Protocol
1. A replicação de PDMS moldes a partir de um molde EBL
- Fabricar molde de silicone 29
- revestimento da rotação de 200 ul de polimetil metacrilato (PMMA) solução sobre um substrato 1 x 1 cm de silício (Si) a 2.500 rpm durante 1 minuto para formar uma película fina.
- Cozer a película de PMMA sobre o substrato de Si a 180 ° C durante 2 min.
- Escreva o nanopattern projetado no filme PMMA usando um feixe de electrões focado em uma dose de 300 uC / cm 2 de área.
- Desenvolver o nanopattern PMMA no desenvolvedor para 80 seg.
- Depositar o nanopattern de PMMA com uma camada de níquel de 50 nm de espessura usando um evaporador de feixe de electrões a uma tensão de 10 kV, corrente de emissão de 0,5 mA com uma velocidade de deposição de 0,5 Ã / seg saída.
- Levantar a parte de PMMA em 20 ml removedor a 80 ° C durante 20 min.
- etch iónico reactivo (RIE) a nanopattern para o substrato de Si para obter um molde de Si a profundidade desejada.
NOTA: mistura gasosa de tetrafluoromethane (FC 4) / oxigénio (O2) (90% / 10%) com uma potência de plasma indutivamente acoplado (ICP) de 400 W de potência e RIE de 150 W é usado para gravar Si substrato a uma profundidade de 560 nm.
- molde silanizar Si
- Coloque uma lamela de vidro e o molde Si em um 100 milímetros PS placa de Petri e transferi-los num exsicador de vidro localizada em um exaustor.
- Gota de 10 ul de 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sobre a lamela.
Cuidado: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane pode causar corrosão da pele e lesões oculares graves. Use equipamento de proteção pessoal adequado (PPE). - Cobrir a placa de Petri parcialmente.
- Manter o exsicador sob vácuo durante 5 horas num exaustor de fumos para completar a silanização do molde Si.
- Prepare PDMS pré-polímero
- Pesar 10 g de resina PDMS e 1,05 g agente de cura em um barco de pesagem descartáveis.
- Misturar o pré-polímero de PDMS cuidadosamente usando uma colher de plástico.
- Desgasificar o pré-polímero de PDMS-se num exsicador de plástico sob vácuo durante cerca de 20 minutos até uma mistura clara é observado.
- Replicar moldes PDMS
- Coloque o molde Si silanizada em uma placa de Petri de 60 milímetros.
- Verter o pré-polímero de PDMS no molde Si na placa de Petri.
- Coloque a placa de Petri num exsicador de plástico e degas por cerca de 10 min até que todas as bolhas desapareçam.
- Transferir a placa de Petri a uma placa de aquecimento e cura do pré-polímero de PDMS, a 70 ° C durante 4 h.
- Retire o molde PDMS do molde Si com cuidado usando uma pinça.
NOTA: moldes PDMS pode ser armazenado em condições ambientes durante até uma semana. Após a cura, há algumas moléculas de PDMS não reticuladas resina e agente de endurecimento residual nos moldes 30 PDMS. As moléculas de baixo peso molecular vai gradualmente se difundem para fora e se acumulam na superfície ao longo do tempo. Isto afecta as propriedades topográficas e mecânicas da superfície do PDMS 31. o diffusão não é significativa dentro de uma semana.
2. Costura de PDMS Moldes em um grande, Mold Individual
- Prepare moldes múltiplos PDMS repetindo o passo 1.4.
NOTA: Pesar mesma quantidade de mistura de PDMS de cada vez para obter moldes de PDMS mesma espessura. - Determinar a orientação de anisotrópicos PDMS nanopatterns tais como nanogratings sob um microscópio óptico e marcá-lo na parte traseira dos moldes PDMS com uma caneta marcadora.
NOTA: Não é necessário marcar a orientação de nanotopografia isotrópica, tais como nanopillars. - Limpar um substrato de Si com etanol em um exaustor e seque-o com ar comprimido.
- Aparar as áreas unpatterned de cada molde PDMS com uma lâmina.
NOTA: Para os moldes de PDMS que serão colocados na periferia do molde costurado, apenas as áreas unpatterned em contacto com os outros deve ser aparada. - Coloque o molde PDMS aparadas com a nanopattern face para baixo sobreo lado do espelho do substrato de Si e alinhe outros moldes perto mas não tocando o molde circundante (s).
- Prepara-se uma camada adesiva de PDMS
- Fundido um pré-polímero de PDMS g desgaseificada (PDMS resina e relação de agente de cura: 10: 1,05) numa lâmina de vidro limpo (7,5 cm x 2,5 cm) para formar uma camada de espessura de 0,5 mm.
- Cozer a camada de PDMS, a 100 ° C numa placa de aquecimento durante 3-5 minutos. Utilize uma agulha para tocar na camada e assegurar que a camada é parcialmente mas não completamente curada.
NOTA: PDMS parcialmente curada não pode fluir como pré-polímero de PDMS não curado, mas é pegajoso em comparação com PDMS curados.
- Coloque a camada de PDMS na parte traseira de moldes PDMS alinhados e rapidamente inverter esta montagem e transferi-lo para a placa de aquecimento.
- Aplicar uma força de compressão (5 kPa) usando um bloco metálico na parte superior do conjunto para assegurar um bom contacto entre a camada adesiva e a parte traseira de PDMS de moldes de PDMS, e curar o PDMS camada de adesivo a 100 ° C durante 1 h. <br /> NOTA: Ajuste cuidadosamente a posição do bloco de metal para evitar a inclinação da montagem.
