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Bioengineering

La expansión de nanoestructurada Los sustratos usando la técnica de la puntada para Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

doi: 10.3791/54840 Published: December 8, 2016

Protocol

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1. La replicación de PDMS moldes de un molde de EBL

  1. Fabricar molde de silicona 29
    1. capa de la vuelta 200 l polimetacrilato de metilo (PMMA) solución sobre un sustrato de 1 × 1 cm de silicio (Si) a 2.500 rpm durante 1 min para formar una película delgada.
    2. Hornear la película de PMMA en el sustrato de Si a 180 ° C durante 2 min.
    3. Escribir la nanopattern diseñado sobre la película de PMMA mediante el uso de un haz de electrones enfocado a una dosis área de 300 mu c / cm 2.
    4. Desarrollar la nanopattern PMMA en el revelador de 80 seg.
    5. Depositar el nanopattern PMMA con una capa de níquel de 50 nm de espesor utilizando un evaporador de haz de electrones a un voltaje de salida de 10 kV, corriente de emisión de 0,5 mA y una velocidad de deposición de 0,5 Å / s.
    6. Levante la parte PMMA en 20 removedor ml a 80 ° C durante 20 minutos.
    7. etch iones reactivos (RIE) la nanopattern en el sustrato de Si para obtener un molde de Si de la profundidad deseada.
      NOTA: Mezclas de gas de TetRafluoromethane (CF 4) / oxígeno (O 2) (90% / 10%) con una potencia de plasma de acoplamiento inductivo (ICP) de 400 W de potencia y RIE de 150 W se utiliza para grabar sustrato de Si a una profundidad de 560 nm.
  2. Si molde silaniza
    1. Ponga un cubreobjetos de vidrio y el molde de Si en un 100 mm placa de Petri PS y transferirlos en un desecador de vidrio situado en una campana de humos.
    2. Caída de 10 l 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sobre el cubreobjetos.
      Precaución: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane puede causar la corrosión de la piel y lesiones oculares graves. Use equipo de protección personal adecuado (PPE).
    3. Cubrir la placa de Petri parcialmente.
    4. Mantenga el desecador a vacío durante 5 horas en una campana extractora para completar la silanización del molde Si.
  3. Preparar PDMS prepolímero
    1. Pesar 10 g de resina de PDMS y 1,05 g de agente de curado en un recipiente pesado desechable.
    2. Mezclar el prepolímero PDMS a fondo mediante el uso de una cuchara de plástico.
    3. Desgasificar la prepolímero PDMS en un desecador de plástico al vacío durante unos 20 minutos hasta que se observa una mezcla clara.
  4. Replicar moldes de PDMS
    1. Ponga el molde Si silanizada en una placa de Petri 60 mm.
    2. Verter el prepolímero PDMS sobre el molde de Si en la placa de Petri.
    3. Coloque la placa de Petri en un desecador de plástico y desgasificar durante aproximadamente 10 minutos hasta que todas las burbujas desaparecen.
    4. La transferencia de la placa de Petri con una placa calefactora y curar el prepolímero PDMS a 70 ° C durante 4 horas.
    5. Despegar el molde de PDMS del molde Si cuidadosamente usando pinzas.
      NOTA: moldes de PDMS se pueden almacenar en condiciones ambientales durante hasta una semana. Después de curar, hay algunas moléculas de resina PDMS no reticuladas y agente de curado residual en los moldes de PDMS 30. Las moléculas de bajo peso molecular se difunden gradualmente y se acumulan en la superficie con el tiempo. Esto afecta a las propiedades topográficas y mecánicas de la superficie PDMS 31. el DIFfusión no es significativo dentro de una semana.

