Protocol
1.从EBL模具硅橡胶模具的复制
- 制造硅模具29
- 旋涂200μl的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）以2,500转1分钟1×1 4cm的硅（Si）的基片上的解决方案，以形成薄膜。
- 烘烤，在180℃的Si衬底2分钟在PMMA膜。
- 通过在300μC/ cm 2的面积的剂量使用聚焦电子束写在PMMA膜中的设计的纳米图案。
- 开发开发商PMMA纳米图案为80秒。
- 沉积的PMMA纳米图案并在厚度使用电子束蒸发器在10千伏，0.5mA的发射电流和0.5埃/秒的沉积速率的输出电压的50纳米的镍层。
- 剥离在20ml卸妆聚甲基丙烯酸甲酯部分在80℃下进行20分钟。
- 反应离子刻蚀（RIE）的纳米图案到Si衬底来获得所需的深度的Si模具。
注意：四面体的混合气体afluoromethane（CF 4），在150瓦400瓦和RIE功率的感应耦合等离子体（ICP）功率/氧（O 2）（90％/ 10％）被用于蚀刻硅衬底，以560纳米的深度。
- Silanize思模
- 放的玻璃盖玻片和Si模具在100毫米的PS培养皿并在位于通风橱的玻璃干燥器转移它们。
- 滴在盖玻片10微升1H，1H，2H，2H-Perfluorooctyltrichlorosilane。
注意：1H，1H，2H，2H-Perfluorooctyltrichlorosilane可能会导致皮肤腐蚀和严重眼损伤。穿戴合适的个人防护装备（PPE）。 - 部分覆盖培养皿。
- 保持在真空下的干燥器5小时在通风橱以完成硅模具的硅烷化。
- 准备PDMS预聚物
- 称取10克PDMS树脂和1.05克固化剂在一次性称量舟。
- 用塑料勺子调匀的PDMS预聚物。
- 直到观察到澄清的混合物脱气在真空下一个塑料干燥器的PDMS预聚物为约20分钟。
- 复制模具硅橡胶
- 把硅烷化硅模具在60毫米的培养皿。
- 倒在培养皿硅模具中的PDMS预聚物。
- 放置在一个塑料干燥器和脱气培养皿约10分钟，直至所有的气泡消失。
- 转移培养皿到烤盘并在70℃固化的PDMS预聚物4小时。
- 通过仔细用镊子剥离从硅模具的PDMS模具。
注：PDMS模具可以存储在环境条件下长达一周。固化后，也有在与PDMS模具30的一些未交联的PDMS树脂分子和残留的固化剂。低分子量的分子将逐渐扩散出来，并在表面上的时间累积。这会影响PDMS表面31的地形和机械性能。该DIF融合不是一个星期内显著。
2.拼接PDMS模具投入大，单一的模具
- 通过重复步骤1.4准备多个的PDMS模具。
注：称取同样量的PDMS混合物的每次获得相同厚度的PDMS模具。 - 确定的各向异性PDMS纳米图案的取向，如在光学显微镜下nanogratings并标记上的PDMS模具用记号笔的背面。
注意：这是没有必要来标记各向同性纳米形貌的取向，如纳米支柱。 - 在通风橱中清洗用乙醇Si衬底并用压缩空气干燥。
- 修剪过用刀片每个PDMS模具的无图案的区域。
注：对于将被放置在缝合模具的周边的PDMS模具，仅在与他人接触的无图案区应修剪掉。 - 将修剪PDMS模具的纳米图案面朝下的所述Si衬底的镜侧然后对齐靠近但不接触周围的模具（多个）其它模具。
- 准备PDMS粘合层
- 投1克脱气的PDMS预聚物（PDMS树脂和固化剂的比例：10：1.05）在一个干净的载玻片（7.5厘米* 2.5厘米），以形成0.5mm厚层。
- 烘烤，在100℃上3-5分钟热板的PDMS层。用针触摸层和确保该层被部分地而不是完全固化。
注：部分固化的PDMS不能流动像固化PDMS预聚体，但与固化硅橡胶相比，它已被置顶。
- 放置在对准的PDMS模具的背侧的PDMS层，并迅速反转此组件，并将其转移到加热板上。
- 上使用组件的顶部的金属块，以确保与PDMS粘合层和PDMS模具的背面之间具有良好的接触，并且固化所述PDMS粘合层在100℃下1小时施加压缩力（5千帕）。<BR />注意：小心地调整金属块的位置，避免组件的倾斜。
- 去除金属块和剥离从Si基板的单一的，缝合的PDMS模具。
3. PS基板母模的生成
注意：固定在载玻片上的缝合的PDMS模具可被用来生成对一PS板或PS薄膜，从该工作纳米图案基板可以制造母模。
- 产生于PS版母模
- 准备一个PS版
- 干燥在真空烘箱中在PS粒料在80℃两天。
- 在230℃预热的压机。
- 组装的铝板，聚四氟乙烯（PTFE）片和铝间隔中从底部顺序到顶部。
- 负载3.5克聚苯乙烯粒料于铝垫片具有方形开口3厘米（长）×3厘米（宽）×0.3厘米（高）。
