Introduction
doenças das artérias coronárias e suas complicações estão entre as principais causas de morte em todo o mundo. estratégias terapêuticas atuais concentrar em restabelecer o fluxo de sangue, seja através da dilatação do vaso estreitados ou através da criação de um bypass. Revascularização do miocárdio (RM) utilizando enxertos venosos foi descrita pela primeira vez em 1968 e tem sido aperfeiçoado ao longo dos anos. Para além da revascularização da artéria descendente anterior coronária, condutas de veia safena são mais comumente usados 1. No entanto, enxerto permeabilidade continua a ser o calcanhar de Aquiles da veia safena (SVG). Um ano após a cirurgia, enxerto de permeabilidade é de 85%, caindo para 61% após dez anos 2,3. Revelando os mecanismos fisiopatológicos e as causas da perda de permeabilidade SVG é, portanto, uma tarefa importante.
Este vídeo demonstra um modelo de interposição da veia de ratos para investigar a perda de enxerto de veia. Os objetivos gerais deste método são para explorar a pathobiological subjacentee processos -physiological durante a progressão da doença e desenvolver um modelo adequado para drogas ou testes opção terapêutica. Transplantando a veia epigástrica superficial no sistema arterial, este modelo imita de perto a situação clínica de revascularização do miocárdio. O trauma cirúrgico, isquemia e estresse da parede são gatilhos importantes de alterações vasculares patológicos e são imitadas no modelo descrito.
Diferentes modelos e espécies estão disponíveis para investigar a perda de permeabilidade do enxerto venoso. Grandes modelos animais, como porcos, ovelhas 4 5 6, cães e macacos 7, assemelham-se vaso humano e estruturas anatômicas e, assim, permitir estratégias terapêuticas complexas, como implante de stent de bypass ou novas técnicas cirúrgicas, a serem testadas 8. No entanto, especial habitação, equipamento e pessoal são necessários. Além disso, custos elevados e à necessidade de um anestesista adicional durante a cirurgia impedem a sua aplicação mais ampla. Smtodos os animais, incluindo ratos, são fáceis de manusear, não necessitam de alojamento especial, e têm custos controláveis. Em comparação com os modelos de rato 9,10, modelos de ratos têm a vantagem de uma melhor operacionalidade e, portanto, menor variabilidade no resultado. Os ratos são fisiológica e geneticamente mais semelhantes aos seres humanos do que os ratos 11,12. Além disso, a maioria dos camundongos selvagens só desenvolver myointima limitada 13, que fazem modelos de ratos propensos a erros do tipo II. A histologia das veias principais do rato, tal como a veia cava inferior, consiste apenas de algumas camadas de células e torna difícil a avaliação precoce 13. Uma outra desvantagem é a pequena quantidade de tecido disponível para análises subsequentes após a recuperação do enxerto.
O modelo descrito neste vídeo é reprodutível, de baixo custo, e fácil de realizar, e pode ser estabelecida rapidamente e de forma fiável. É especialmente apropriado para a avaliação de agentes terapêuticos experimentais caros, tais como vectores viraispara terapia génica, de uma forma económica.
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Protocol
Os animais receberam cuidado humano de acordo com o Guia para os Princípios de Animais de Laboratório, preparados pelo Instituto de Recursos Animais de laboratório e publicado pelo National Institutes of Health. Todos os protocolos com animais foram aprovados pela autoridade local responsável ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Departamento da Saúde e Defesa do Consumidor) Hamburg").
1. Animal Care
- Obter ratos ratos Lewis (LEW / CRL) e Rosa / ratos transgênicos luciferase-LEW pesando 300-350 g do Instituto de Animais de Laboratório.
- Manter os ratos sob condições convencionais em armários ventilados e alimentá-los ração e água ad libitum autoclavado.
- Executar um transplante de enxerto utilizando os / luciferase-LEW ratos transgênicos ROSA como os doadores e os singênicos ratos LEW / CRL como os destinatários.
2. Preparação do animal doador
- Use um indutocâmara de ionização para anestesiar um rato com isoflurano (2,5-3%).
