Introduction
malattie coronarica e loro complicanze sono tra le principali cause di morte in tutto il mondo. strategie terapeutiche attuali si concentrano su ristabilendo il flusso di sangue, sia dilatando nave ridotto o con la creazione di un bypass. Bypass coronarico (CABG) utilizzando autografts vena è stato descritto nel 1968 ed è stato affinato nel corso degli anni. A parte la rivascolarizzazione della discendente anteriore dell'arteria coronaria, safena condotti vena sono più comunemente utilizzati 1. Tuttavia, pervietà dell'innesto rimane il tallone d'Achille di innesti di vena safena (SVG). Un anno dopo l'intervento chirurgico, pervietà dell'innesto è 85%, scendendo al 61% dopo dieci anni 2,3. Svelare i meccanismi fisiopatologici e le cause della perdita di pervietà SVG è quindi un compito importante.
Questo video dimostra una vena modello di interposizione di ratto per studiare perdita del trapianto vena. Gli obiettivi generali di questo metodo sono per esplorare la patobiologico sottostantee processi -physiological durante la progressione della malattia e di sviluppare un modello adatto per la droga o test opzione terapeutica. Con il trapianto della vena epigastrica superficiale nel sistema arterioso, questo modello imita da vicino la situazione clinica di bypass coronarico. trauma chirurgico, ischemia, e lo stress di parete sono importanti trigger di alterazioni vascolari patologiche e sono imitati nel modello descritto.
modelli e diverse specie sono a disposizione per studiare la perdita di pervietà della vena del trapianto. Grandi modelli animali, come maiali, pecore 4 5 6, cani e scimmie 7, assomigliano nave umana e strutture anatomiche e consentono quindi di strategie terapeutiche complesse, come stenting bypass o di nuove tecniche chirurgiche, da testare 8. Tuttavia, sono necessari speciali abitazioni, attrezzature e personale. Inoltre, i costi elevati e la necessità di un anestesista aggiuntivo durante la chirurgia impediscono loro applicazione più ampio. Smtutti gli animali, inclusi ratti, sono facili da maneggiare, non richiedono apposito alloggiamento, e hanno costi gestibili. Rispetto ai modelli murini 9,10, modelli di ratto hanno il vantaggio di una migliore operatività e quindi meno variabilità nel risultato. I ratti sono fisiologicamente e geneticamente più simili agli esseri umani che topi 11,12. Inoltre, la maggior parte dei topi wild-type si sviluppano solo myointima limitata 13, che rendono modelli murini inclini a errori di tipo II. L'istologia delle principali vene mouse, come la vena cava inferiore, costituito solo da pochi strati di cellule e rende difficile valutazione precoce 13. Un ulteriore inconveniente è la piccola quantità di tessuto disponibili per successive analisi dopo il recupero innesto.
Il modello descritto in questo video è riproducibile, economico e di facile esecuzione, e può essere stabilito in modo rapido e affidabile. È particolarmente adatto per valutare costosi agenti terapeutici sperimentali, come vettori viraliper la terapia genica, in modo economico.
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Protocol
Animali hanno ricevuto cura umana nel rispetto della guida dei principi di animali da laboratorio, preparati dall'Istituto di Laboratorio risorse animali e pubblicati dal National Institutes of Health. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalle autorità locali competenti ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Ufficio per la salute e la tutela dei consumatori) di Amburgo").
1. Animal Care
- Ottenere ratti ratti Lewis (AES / CRL) e Rosa / luciferasi-AES ratti transgenici peso di 300-350 g presso l'Istituto di animali da laboratorio.
- Mantenere i ratti in condizioni convenzionali in armadi ventilati e dar loro da mangiare chow ratto normale e autoclavato ad libitum acqua.
- Eseguire un trapianto di trapianto utilizzando i / luciferasi-AES ratti transgenici Rosa come donatori e le singenici topi AES / CRL i destinatari.
2. Preparazione del Rat Donor
- Utilizzare un Inductcamera di ionizzazione ad anestetizzare un ratto con isoflurano (2,5-3%).