注：该间隔是约0。1厘米比PDMS模具厚，并因此最终纳米图案的PS基底为约0.1厘米厚。 - 广场上的铝间隔另一四氟板，然后又铝板。
- 将组件压机。
- 预热，在230℃下的PS粒料30分钟。
- 应用在组件的压缩压力（0.1MPa）下5分钟。
- 释放压力，然后重新应用0.5兆帕上装配一个压缩的压力。
- 重复步骤3.1.1.9 0.5兆帕的压力增加，直到1.5兆帕的所需压力为止。
- 关闭压机的加热器，并在1.5MPa的压力恒定冷却下来低于70℃。
- 取组件出并在真空烘箱中在PS板存储于80℃，以防止重新进入PS板水分。
- 纳米压印缝合PDMS模具放入PS版
- 放置PS版的铝垫片一个3英寸的硅晶片上设置的。
注：隔板的内部尺寸是相同的PS版，使PS版适合直接在间隔物。 - 加热上，在250℃的加热板上30分钟的PS板。
- 把缝合PDMS模具上的熔融PS版纳米图案面朝下。
注意：与PDMS模具的一侧放置在触摸与PS板的表面的第一和另一侧中与PS表面接触逐渐降低，以避免气泡的界面处形成。
注意：烤盘表面是热的。在纳米压印过程中佩戴thermogloves。 - 将铝板上缝合PDMS模具的搏命。
- 通过使用该铝板金属板施加压缩压力（12.5千帕），并等待3分钟。
注：确保铝板没有倾斜。 - 提起并从该铝板代替金属块和我现象越来越多压压到25千帕。
- 重复步骤3.1.2.6与压力提高到50千帕。
注意：此步骤是除去捕集的PDMS模具和PS板之间的空气。 - 保持50千帕的15分钟的稳定的压力下240和250℃之间的加热板的温度。
- 关闭电磁炉和冷却整个安装。
注：风扇可以用来加速冷却过程。 - 除去金属板的温度低于50℃后，小心地剥离从PS板缝合的PDMS模具。
注：PS衬底具有反向纳米图案和可以用作一个母模制作工作的PDMS衬底。
- 放置PS版的铝垫片一个3英寸的硅晶片上设置的。
- 准备一个PS版
- 生成一个PS薄膜的母模
- 准备PS薄膜
- 溶解在10ml甲苯1克PS在通风橱中。
注意：甲苯可引起皮肤irritation和严重眼损伤，并可能导致长期或反复接触器官造成伤害。穿戴合适的个人防护装备。 - 在2500转1分钟上的2合晶片旋涂1毫升PS溶液，以形成约1微米厚的聚苯乙烯薄膜。
- 通过在通风橱中3天设置硅晶片上的聚苯乙烯薄膜蒸发从膜甲苯。
- 在80℃退火在真空烘箱中在PS薄膜过夜。
- 溶解在10ml甲苯1克PS在通风橱中。
- 纳米压印在PS薄膜的PDMS模具
- 把缝合的PDMS模具与PS上的薄膜，它是在电炉上设置纳米形貌面朝下。
- 通过使用上的PDMS模具的玻璃侧金属板施加12千帕的PDMS模具的压缩压力。
- 提高热板的温度升高到180℃，并保持它为15分钟。
注意：熔融聚苯乙烯薄膜可以作为润滑剂的作用。要注意防止金属块滑落。 - 关闭烤盘和冷却整个安装。
注：风扇可以用来加速冷却过程。 - 除去金属板的温度降至50℃以下之后，并小心地剥离从PS膜缝合的PDMS模具。
注：该纳米图案化的聚苯乙烯薄膜将作为母模生产工作PDMS基板。
- 准备PS薄膜
4.细胞行为Nanotopographical调制
注意：人的上皮细胞是培养的代表nanotopographies展示的细胞扩散nanotopographical调制。
- 从任一步骤3.1或3.2取决于应用程序生成的母模铸造PDMS基板工作。
- 使用中空钢拱冲床，剪奈米PDMS基板刻录到光盘上，以适应特定的多孔板（ 例如 ，24孔板）的配置。
- 用镊子将PDMS光盘放入井中Ø发多孔板。
- 通过使用70％的乙醇中，然后UV曝光，每次30分钟进行消毒的PDMS衬底。
- 洗用1×无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的三倍的PDMS衬底。
- 涂层与细胞外基质蛋白（ 即 ，20微克/毫升纤连蛋白）在室温下30分钟的PDMS衬底。
- 冲洗的PDMS衬底用无菌PBS清洗3次，每次5分钟。
- 暂停人肺癌细胞A549中的Dulbecco用10％胎牛血清改良Eagle培养基和使用血球计数细胞。
- 板以2,000个细胞/ cm 2的对PDMS衬底并进行培养的接种密度将细胞于37℃在含有5％CO 2的一天的潮湿气氛中。
- 洗细胞用PBS洗3次。
- 固定细胞在PBS中的4％多聚甲醛和2％戊二醛的混合物4小时，使用CO 2临界婆脱水细胞INT机扫描电子显微镜观察29。
注意：多聚甲醛和戊二醛可能引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。工作在化学罩和穿戴适当的个人防护装备。