- Colocar o rato na sua parte de trás e manter a anestesia com uma máscara que cobre o nariz e a boca. Verifique se há profundidade suficiente de anestesia por beliscar as patas traseiras e verificar a ausência de reflexos. Aplique um pouco de pomada veterinário para os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
- Espalhe as pernas traseiras e fixar sua posição usando fita.
- Raspar o cabelo inguinal com um aparador de pêlos e desinfectar a área inteira usando iodopovidona seguido por 80% de etanol. Repita o passo desinfecção duas vezes.
NOTA: A área cirúrgica, gazes e instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados. Manter um campo esterilizado durante todo o procedimento e desgaste de uso único, luvas cirúrgicas estéreis, máscaras e bonés. - Sob um microscópio, realizar uma incisão vertical ao longo das inguinalis linea. Use duas pinças para separar delicadamente os tecidos subcutâneos e expor a veia epigástrica superficial de sua origin na veia femoral. Cuidadosamente isolar a veia epigástrica superficial dos tecidos circundantes.
- Parar o fluxo de sangue na veia epigástrica superficial usando dois micro grampos.
- Colheita um segmento de cerca de 0,5 a 1 cm da veia levantando cuidadosamente da veia isolado com uma pinça e o corte através do vaso com microtesouras. Deixar as micro grampos sobre o coto recipiente para evitar a perda de sangue. Coloque o pedaço removido da veia em gaze estéril. Cuidadosamente colocar uma agulha 30 G de uma extremidade interior da veia colhida e lavar o reactor com heparina (50 unidades / ml).
NOTA: Pega a veia com cuidado e evitar danos durante a elevação, corte e descarga. Certifique-se de lavar o enxerto com a quantidade adequada de heparina. - Manter o segmento do vaso de lidocaína a 1% em gelo até que o transplante para o receptor de rato para prevenir um espasmo navio.
- Eutanásia do rato doador, aumentando a anestesia com isoflurano a 5%. Depois de 2-3 min, open abdômen ao longo da linha alba, cortar através do diafragma, e remover o coração parar circulação.
3. Preparação do Rato Destinatário
- Anestesiar ratos e fixar o recipiente da mesma maneira como o rato dador.
- Raspar o lado medial das pernas com um aparador de pêlos e desinfectar três vezes usando iodopovidona e 80% de etanol.
- Monitorar a profundidade da anestesia e garantir que ele é suficiente, verificando a ausência de reflexos quando beliscar as patas traseiras.
- Realizar uma incisão femoral médio do joelho até a dobra inguinal. Sob um microscópio, utilizar 2 pinça para separar a artéria femoral a partir dos seus arredores.
- Use micro grampos para parar o fluxo de sangue. Coloque a braçadeira proximal em primeiro lugar, seguido pela pinça distal.
- Corte um pequeno segmento da artéria femoral apertada com microtesoura e descartá-lo. Encurtar o coto arterial restante com microtesoura, criando uma lacuna que é1-2 mm maior do que o enxerto de veia. Lave o coto arterial com heparina usando uma agulha 30 G.
NOTA: Se a adventícia sai ligeiramente para além do coto embarcação, utilize uma pinça para puxá-lo um pouco sobre a extremidade do navio e retirar um pedaço. - Coloque a veia colhida a partir do passo 2.8 entre os cotos arteriais e ajustar o comprimento de modo que ele se encaixa adequadamente na abertura. Note-se a direcção da veia.
- Realização da anastomose proximal primeiro usando uma sutura 10-0 prolene. Realizar pontos individuais na ordem mostrada (Figura 1D). Comece com uma sutura em cada lado lateral antes de adicionar mais três suturas no lado ventral. Em seguida, colocam três pontos no lado dorsal do vaso para completar a anastomose.
- Ligar os vasos distais, com o enxerto utilizando a mesma técnica para a anastomose proximal descrito no passo 3.8. Mais uma vez, comece com uma sutura em cada lado lateral, e em seguida, coloque três suturas na sid ventralE e o lado dorsal.
- Carregar duas seringas de 1 ml com componente de cola de fibrina 1 e 2. Levante cuidadosamente o enxerto com uma pinça e soltar cerca de 100 mL de componente cola de fibrina 1 sob o enxerto, seguida pela componente 2.
