收获的静脉移植替代。 请点击此处查看补充文件1（或右键点击下载）。
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Discussion
本视频演示了大鼠静脉插入模型，探讨静脉移植的损失，并允许潜在的病理过程的探索和新的药物和治疗方案的测试。
麻醉的手术过程中的一个关键方面。建议连续吸入性麻醉系统，因为这是一种安全，简便的方法，尤其是在长时间的操作。这可以在训练阶段期间，当操作的时间超过1小时，是非常重要的。
相对于手术过程，重要的是不向收获及植入17时损坏静脉移植物。夹持容器的外膜可以防止对静脉移植损失，避免随后的血栓形成和移植物衰竭。移植通畅可以立即在静脉移植物或通过DISTA血液流动的观察与脉动移植静脉建设后确定升动脉，以及通过双功能超声。
该方法的另一个重要方面是，以防止静脉移植物的过度扩张。静脉移植到动脉压系统突然暴露导致增加壁张力，随后的过度扩张，并在流动格局的变化。这些都是血栓形成，吻合口机能不全，早期移植失败的源。支持与纤维蛋白胶移植静脉可以防止不受控制的气球和防止机械破坏内膜和媒体。吸收的胶原封面是纤维蛋白胶的替代和可以用作静脉周围覆盖18。
该协议中最关键的一步，无疑是静脉移植物和动脉之间的吻合。必须小心不要刺穿容器的两个壁，因为这会导致吻合的缩小，这可导致移植物的早期失效。另外，特别注意要n必须支付给缝线的本地化。在动脉和静脉缝合位置的一致性，确保移植通畅，防止不足。为方便起见，缝线可以在图1D中所示的顺序来执行。
技术的难易程度可以被看作是该技术的限制，因为新手必须首先熟悉显微设备和所述解剖结构的小尺寸。然而，使用其他车型表现出相同的困难，我们相信，该视频将帮助外科医生新手掌握在短时间内这种技术。
无数小动物模型静脉移植失败已经在文献中进行了描述。然而，大多数车型只分析13提供了非常少量组织。这种方法的一个优点是，可以得到相当大量的组织。一种接枝可以被划分成多个部分的次用于不同测定法，从而减少了所需的实验动物的数量。
在锌指核酸酶技术的最新进展使敲除鼠19的产生。通过选择合适的基因敲除大鼠移植通畅的损失可以在不同的病情进行研究。例如，肾素敲除鼠可用于研究高血压20。这些遗传背景可以用此动物模型相结合，以收集关于静脉移植失败的在不同的设置或对某些基因在myointima增生的发展的影响的机制的信息。
总之，在此视频描述的模型是可重复的，价格低廉，且容易执行，并且它可以快速而可靠地建立。 Myointima增生，这是静脉移植失败的主要原因，迅速发展四个星期，造成渐进腔闭塞。试验成功治疗在这个模型选项可以在大动物模型中进一步证实。
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Acknowledgments
作者感谢克里斯蒂安Pahrmann她的技术援助。这项研究是由德国妇儿基金会资助Herzforschung（F / 28/14）。 DW是由来自国际社会旅游奖心脏和肺移植的支持。 TD从否则-克朗 - 费森尤斯基金会（2012_EKES.04）收到否则克朗卓越助学金。 SS收到研究经费来自德意志研究联合会（DFG; DE2133 / 2-1，TD和SCHR992 / 3- 1，SCHR992 / 4-1，SS）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat LEW/Crl | Charles River | Stock number 004 | |
| Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk |
Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan | NBPR rat number 0299 | http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/ |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | AbbVie | PZN 10182054 Art.Nr.: B506 | Isoflurane |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| hair removal creme | Rufin cosmetic | 27618 | |
| Povidone-Iodine | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Heparin | Rotexmedica | PZN: 3862340 | 25.000 I.E./ ml |
| Xylocain 1% | AstraZeneca | PZN: 1137907 | Lidocain |
| EVICEL | J&J Med.Ethicon Biosur | PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE | fibrin glue |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system | VisualSonics | duplex sonography | |
| Ecogel 100 ultrasound gel | Eco-med | 30GB | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth | L-8220 | |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Xenogen Ivis 200 | Perkin Elmer | bioluminescence imaging | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Resorcine-Fuchsine Weigert | Waldeck | 2.00E-30 | Trichrome staining |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 | |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
References
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