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Representative Results
线圈技术可以产生具有高保真纳米图案基板的大面积。 图1a和1b分别显示从缝合的PDMS模具PS板和PS薄膜的Si衬底上转移，纳米图案的大的面积。原始EBL写入模具（ 图1c）和工作基板（ 图1d）的最终的PDMS之间的比较证实，EBL写纳米图案可以忠实地转印到工作衬底。各种几何形状和尺寸的纳米形貌可以用于调节细胞行为。如在图2与A549证明，一个adenocarcinomic基底上皮细胞系作为模型细胞，各向异性nanogratings可伸长细胞随着多极化形态是A549细胞上各向同性纳米柱显示相比nanograting方向。
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图 大面积使用缝合技术，纳米图案化衬底的 1 代。 （A，B）转移到分别PS板和PS薄膜，该纳米图案的光学图像。箭头指示在缝合的PDMS模具的空隙中的聚合物加注。 （C，D）上的EBL模具和分别加工基板，最终PDMS中的纳米图案的SEM图像。刻度条是1微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. Nanotopographical调制单元A549细胞的扩散。 （a）以线宽nanogratings 500纳米，在间距为500nm并且高度为560nm和（b）的直径为500纳米纳米柱，在边缘到边缘间距450纳米，高度560nm的A549细胞， 分别。规模酒吧10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们提出了一个简单，经济实惠，还没有通用的方法来生成纳米图案化衬底的大面积。要忠实地扩大高度定义的纳米图案，极具应注意的几个关键步骤。第一个是修剪多个PDMS模具。与PDMS模具的无图案的区域需要被去除。此外，模具的侧壁应切垂直地尽可能完美以最小化模具之间的间隙。总的来说，未图案化的区域中的最后一针模的部分可以减小。其次，需要没有在硅衬底上的任何扭曲对齐这些PDMS模具的纳米图案表面。因为PDMS纳米结构容易变形，这是至关重要的纳米图案的表面放置针对轻轻和均匀的硅基板的镜侧（避开PDMS模具和硅表面之间捕集的空气）。将PDMS模具将尽可能接近对齐，但不触及NEIghboring模具进一步减少最终线圈模具的无图案部分。否则，所触摸的纳米结构将纳米压印期间变形。第三，PDMS模具的厚度可以变化批次，因此至关重要的是使除了厚度均匀，由PDMS铸造之前完全整平小的Si模具使每个模具均匀的厚度。虽然在整个的PDMS模具厚度的变化可以通过调整的PDMS预聚物（粘合剂）的厚度来补偿层浇注在玻璃片上，一个厚的预聚物层可能是有问题的。所述预聚物可以通过与PDMS模具由毛细管力的图案化表面之间的空隙中被拉出，并因此损坏纳米图案。厚度变化可以通过从EBL模具铸造时制备的PDMS混合物的相同量被最小化。其结果是，可以使用一个薄的PDMS预聚物层。另外，部分固化prepolymeR层将会增加其粘度，从而降低其增强和最终消除纳米图案的表面的可能的损害。
线圈技术由PDMS的弹性体性质的限制。虽然软光刻已经被应用到复制的特征尺寸小至2nm的32，并且在原则上，可以达到小于0.5nm 18的分辨率，所述纳米级的PDMS功能不能完美地复制时高度与宽度的纵横比过高（> 2）或过低（<0.2）。当宽高比太高纳米体可能会崩溃，或当<0.2比的PDMS压模使用33导致不足以缓解。此外，多个PDMS模具不能缝合，因为空隙和PDMS模具的不完全修整的无缝连接，并因此有未构图和错位的区域（特别是用于连续纳米图案如nanogratings）。鉴于叛逃的很小比例面积超过总表面积，针迹技术仍然提供了一种简单和经济的方式，以产生纳米图案基板的大面积。另外，当该缝合模具nanoimprinted到聚合物基材，熔融聚合物可能流入缝隙，导致不平整的表面（ 图1a）。在凹凸不平的表面使得它具有挑战性的收集样品细胞或分子生物学分析。在微流控应用中，该升也引起不完全的密封，当微通道对图案化衬底密封。凹凸不平的表面的问题可以容易地通过施加聚合物薄膜技术通过调整膜厚，以减少该升来解决（ 图1b）。
虽然缝技术需要一个限定主模具的膨胀，这是简单且经济实惠与其它技术，如步进闪光光刻和一个辊到辊纳米压印lithogra相比PHY。缝合技术只需要热板，并在拼接和纳米压印过程中施加压缩力的一种方式，而不是昂贵的设备。此外，该缝过程可以在清洁环境中进行，但不一定在洁净室。