- Posizionare il topo sul dorso e mantenere la anestesia con una mascherina a protezione della bocca e del naso. Verificare la presenza di sufficiente profondità dell'anestesia pizzicando le zampe posteriori e verificando l'assenza di riflessi. Applicare un po 'vet unguento per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Stendere le zampe posteriori e fissare la loro posizione usando del nastro.
- Radere i capelli inguinale con un trimmer capelli e disinfettare l'intera area utilizzando iodopovidone seguito dal 80% di etanolo. Ripetere la fase di disinfezione due volte.
NOTA: l'area chirurgica, garza, e strumenti chirurgici devono essere sterilizzati. Mantenere un campo sterile durante tutta la procedura e l'usura monouso, guanti chirurgici sterili, maschere e cappucci. - Sotto un microscopio, eseguire una incisione verticale lungo le inguinale Linea. Utilizzare due pinze per separare delicatamente i tessuti sottocutanei ed esporre la vena epigastrica superficiale dalla sua origin sulla vena femorale. isolare con cura la vena epigastrica superficiale, dai tessuti circostanti.
- Interrompere il flusso di sangue nella vena epigastrica superficiale, utilizzando due morsetti micro.
- Raccolto un segmento di circa 0,5-1 cm vena sollevando attentamente la vena isolato con una pinza e taglio attraverso il vaso con microscissors. Lasciare le fascette micro sul ceppo recipiente per prevenire la perdita di sangue. Posizionare il pezzo rimosso della vena sulla garza sterile. posizionare accuratamente un ago 30 G all'interno un'estremità della vena raccolto e lavare il vaso con eparina (50 unità / ml).
NOTA: Maneggiare la vena con cura ed evitare danni durante il sollevamento, il taglio, e vampate di calore. Assicurarsi di lavare l'innesto con la giusta quantità di eparina. - Tenere il segmento nave in 1% lidocaina in ghiaccio fino al trapianto nel ratto destinatario di prevenire un spasmo dei vasi.
- Euthanize ratto donatore aumentando l'anestesia per 5% isoflurano. Dopo 2-3 minuti, open dell'addome lungo la linea alba, tagliare attraverso il diaframma, e rimuovere il cuore per interrompere la circolazione.
3. Preparazione del Topo destinatario
- Anestetizzare e fissare il ratto destinatario nello stesso modo come il topo donatore.
- Shave lato mediale delle gambe con un trimmer capelli e disinfettare tre volte utilizzando iodopovidone e l'80% di etanolo.
- Monitorare la profondità dell'anestesia e assicurarsi che sia sufficiente verificando l'assenza di riflessi quando pizzicare i piedi posteriori.
- Eseguire un'incisione mediana femorale dal ginocchio alla piega inguinale. Sotto un microscopio, utilizzare 2 pinze per separare l'arteria femorale che lo circonda.
- Utilizzare pinze micro per fermare il flusso di sangue. Posizionare il morsetto prossimale prima, seguita dalla pinza distale.
- Tagliare un breve segmento dell'arteria femorale serrato con microscissors ed eliminarla. Accorciare il moncone arteriosa restante con microscissors, creando un gap che è1-2 mm superiore al trapianto vena. Lavare il moncone arteriosa con eparina con un ago 30 G.
NOTA: Se l'avventizia sporge leggermente oltre il ceppo recipiente, utilizzare pinze per tirare leggermente sopra l'estremità della nave e rimuovere un pezzo. - Posizionare la vena raccolto dal punto 2.8 tra i ceppi arteriosi e regolare la lunghezza in modo che si adatti opportunamente nella fessura. Notare la direzione della vena.
- Eseguire la anastomosi prossimale prima utilizzando una sutura 10-0 prolene. Condurre singoli punti nell'ordine indicato (Figura 1D). Iniziare con una sutura su ciascun lato laterale prima di aggiungere altri tre suture sul lato ventrale. Successivamente, posizionare tre punti sul lato dorsale della nave per completare l'anastomosi.
- Collegare i vasi distali con l'innesto con la stessa tecnica come per l'anastomosi prossimale descritto al punto 3.8. Anche in questo caso, iniziare con una sutura su ogni lato laterale e quindi inserire tre punti di sutura sul sid ventraleee lato dorsale.
- Caricare due siringhe da 1 ml con componente colla di fibrina 1 e 2. sollevare con attenzione l'innesto con una pinza e scendono circa 100 ml di fibrina componente colla 1 sotto l'innesto, seguita dalla componente 2.