NOTA: Certifique-se de que os componentes 1 e 2 são aplicados na proporção de 1: 1. - Coloque o enxerto na sua posição para trás e soltar um adicional de 100 ul de componentes 1 e 2 em cima do enxerto. Certifique-se de que a cola abrange tanto o enxerto e anastomose, a fim de evitar a insuficiência da anastomose e sobre-distensão do enxerto de veia.
- abrir a pinça distai cuidadosamente, seguido pela proximal.
- Confirmar uma cirurgia bem-sucedida verificando o pulso visível na veia transplantada e artéria distal do enxerto.
- Remover a colagem excessiva, o que impede o fechamento da pele. Utilize uma pinça para levantar a cola curada e remover o excesso com microtesouras. Feche as camadas da pele com 5-0 prolene.
- Injetar 4-5 mg / kg carprofeno via subcutânea antes de permitir que o rato para acordar. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Manter o animal em uma única gaiola até que esteja totalmente recuperado.
- Adicionar Metamizolo à água de beber (50 mg Metamizolo por 100 ml) na forma de medicação para a dor para os 3 dias seguintes e monitorar o animal diariamente.
4. Duplex ultra-sonografia
NOTA: Use sonografia duxplex para visualizar o fluxo sanguíneo não invasivo em ratos 14.
- Anestesiar uma ratazana numa câmara de indução (isoflurano a 2%). Coloque o rato sobre as suas costas e manter a anestesia com uma máscara cobrindo o nariz.
- Use cortadores de cabelo e creme de depilação para remover os pêlos ao redor da área da coxa.
- Aplique o gel de ultra-som na coxa. Certifique-se de que não existem bolhas de ar. Adquirir imagens ultra-sonografia duplex usando um MS 400 transdutor (frequência central: 30 MHz) com uma taxa de quadros de 230-400 frames / seg.
5. O exame histopatológico
NOTA: Colheita e manchar o navio com coloração de Masson para análises morfométricas 15.
- Corrigir o vaso colhida em 4% de paraformaldeído durante a noite e desidratar em concentrações crescentes de etanol. Incorporar a amostra em parafina e corte-o em 5 mm fatias grossas usando um micrótomo.
NOTA: O paraformaldeído é tóxico e deve ser manuseada com cuidado especial. - Desparafinar os slides antes da coloração-los com tricromo solução de coloração. Desidratar as lâminas coradas, limpá-las com xileno, e montá-los no meio de montagem. Depois de secar os slides, ver as amostras com um microscópio.
6. A bioluminescência Imagem (BLI)
NOTA: O enxerto pós-operatória foi monitorado ao longo do tempo in vivo através da medição do sinal bioluminescente 16.
- Dissolve-se 1 g de sal de potássio de D-luciferina em 22 ml de PBS e injectada por via intraperitoneal em ratos (375 mg / kg de peso corporal). Esperar 15 min para a luciferina a circular no animal.
- Colocar o rato dentro de um sistema bioluminescente quantificação em tempo real e aceder ao sinal de bioluminescência.
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Representative Results
O modelo de interposição da veia rato é adequada para estudar o desenvolvimento de hiperplasia myointima e fracasso do enxerto venoso. Animais recuperar bem da cirurgia e mostrar excelente condição física pós-operação. A Figura 1 mostra os passos chave cirúrgicos. Após a incisão na pele ao longo das inguinalis linea, a veia superficial epigástrica e artéria femoral são identificados (Figura 1A). Colheita do enxerto deve ser realizada com cuidado, sem danificar o enxerto (Figura 1B), pois isso pode levar à falência precoce do enxerto e perda de permeabilidade. Depois de posicionar o enxerto no animal receptor (Figura 1C), pontos de anastomose são realizados na ordem mostrada na Figura 1D. O enxerto de interposição venosa concluída aparece pálido (Figura 1E) e deve tornar-se vermelha e mostrar pulsação após a reperfusão (Figura 1F).