2. Costura de PDMS moldes en una grande, solo molde

  1. Preparar moldes múltiples PDMS repitiendo el paso 1.4.
    NOTA: Pesar misma cantidad de mezcla de PDMS cada vez para obtener moldes de PDMS de igual espesor.
  2. Determinar la orientación de anisotrópicos PDMS nanopatrones como nanogratings bajo un microscopio óptico y se marca en la parte posterior de los moldes de PDMS con un rotulador.
    NOTA: No es necesario marcar la orientación de nanotopografía isotrópico como nanopilares.
  3. Limpiar un sustrato de Si con etanol en una campana de humos y se seca con aire comprimido.
  4. Se quita las áreas sin patrón de cada molde de PDMS con una cuchilla.
    NOTA: Para obtener los moldes de PDMS que serán colocados en la periferia del molde cosido, sólo las áreas no pautadas en contacto con otras personas deben ser recortados.
  5. Coloque el molde de PDMS adornado con la nanopattern boca abajo enel espejo lateral del sustrato de Si y luego se suman otros moldes cerca pero sin tocar el molde (s) de los alrededores.
  6. Preparar una capa adhesiva PDMS
    1. Reparto de 1 g desgasifica PDMS prepolímero (resina de PDMS y curado relación de agente: 10: 1,05) en un portaobjetos de vidrio limpio (7,5 cm x 2,5 cm) para formar una capa de espesor de 0,5 mm.
    2. Hornear la capa de PDMS a 100 ° C sobre una placa caliente durante 3-5 min. Use una aguja a tocar la capa y asegurar que la capa está parcialmente pero no completamente curada.
      NOTA: PDMS parcialmente curado no puede fluir como prepolímero de PDMS sin curar, pero es pegajoso en comparación con PDMS curados.
  7. Coloque la capa de PDMS en la parte trasera de moldes de PDMS alineados e invertir rápidamente esta asamblea y transferirlo a la zona de cocción.
  8. Aplicar una fuerza de compresión (5 kPa) usando un bloque de metal en la parte superior del conjunto para asegurar un buen contacto entre la capa de adhesivo PDMS y la parte posterior de los moldes de PDMS, y curar la capa de adhesivo PDMS a 100 ° C durante 1 hr. <br /> NOTA: Ajuste cuidadosamente la posición del bloque de metal para evitar la inclinación del conjunto.
  9. Retire el bloque de metal y retire la única, del molde de PDMS cosido desde el sustrato de Si.

3. Generación de un molde principal en PS Sustratos

Nota: El molde de PDMS cosido inmovilizada sobre un portaobjetos de vidrio se puede utilizar para generar un molde maestro en una placa de PS o una película delgada PS, de la que se pueden producir de trabajo sustratos nanoestructurada.

  1. Generar un molde maestro en una placa PS
    1. Preparar una placa PS
      1. Se secan los gránulos PS en un horno de vacío a 80 ° C durante dos días.
      2. Precalentar una máquina de prensa a 230 ° C.
      3. Montar una placa de aluminio, una lámina de politetrafluoroetileno (PTFE) y el separador de aluminio en un orden de abajo hacia arriba.
      4. Carga de 3,5 g de gránulos de PS en el separador de aluminio con una abertura cuadrada de 3 cm (L) x 3 cm (W) x 0,3 cm (H).
        NOTA: El separador es de aproximadamente 0.1 cm más gruesos que los moldes de PDMS, y por lo tanto el sustrato final nanoestructurada PS es de unos 0,1 cm de espesor.
      5. Coloque otra hoja de PTFE y luego otra placa de aluminio en el separador de aluminio.
      6. Coloque el conjunto de la máquina de la prensa.
      7. Precalentar los pellets PS a 230 ° C durante 30 minutos.
      8. Aplicar una presión de compresión (0,1 MPa) sobre el conjunto durante 5 min.
      9. Liberar la presión y vuelva a aplicar una presión de compresión de 0,5 MPa en el conjunto.
      10. Repita el paso 3.1.1.9 con un aumento de presión de 0,5 MPa hasta que la presión deseable de 1,5 MPa se alcanza.
      11. Apague el calentador de la máquina de la prensa y enfriarlo por debajo de 70 ° C a una presión constante de 1,5 MPa.
      12. Tome el montaje y almacenar la placa PS en un horno de vacío a 80 ° C para evitar que la humedad vuelva a entrar en la placa PS.
    2. Nano-impresión del molde de PDMS cosido en la placa PS
      1. Coloque la placa de PS en un separador de aluminiosituado en una de 3 pulgadas oblea de Si.
        NOTA: Las dimensiones interiores del espaciador son los mismos que los de la placa de PS de modo que la placa de PS encaja perfectamente en el espaciador.
      2. Calentar la placa de PS en una placa caliente a 250 ° C durante 30 min.
      3. Ponga el molde de PDMS cosida con nanopatrones boca abajo sobre la placa PS fundido.
        NOTA: Un lado del molde de PDMS se pone en contacto con la superficie de la placa de PS primero y otro lado se disminuye gradualmente en contacto con la superficie de PS para evitar la formación de burbujas de aire en la interfase.
        Precaución: La superficie de la placa de cocción está caliente. Use thermogloves durante el proceso de nanoimpresión.
      4. Colocar una placa de aluminio en el portaobjetos de vidrio del molde de PDMS cosido.
      5. Aplicar una presión de compresión (12,5 kPa) mediante el uso de bloques de metal en la placa de aluminio y esperar 3 minutos.
        NOTA: Asegúrese de que la placa de aluminio no está inclinada.
      6. Levante y vuelva a colocar el bloque de metal de la placa de aluminio y yoaumentar la cant presión de compresión de 25 kPa.
      7. Repita el paso 3.1.2.6 con la presión aumentó a 50 kPa.
        NOTA: Este paso es eliminar el aire atrapado entre el molde de PDMS y la placa PS.
      8. Mantener la temperatura de la zona de cocción entre 240 y 250 ° C bajo la presión constante de 50 kPa durante 15 min.
      9. Apague la zona de cocción y enfriamiento toda la instalación.
        NOTA: Un ventilador puede ser usado para acelerar el proceso de enfriamiento.
      10. Retire los bloques de metal después de que la temperatura sea inferior a 50 ° C, y con cuidado retire el molde de PDMS cosido de la placa PS.
        NOTA: El sustrato PS tiene las nanopatrones inversa y se puede utilizar como un molde maestro para producir PDMS de trabajo sustratos.
  2. Generar un molde maestro en una película delgada PS
    1. Preparar una película delgada PS
      1. Disolver 1 g PS en 10 ml de tolueno en una campana de humos.
        Precaución: El tolueno puede causar la piel irritation y lesiones oculares graves, y pueden causar daños en los órganos tras exposiciones prolongadas o repetidas. Use el EPP apropiado.
      2. Spin-capa de solución de PS 1 ml en un 2-en forma de disco a 2.500 rpm durante 1 min para formar ~ 1 de película delgada m de espesor PS.
      3. Se evapora el tolueno de la película mediante el establecimiento de la película PS en oblea de Si en una campana de humos durante 3 días.
      4. Recocer la película delgada PS en un horno de vacío a 80 ° C durante la noche.
    2. Nano-impresión del molde de PDMS en una película delgada PS
      1. Ponga el molde de PDMS cosida con nanotopografía boca abajo en la película delgada PS, que se fija sobre una placa caliente.
      2. Aplicar una presión de compresión de 12 kPa en el molde de PDMS mediante el uso de bloques de metal en el lado del vidrio del molde de PDMS.
      3. Aumentar la temperatura de la placa caliente a 180 ° C y mantener durante 15 min.
        Precaución: La película PS fundido puede funcionar como un lubricante. Prestar atención a evitar que los bloques de metal se deslice fuera.
      4. Apague la zona de coccióny enfriar toda la instalación.
        NOTA: Un ventilador puede ser usado para acelerar el proceso de enfriamiento.
      5. Retire los bloques de metal después de que la temperatura desciende por debajo de 50 ° C, y con cuidado retire el molde de PDMS cosido de la película PS.
        NOTA: La película nanoestructurada PS servirá como un molde maestro para producir sustratos PDMS de trabajo.

4. Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

Nota: Las células epiteliales humanas se cultivan en las nanotopographies representativos que demuestren la modulación nanotopographical de difusión celular.

  1. Reparto de PDMS sustratos de trabajo del molde maestro generada a partir de cualquiera Paso 3.1 o 3.2 dependiendo de la aplicación.
  2. Con un punzón de arco de acero hueco, cortar los PDMS sustratos nanoestructurada en discos para adaptarse a la configuración de una placa de múltiples pocillos específica (por ejemplo, la placa, de 24 pocillos).
  3. Utilizar pinzas para colocar los discos de PDMS en los pocillos ofa placa de múltiples pocillos.
  4. Esterilizar los sustratos PDMS mediante el uso de 70% de etanol y después de la exposición UV, cada uno por 30 min.
  5. Lavar los sustratos PDMS con 1x tampón fosfato salino (PBS) tres veces.
  6. Escudo el PDMS sustratos con proteína de la matriz extracelular (es decir, 20 mg / ml de fibronectina) durante 30 min a temperatura ambiente.
  7. Enjuague el PDMS sustratos tres veces con PBS estéril, cada uno de 5 min.
  8. Suspender A549 de células de cáncer de pulmón humano en un medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal 10% y contar las células usando un hemocitómetro.
  9. Placa de las células a una densidad de siembra de 2.000 células / cm 2 en los sustratos y cultura los PDMS a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 durante un día.
  10. Se lavan las células con PBS tres veces.
  11. Fijar las células en una mezcla de 4% de paraformaldehído y glutaraldehído al 2% en PBS durante 4 hr y deshidratar las células usando un CO 2 po críticosecador de int para la digitalización de la observación microscópica electrónica 29.
    Precaución: El paraformaldehído y glutaraldehído pueden causar quemaduras en la piel y lesiones oculares graves. Operar en una campana química y usar el EPP apropiado.