NOTA: Assicurarsi che i componenti 1 e 2 siano applicati in un rapporto 1: 1. - Posizionare l'innesto nella sua posizione e rilasciare ulteriori 100 ml di componenti 1 e 2 su di trapianto. Assicurarsi che la colla copre sia l'innesto e l'anastomosi per prevenire insufficienza anastomotico e sovradistensione del trapianto vena.
- Aprire con cautela il morsetto distale, seguito dal prossimale.
- Conferma un intervento chirurgico di successo controllando un impulso visibile nella vena trapiantato e arteria distale dell'innesto.
- Rimuovere la colla eccessiva, che impedisce la chiusura della pelle. Utilizzare pinze per sollevare la colla curata e rimuovere l'eccesso con microscissors. Chiudere gli strati della pelle con 5-0 punti di sutura prolene.
- Iniettare 4-5 mg / kg per via sottocutanea Carprofen prima di consentire il ratto di svegliarsi. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Mantenere l'animale in una sola gabbia fino a quando non è completamente recuperato.
- Aggiungere Metamizolo per l'acqua potabile (50 mg Metamizolo per 100 ml) come antidolorifici per i successivi 3 giorni e monitorare l'animale al giorno.
4. Duplex ecografia
NOTA: Utilizzare ecografia duxplex di visualizzare il flusso di sangue in maniera non invasiva nei ratti 14.
- Anaesthetize un topo in una camera di induzione (isoflurano 2%). Posizionare il topo sul dorso e mantenere l'anestesia con una mascherina a protezione del naso.
- Utilizzare tosatrici e crema depilatoria per rimuovere i capelli intorno alla zona della coscia.
- Applicare gel ultrasuoni per la coscia. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria. Acquisire le immagini ecografia duplex utilizzando un trasduttore 400 MS (frequenza centrale: 30 MHz) con un frame rate di 230-400 fotogrammi / sec.
5. istopatologia
NOTA: Raccolta e macchia la nave con la colorazione tricromica di Masson per l'analisi morfometrica 15.
- Fissare la nave raccolti in 4% paraformaldeide notte e disidratare in concentrazioni crescenti di etanolo. Incorpora il campione in paraffina e tagliatela a 5 micron fette spesse utilizzando un microtomo.
NOTA: Paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato con particolare cura. - Deparaffinare le diapositive prima di colorazione con tricromica soluzione colorante. Disidratare i vetrini colorati, eliminarli con xilene, e montarli in mezzo di montaggio. Dopo l'essiccazione le diapositive, visualizzare i campioni con un microscopio.
6. bioluminescenza Imaging (BLI)
NOTA: L'innesto post-operatorio è stato rintracciato nel corso del tempo in vivo misurando il segnale bioluminescente 16.
- Sciogliere 1 g di sale di potassio D-Luciferin in 22 ml di PBS e iniettare per via intraperitoneale nel ratto (375 mg / kg di peso corporeo). Attendere 15 min per la luciferina circolazione nell'animale.
- Posizionare il topo in un sistema bioluminescente quantificazione tempo reale e accedere al segnale di bioluminescenza.
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Representative Results
Il modello di interposizione di ratto vena è adatto per studiare lo sviluppo di myointima iperplasia e insufficienza venosa graft. Animali recuperare bene da un intervento chirurgico e mostrano ottime condizioni fisiche post-operatorio. La Figura 1 mostra i passi chirurgici chiave. Dopo l'incisione cutanea lungo le inguinale Linea, la vena superficiale epigastrica e l'arteria femorale sono identificati (Figura 1A). La raccolta del trapianto deve essere effettuata con attenzione, senza danneggiare l'innesto (Figura 1B), in quanto ciò può portare al fallimento del trapianto precoce e la perdita di pervietà. Dopo aver posizionato il trapianto nel ricevente animali (Figura 1C), punti anastomosi sono eseguite nell'ordine mostrato nella Figura 1D. L'interposizione graft venoso completato appare pallido (Figura 1E) e dovrebbe diventare rosso e mostrare la pulsazione dopo riperfusione (Figura 1F).