Os Integrati sucesso na da veia para a desobstrução da artéria femoral e do enxerto após o transplante pode ser confirmada não invasiva-duplex utilizando sonografia (Figura 2A). Ao transplantar a veia de um rato Luc-positiva em um rato Luc-negativo singeneicos, imagiologia bioluminescente pode ser utilizado para monitorar a presença de enxerto ao longo do tempo (Figura 2B).
Myointima hiperplasia desenvolve progressivamente no enxerto ao longo do tempo. Coloração histológica com Masson demonstra myointima formação dentro da lâmina elástica interna (Figura 2C). O cálculo da obliteração luminal, (dividindo a área da secção transversal do lúmen pela área da lâmina elástica interna) revelou uma perda gradual de perviedade do enxerto a partir do dia 7 ao dia 28 pós-cirurgia, confirmando assim a dinâmica reprodutíveis de hiperplasia myointima neste modelo de rato (Figura 2D).
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Figura 1: Esquema detalhada do procedimento cirúrgico. (A) A anatomia da região inguinal. (B) de colheita do enxerto de veia epigástrica superficial. (C) A colocação do enxerto de veia entre os cotos arteriais do animal receptor. (D) Ordem de pontos de anastomose. (E) Site após a construção do enxerto venoso. (F) o local após a reperfusão do enxerto de interposição venosa. Setas pretas marcar a veia superficial epigástrica. A barra de escala = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização do Modelo Animal. (A) Duplex ultra-sonografia de um interposição venosa enxertar immed iately após o transplante (0d) e 28 dias pós-operatório (28 dias). (B) BLI de Luc-positivos enxertos transplantados para ratos Luc-negativos em 0 dias e 28 dias após a cirurgia. (C) secções transversais de enxerto representativos colhidas após dias 7, 14, 21 e 28 e corados com tricrômico de Masson. (Painel superior: a barra de escala = 400 mm; Painel inferior: a barra de escala = 100 mm) (D) obliteração luminal em percentagem é calculada dividindo-se os novos lúmen interno das ex-lúmen. diferenças entre os grupos foram avaliados através da análise de uma via de variância (ANOVA) com o teste post-hoc de Bonferroni. p <0,01. As barras de erro são o desvio padrão (SD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Suplementar Arquivo 1: Esquema Ilustração do procedimento cirúrgico. Uma incisão vertical ao longo da inguinalis linea é executada no rato doador, expor a veia epigástrica inferior. O fluxo de sangue é interrompido com dois grampos de micro, e um segmento de veia 0,5-1,0 cm de comprimento é colhida. No rato destinatário, uma incisão femoral mediana é realizada, expondo a veia femoral, artéria e nervo. Depois de se fixar a artéria femoral, um segmento de vaso é removido e substituído pelo enxerto de veia colhida. Por favor clique aqui para ver Suplementar Arquivo 1 (ou clique com o botão direito para baixar).
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Discussion
Este vídeo demonstra um modelo de interposição da veia de ratos para investigar a perda de enxerto de veia e para permitir a exploração dos processos patológicos subjacentes e teste de novas drogas ou opções terapêuticas.
A anestesia é um aspecto crucial de procedimentos cirúrgicos. Um sistema de anestesia por inalação contínua é recomendado, pois este é um método seguro e fácil, especialmente durante operações prolongadas. Isto pode ser de grande importância durante a fase de treinamento, quando a operação demora mais de 1 hora.
Com relação ao procedimento cirúrgico, é fundamental para não danificar o enxerto de veia durante a colheita ea implantação 17. Segurando a adventícia do vaso pode evitar danos ao enxerto de veia e evitar a formação de trombos e posterior falência do enxerto. Graft permeabilidade pode ser determinado imediatamente após veia construção do enxerto através da observação do fluxo sanguíneo e da pulsação no enxerto de veia ou distal artéria, bem como através de duplex ultra-sonografia.
Outro aspecto crítico do processo é para evitar a sobre-distensão da veia de enxerto. súbita exposição do enxerto venoso para o sistema de pressão arterial leva a um aumento da tensão da parede, após o excesso de distensão, e as mudanças no padrão de fluxo. Estes são fontes de trombose, insuficiência anastomótica e falha precoce do enxerto. Apoiar o enxerto de veia com cola de fibrina pode impedir balão descontrolado e proteger a íntima e média da destruição mecânica. Coberturas de colagénio absorvíveis são uma alternativa à cola de fibrina e pode ser usado como perivenosa cobre 18.