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Representative Results

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La técnica de la puntada puede generar una gran superficie de sustratos nanoestructurada con alta fidelidad. La Figura 1a y 1b mostrar la gran área de nanopatrones transferidas desde el molde PDMS cosido a la placa de PS y PS película delgada sobre un sustrato de Si, respectivamente. La comparación entre el original molde escrito-EBL (Figura 1c) y el PDMS finales de trabajo de sustrato (Figura 1d) confirma que los nanopatrones escritas-EBL pueden transferirse fielmente al sustrato de trabajo. Nanotopografía de diversos geometría y dimensiones se puede utilizar para modular el comportamiento celular. Como se demuestra en la Figura 2 con el A549, una línea de células epiteliales basales adenocarcinomic como células modelo, los nanogratings anisotrópicas puede alargar las células a lo largo de la dirección nanograting en comparación con la morfología multipolar que las células A549 se muestran en las nanopilares isotrópicas.

nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 1
Figura 1. Generación de una gran superficie de sustratos nanoestructurada utilizando la técnica de la puntada. (A, b) las imágenes ópticas de los nanopatrones transferidos a la placa PS y PS película delgada, respectivamente. Las flechas indican el aumento de polímero en los intersticios de los moldes de PDMS cosidas. (C, d) Imágenes de SEM de las nanopatrones en molde EBL y PDMS finales de sustrato de trabajo, respectivamente. Las barras de escala son de 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Nanotopographical modula la propagación de células de las células A549. (a) nanogratings de 500 nm de ancho de línea, de 500 nm de separación y 560 nm de altura y (b) nanopilares de 500 nm de diámetro, 450 nm en el espaciado de borde a borde y 560 nm de altura , respectivamente. Las barras de escala son de 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Se presenta un método simple, asequible y versátil para generar una gran superficie de sustrato nanoestructurada. Para ampliar fielmente nanopatrones altamente definidos, con gran atención debe prestarse a varios pasos críticos. La primera es para recortar los múltiples moldes de PDMS. zonas sin patrón de los moldes de PDMS necesitan ser removidas. Además, las paredes laterales de los moldes se deben cortar verticalmente tan perfecta como sea posible para minimizar los huecos entre los moldes. En conjunto, la parte de las zonas sin patrón en el molde puntada final puede ser reducido. En segundo lugar, la superficie nanoestructurada de estos moldes de PDMS necesita ser alineado sin ninguna distorsión en el sustrato de silicio. Debido a que las nanoestructuras de PDMS son propensos a deformarse, es crítico para colocar las superficies nanoestructurada contra un lado espejo del substrato de silicio suavemente y de manera uniforme (evitar que quede aire atrapado entre el molde de PDMS y la superficie de silicio). Los moldes de PDMS se alinearán tan cerca como sea posible, pero sin tocar el neighboring moldes para minimizar aún más la porción del molde sin patrón de la puntada final. De lo contrario, las nanoestructuras tocados se deforman durante nanoimpresión. En tercer lugar, el grosor de los moldes de PDMS puede variar de un lote a otro, y por lo tanto es crítico para hacer el espesor uniforme, además de hacer el espesor de cada uniforme molde por la nivelación de la pequeña molde Si perfectamente antes de PDMS de colada. Aunque la variación de espesor a través de los moldes de PDMS puede ser compensada mediante el ajuste del espesor de la prepolímero (adhesivo) PDMS capa colada en un portaobjetos de vidrio, una capa de prepolímero de espesor podría ser problemático. El prepolímero se puede tirar a través de los intersticios entre los moldes de PDMS a la superficie modelada por la fuerza capilar, y por consiguiente dañar los nanopatrones. La variación de espesor puede ser minimizado mediante la preparación de la misma cantidad de mezcla de PDMS cuando la fundición del molde EBL. Como resultado, una delgada capa de PDMS prepolímero se puede utilizar. Alternativamente, el curado parcial de la prepolymecapa r aumentará su viscosidad, y por lo tanto reducir su aumento y finalmente eliminar el posible daño de las superficies nanoestructurada.