Gli integrati di successo sulla della vena femorale nella arteria e pervietà dopo il trapianto può essere confermata non invasivo utilizzando duplex ecografia (Figura 2A). Con trapianto vena di un ratto Luc-positive in un topo Luc-negativo singenici, l'imaging bioluminescenza può essere utilizzato per monitorare la presenza dell'innesto nel tempo (Figura 2B).
Myointima iperplasia sviluppa progressivamente nel trapianto nel corso del tempo. Colorazione istologica con tricromica di Masson dimostra myointima formazione all'interno della lamina elastica interna (Figura 2C). Il calcolo di obliterazione del lume, (dividendo l'area della sezione trasversale del lumen per l'area all'interno della lamina elastica interna) ha rivelato una graduale perdita di pervietà dal giorno 7 al giorno 28 post-operatorio, confermando le dinamiche riproducibili di myointima iperplasia in questo modello di ratto (Figura 2D).
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Figura 1: Schema dettagliata della procedura chirurgica. (A) Anatomia della regione inguinale. (B) La raccolta del epigastrica superficiale della vena trapianto. (C) Posizionamento del trapianto vena tra i ceppi arteriosi dell'animale ricevente. (D) Ordine dei punti anastomosi. (E) del sito dopo la costruzione dell'innesto venoso. (F) del sito dopo la riperfusione del graft venoso. frecce nere indicano la vena superficiale epigastrica. La barra di scala = 5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione del modello animale. (A) Duplex ecografia di un interposizione venosa innestare immed iately dopo il trapianto (0d) e 28 giorni post-operatorio (28d). (B) BLI da Luc-positivi innesti trapiantati in topi Luc-negativi a 0 giorni e 28 giorni dopo l'intervento chirurgico. (C) Rappresentante sezioni trasversali innesto raccolte dopo giorni 7, 14, 21, e 28 e colorati con tricromica di Masson. (Pannello superiore: la barra di scala = 400 micron; pannello inferiore: la barra di scala = 100 micron) (D) obliterazione Luminal in percentuale è calcolata dividendo le nuove lume interno dai precedenti lume. differenze tra i gruppi sono stati valutati mediante analisi della varianza ad una via (ANOVA) con il test post-hoc di Bonferroni. p <0.01. Le barre di errore sono la deviazione standard (SD). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Supplementare File 1: Schema Illustrazione della procedura chirurgica. Una incisione verticale lungo la linea inguinale viene eseguita sul ratto donatore, esponendo la vena epigastrica inferiore. Il flusso di sangue viene arrestato con due fascette di micro, e un segmento di vena lunga 0,5-1,0 cm è raccolto. Nel ratto destinatario, una incisione femorale mediana viene eseguita, esponendo la vena femorale, arteria, e dei nervi. Dopo il serraggio l'arteria femorale, un segmento recipiente viene rimosso e sostituito con l'innesto della vena raccolto. Clicca qui per vedere supplementare File 1 (o tasto destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Questo video dimostra una vena modello di interposizione di ratto per indagare perdita del trapianto vena e per consentire l'esplorazione dei processi patologici sottostanti e la sperimentazione di nuovi farmaci o opzioni terapeutiche.
L'anestesia è un aspetto cruciale delle procedure chirurgiche. Si raccomanda un sistema per anestesia per inalazione continua, in quanto questo è un metodo semplice e sicuro, in particolare durante operazioni prolungate. Questo può essere di grande importanza durante la fase di addestramento, quando l'operazione richiede più di 1 ora.
Per quanto riguarda la procedura chirurgica, è fondamentale non danneggiare l'innesto della vena durante la raccolta e l'impianto 17. Presa l'avventizia della nave può evitare di danneggiare l'innesto della vena ed evitare la successiva formazione di trombi e il fallimento del trapianto. Graft pervietà può essere determinato subito dopo la vena costruzione trapianto attraverso l'osservazione del flusso sanguigno e della pulsazione nel trapianto vena o distal arteria, così come attraverso duplex ecografia.