O passo mais crítico no âmbito deste protocolo é, sem dúvida, a anastomose entre o enxerto de veia ea artéria. Deve ser tomado cuidado para não furar as duas paredes do recipiente, como isso vai levar ao estreitamento da anastomose, o que pode resultar em falha prematura do enxerto. Além disso, Attentio especialn deve ser pago para a localização de suturas. Congruência das posições de sutura na artéria e veia garante a permeabilidade do enxerto e impede insuficiência. Para facilitar este processo, as suturas podem ser realizados na ordem mostrada na Figura 1D.
O grau de dificuldade técnica pode ser visto como uma limitação da técnica, porque um principiante deve primeiro se tornar familiar com o equipamento microcirúrgico e os pequenos tamanhos de estruturas anatómicas. No entanto, outros modelos utilizados apresentam as mesmas dificuldades, e nós acreditamos que este vídeo vai ajudar cirurgiões novatos para dominar esta técnica dentro de um curto espaço de tempo.
Numerosas pequenas modelos animais de insuficiência enxerto venoso foram descritos na literatura. No entanto, a maioria dos modelos só fornecem quantidades muito pequenas de tecido para análise 13. Uma vantagem deste método é a relativamente grande quantidade de tecido que pode ser obtido. Um enxerto pode ser dividida em várias partes de umND utilizados para ensaios diferentes, reduzindo assim o número de animais experimentais necessários.
Os recentes avanços na tecnologia de nuclease zinc-finger permitiu a geração de ratos knockout 19. Ao selecionar ratos knock-out adequados, perda de permeabilidade do enxerto pode ser estudada em diferentes condições de doença. Por exemplo, ratos knockout de renina pode ser utilizada para estudar a hipertensão 20. Estas origens genéticas pode ser combinado com este modelo animal para recolher informações sobre os mecanismos de falha de enxerto de veia em ambientes diferentes ou sobre o impacto de certos genes no desenvolvimento de hiperplasia myointima.
Em conclusão, o modelo descrito neste vídeo é reprodutível, de baixo custo, e fácil de realizar, e pode ser estabelecida rapidamente e de forma fiável. Myointima hiperplasia, que é a principal causa de falha do enxerto venoso, desenvolveu-se rapidamente ao longo de quatro semanas, resultando em obliteração luminal progressiva. tratamento testado com sucessoopções deste modelo pode ser ainda confirmada em modelos animais de grande porte.
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Acknowledgments
Os autores agradecem Christiane Pahrmann por sua assistência técnica. Este estudo foi financiado pela Deutsche Stiftung fuer Herzforschung (F / 28/14). DW foi apoiado pelo prêmio de viagem da Sociedade Internacional de Transplante Cardíaco. TD recebeu o Else Kröner Excellence Bolsa do Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_EKES.04). SS recebeu bolsas de pesquisa do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; DE2133 / 2-1, TD e SCHR992 / 3- 1, SCHR992 / 4-1, SS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat LEW/Crl | Charles River | Stock number 004 | |
| Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk |
Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan | NBPR rat number 0299 | http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/ |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | AbbVie | PZN 10182054 Art.Nr.: B506 | Isoflurane |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| hair removal creme | Rufin cosmetic | 27618 | |
| Povidone-Iodine | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Heparin | Rotexmedica | PZN: 3862340 | 25.000 I.E./ ml |
| Xylocain 1% | AstraZeneca | PZN: 1137907 | Lidocain |
| EVICEL | J&J Med.Ethicon Biosur | PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE | fibrin glue |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system | VisualSonics | duplex sonography | |
| Ecogel 100 ultrasound gel | Eco-med | 30GB | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth | L-8220 | |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Xenogen Ivis 200 | Perkin Elmer | bioluminescence imaging | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Resorcine-Fuchsine Weigert | Waldeck | 2.00E-30 | Trichrome staining |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 | |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
References
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