La técnica de la puntada está limitada por la naturaleza elastomérica del PDMS. Aunque la litografía blanda se ha aplicado a replicar tamaños de característica tan pequeño como 2 nm 32 y, en principio, puede alcanzar una resolución de menos de 0,5 nm 18, las características de PDMS nanoescala no se pueden replicar sin problemas cuando la relación de aspecto de altura a anchura es demasiado alta (> 2) o muy bajo (<0,2). Los nanofeatures pueden derrumbarse cuando la relación de aspecto es demasiado alto, o resultar en un alivio insuficiente cuando se utiliza el sello de PDMS de un <ratio de 0,2 33. Además, múltiples PDMS moldes no pueden ser cosidas sin problemas debido a los intersticios y el recorte incompleta de los moldes de PDMS, y por lo tanto hay zonas sin patrón y mal alineados (en particular para nanopatrones continuas como nanogratings). Dado el pequeño porcentaje de la Defectedárea encima de la superficie total, la técnica de la puntada todavía proporciona una forma sencilla y asequible para producir una amplia zona de sustratos nanoestructurada. Además, cuando el molde está cosido nanoimprinted en el sustrato de polímero, el polímero fundido podría fluir en el intersticio, lo que resulta en una superficie irregular (Figura 1a). La superficie irregular hace que sea difícil para recoger muestras para los análisis biológicos celulares o moleculares. En las aplicaciones de microfluidos, el aumento también provoca un sellado incompleto cuando microcanales están sellados contra el sustrato modelado. El problema de la superficie desigual fácilmente se puede resolver mediante la aplicación de polímero de la técnica de película delgada para reducir al mínimo el aumento a través de ajuste del espesor de la película (Figura 1b).

Aunque la técnica de la puntada necesita un molde maestro definido para la expansión, es sencillo y asequible en comparación con otras técnicas como la litografía de avance y flash y una lithogra nanoimpresión de rollo a rolloPHY. La técnica requiere aumentar sólo platos calientes y una manera de ejercer fuerzas de compresión durante los procesos de costura y de nanoimpresión, pero no equipos costosos. Además, el proceso de la puntada puede llevarse a cabo en un entorno limpio, pero no necesariamente en una sala limpia.

La técnica de la puntada también es versátil. Además de ampliar un nanopattern idéntica a una gran superficie, la técnica de la puntada se puede aplicar para los moldes que consisten en características micro y / o nanométrica de diversas formas, dimensiones y disposiciones. En este sentido, una biblioteca combinatoria de micro / nanotopographies puede ser construido para proporcionar una plataforma de alto rendimiento para investigar las interacciones célula-topografía. Esta técnica de puntada sencilla, asequible y versátil potencialmente puede extenderse para crear dispositivos micro / nanoescala con componentes híbridos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
JEOL field emission SEM JEOL JSM-7600F EBL
E-beam evaporator Kurt J. Lesker Model: LAB 18 e-beam evaporator nickel deposition
Trion Minilock III ICP/RIE Trion technology Model: Minilock-phantom III
Press machine PHI Hydraulic Press Molde: SQ-230H
Spin coater Laurell Technologies Modle: WS-400A-6NPP-LITE
CO2 critical dryer Tousimis Modle: Autosamdri-815
Silicon wafer University Wafer 1080
Aluminum plates McMaster-carr 9057K123
Teflon sheets McMaster-carr 8711K92
100 mm Petri dish FALCON 353003
60 mm Petri dish FALCON 353004
Glass coverslip Fisher Scientific 12-542-B
Glass slide Fisher Scientific 12-550-34
Disposable weighing boats Fisher Scientific 13-735-743
Glass desiccator Fisher Scientific 02-913-360
Plastic desiccator Bel-Art Products F42025-000
Hotplate Fisher Scientific 1110049SH
Tweezer Ted Pella, inc. 5726
Blade Fisher Scientific S17302
Metal blocks McMaster-carr
Punch Brettuns Village Leather Craft Supplies Arch punch
Poly(methyl methacrylate) MicroChem 495 PMMA A4
PDMS Dow Corning Sylgard 184 kit
Polystyrene Dow Chemical Styron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilane Oakwood Chemical 7142
Developer MicroChem MIBK/IPA at 1: 3 ratio
Remover MicroChem Remover PG
Ethanol Fisher Scientific BP2818500
Toluene Fisher Scientific T324-500
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich D8537
Dulbecco’s modified eagle medium Sigma Aldrich D5796
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11550
Paraformaldehyde Electron Microsopy Science 15712-S
Glutaraldehyde  Fisher Chemical G151-1
Fibronectin Corning 356008
A549 cells ATCC ATCC CCL-185

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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La expansión de nanoestructurada Los sustratos usando la técnica de la puntada para Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula
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Wang, K., Leong, K. W., Yang, Y. Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior. J. Vis. Exp. (118), e54840, doi:10.3791/54840 (2016).More

Wang, K., Leong, K. W., Yang, Y. Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior. J. Vis. Exp. (118), e54840, doi:10.3791/54840 (2016).

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