Un altro aspetto critico del procedimento è quello di evitare l'eccessiva distensione dell'innesto vena. l'esposizione improvvisa della vena trapianto al sistema di pressione arteriosa porta ad una maggiore tensione della parete, conseguente sovra-distensione, e cambiamenti nel modello di flusso. Queste sono le fonti di trombosi, insufficienza anastomotica, e il fallimento del trapianto precoce. Sostenere l'innesto della vena con colla di fibrina può prevenire ballooning incontrollato e proteggere l'intima e dei media dalla distruzione meccanica. Copertine collagene riassorbibili sono un'alternativa alla colla di fibrina e possono essere utilizzati come perivenosa copre 18.
La fase più critica all'interno di questo protocollo è senza dubbio l'anastomosi tra l'innesto vena e l'arteria. Bisogna fare attenzione a non forare le due pareti del recipiente, come questo porterà al restringimento delle anastomosi, che può causare un'usura prematura del trapianto. Inoltre, attentio specialen deve essere pagato alla localizzazione di punti di sutura. La congruenza delle posizioni sutura nella arteria e vena assicura pervietà e previene l'insufficienza. Per facilitare ciò, suture possono essere eseguite nell'ordine mostrato nella Figura 1D.
Il grado di difficoltà tecnica può essere visto come una limitazione della tecnica, perché un novizio deve prima acquisire familiarità con l'apparecchiatura microchirurgico e le piccole dimensioni delle strutture anatomiche. Tuttavia, altri modelli utilizzati presentano le stesse difficoltà, e crediamo che questo video vi aiuterà i chirurghi meno esperti di padroneggiare questa tecnica entro un breve periodo di tempo.
Numerosi piccoli modelli animali per fallimento del trapianto venoso sono stati descritti in letteratura. Tuttavia, la maggior parte dei modelli forniscono solo piccole quantità di tessuto per l'analisi 13. Un vantaggio di questo metodo è comparativamente grande quantità di tessuto che può essere ottenuto. Un innesto può essere diviso in più parti unnd utilizzato per diversi dosaggi, riducendo così il numero di animali sperimentali necessarie.
I recenti progressi nella tecnologia nucleasi zinc-finger consentito la generazione di topi knockout 19. Selezionando adatti ratti knock-out, la perdita di pervietà del trapianto può essere studiata in diverse condizioni di malattia. Ad esempio, i topi knockout renina possono essere utilizzati per studiare l'ipertensione 20. Questi sfondi genetiche possono essere combinati con questo modello animale per raccogliere informazioni sui meccanismi di vena fallimento del trapianto in contesti diversi o sull'impatto di alcuni geni nello sviluppo di iperplasia myointima.
In conclusione, il modello descritto in questo video è riproducibile, economico e di facile esecuzione, e può essere stabilito in modo rapido e affidabile. Myointima iperplasia, che è la principale causa di insufficienza venosa graft, sviluppata rapidamente nel corso di quattro settimane, con conseguente obliterazione del lume progressiva. trattamento testato con successoopzioni di questo modello può essere ulteriormente confermati in grandi modelli animali.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano Christiane Pahrmann per la sua assistenza tecnica. Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Stiftung fuer Herzforschung (F / 28/14). DW è stato sostenuto dal viaggio premio dalla International Society for Heart Lung Transplantation. TD ha ricevuto il Else Kröner eccellenza Stipend dal Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_EKES.04). SS ha ricevuto borse di ricerca dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; DE2133 / 2-1, TD e SCHR992 / 3- 1, SCHR992 / 4-1, SS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat LEW/Crl | Charles River | Stock number 004 | |
| Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk |
Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan | NBPR rat number 0299 | http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/ |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | AbbVie | PZN 10182054 Art.Nr.: B506 | Isoflurane |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| hair removal creme | Rufin cosmetic | 27618 | |
| Povidone-Iodine | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Heparin | Rotexmedica | PZN: 3862340 | 25.000 I.E./ ml |
| Xylocain 1% | AstraZeneca | PZN: 1137907 | Lidocain |
| EVICEL | J&J Med.Ethicon Biosur | PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE | fibrin glue |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system | VisualSonics | duplex sonography | |
| Ecogel 100 ultrasound gel | Eco-med | 30GB | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth | L-8220 | |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Xenogen Ivis 200 | Perkin Elmer | bioluminescence imaging | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Resorcine-Fuchsine Weigert | Waldeck | 2.00E-30 | Trichrome staining |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 | |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
References
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