线圈技术也通用。除了扩大的相同纳米图案以大面积，针迹技术可应用于包括各种形状，尺寸和安排的微米和/或纳米级特征的模具。要对此，微/ nanotopographies的组合的库建成后可提供高吞吐量平台调查细胞地形的相互作用。这个简单，价格实惠，多功能针技术有可能扩展到创建混合组件微/纳米器件。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEOL field emission SEM | JEOL | JSM-7600F | EBL |
| E-beam evaporator | Kurt J. Lesker | Model: LAB 18 e-beam evaporator | nickel deposition |
| Trion Minilock III ICP/RIE | Trion technology | Model: Minilock-phantom III | |
| Press machine | PHI Hydraulic Press | Molde: SQ-230H | |
| Spin coater | Laurell Technologies | Modle: WS-400A-6NPP-LITE | |
| CO2 critical dryer | Tousimis | Modle: Autosamdri-815 | |
| Silicon wafer | University Wafer | 1080 | |
| Aluminum plates | McMaster-carr | 9057K123 | |
| Teflon sheets | McMaster-carr | 8711K92 | |
| 100 mm Petri dish | FALCON | 353003 | |
| 60 mm Petri dish | FALCON | 353004 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-34 | |
| Disposable weighing boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| Glass desiccator | Fisher Scientific | 02-913-360 | |
| Plastic desiccator | Bel-Art Products | F42025-000 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110049SH | |
| Tweezer | Ted Pella, inc. | 5726 | |
| Blade | Fisher Scientific | S17302 | |
| Metal blocks | McMaster-carr | ||
| Punch | Brettuns Village Leather Craft Supplies | Arch punch | |
| Poly(methyl methacrylate) | MicroChem | 495 PMMA A4 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | |
| Polystyrene | Dow Chemical | Styron 685D | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilane | Oakwood Chemical | 7142 | |
| Developer | MicroChem | MIBK/IPA at 1: 3 ratio | |
| Remover | MicroChem | Remover PG | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Toluene | Fisher Scientific | T324-500 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microsopy Science | 15712-S | |
| Glutaraldehyde | Fisher Chemical | G151-1 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL-185 |
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