- Remova o bloco de metal e retire a, molde PDMS costurado single do substrato de Si.
3. Geração de um molde mestre no PS Substratos
Nota: O molde PDMS costurado imobilizado sobre uma lâmina de vidro pode ser usado para gerar um molde mestre em uma placa de PS ou uma película fina de PS, a partir do qual podem ser produzidos substratos nanopatterned de trabalho.
- Gerar um molde mestre em uma placa PS
- Prepare uma placa PS
- Secam-se os peletes de PS em uma estufa de vácuo a 80 ° C durante dois dias.
- Pré-aqueça uma máquina de imprensa a 230 ° C.
- Montar uma placa de alumínio, uma folha de politetrafluoretileno (PTFE) e o espaçador de alumínio em uma ordem de baixo para cima.
- Carregar 3,5 g de PS em pelotas o espaçador de alumínio com uma abertura quadrada de 3 cm (L) x 3 cm (W) x 0,3 cm (H).
NOTA: O espaçador é de aproximadamente 0.1 cm mais espessos que os moldes de PDMS, e, assim, o substrato final nanopatterned PS é cerca de 0,1 cm de espessura. - Coloque outra folha de PTFE e, em seguida, uma outra placa de alumínio no espaçador de alumínio.
- Coloque o conjunto na máquina da imprensa.
- Pré-aqueça os peletes Ps a 230 ° C durante 30 min.
- Aplicar uma pressão de compressão (0,1 MPa) no conjunto durante 5 minutos.
- Solte a pressão e, em seguida, voltar a aplicar uma pressão de compressão de 0,5 MPa na montagem.
- Repita o passo 3.1.1.9, com um aumento de pressão de 0,5 MPa até à pressão de 1,5 MPa desejável é atingida.
- Desligue o aquecedor da máquina da imprensa e esfriá-la abaixo de 70 ° C a uma pressão constante de 1,5 MPa.
- Tomar o conjunto para fora e armazenar a placa de PS num forno de vácuo a 80 ° C para impedir a humidade de entrar novamente a placa PS.
- Nanoimpressão o molde PDMS costurado na placa PS
- Coloque a placa PS em um espaçador de alumíniodefinido em uma de 3 polegadas lâmina de silício.
NOTA: As dimensões interiores do espaçador são as mesmas que as da placa de PS de modo que a placa PS cabe para a direita no espaçador. - Aquecer a placa PS numa placa de aquecimento a 250 ° C durante 30 min.
- Coloque o molde PDMS costurado com nanopatterns face para baixo sobre a placa PS fundido.
Nota: Um dos lados do molde PDMS é posto em contacto com a superfície da placa de PS em primeiro lugar e o outro lado é gradualmente reduzido em contacto com a superfície de PS para evitar a formação de bolhas de ar na interface.
Cuidado: A superfície da placa de aquecimento é quente. Desgaste thermogloves durante o processo de nanoimpressão. - Coloque uma placa de alumínio na lâmina de vidro do molde PDMS costurado.
- Aplicar uma pressão de compressão (12,5 kPa) usando blocos de metal sobre a chapa de alumínio e esperar durante 3 min.
NOTA: Certifique-se de que a placa de alumínio não está inclinado. - Levante e substituir o bloco de metal da placa de alumínio e increase a pressão de compressão a 25 kPa.
- Repita o passo 3.1.2.6 com a pressão aumentada para 50 kPa.
NOTA: Este passo é remover o ar aprisionado entre o molde e a placa de PDMS PS. - Manter a temperatura da placa de aquecimento entre 240 e 250 ° C, sob a pressão constante de 50 kPa durante 15 minutos.
- Desligue o fogão e esfriar a instalação inteira.
NOTA: Um ventilador pode ser usado para acelerar o processo de resfriamento. - Remover os blocos de metal após a temperatura esteja abaixo de 50 ° C, e cuidadosamente descascar para fora do molde PDMS costurada a partir da placa PS.
NOTA: O substrato PS tem os nanopatterns reversa e pode ser utilizado como um molde mestre para produzir substratos de PDMS de trabalho.
- Coloque a placa PS em um espaçador de alumíniodefinido em uma de 3 polegadas lâmina de silício.
- Prepare uma placa PS
- Gerar um molde mestre em uma película fina PS
- Prepara-se uma película fina PS
- Dissolve-se 1 g de PS em 10 mL de tolueno num exaustor de fumos.
Atenção: O tolueno pode causar irritatio pelen e lesões oculares graves, e pode causar dano aos órgãos através da exposição repetida ou prolongada. Utilizar EPI adequado. - Spin-coat solução PS 1 ml em um 2-em wafer a 2.500 rpm por 1 min para formar ~ 1 mm de espessura PS película fina.
- Evaporar o tolueno a partir do filme, definindo o filme PS no bolacha de Si num exaustor de fumos durante 3 dias.
- Recozer a película fina PS num forno de vácuo a 80 ° C durante a noite.
- Dissolve-se 1 g de PS em 10 mL de tolueno num exaustor de fumos.
- Nanoimpressão o molde PDMS em uma película fina PS
- Coloque o molde PDMS costurado com nanotopografia face para baixo sobre a película fina PS, que é definido numa placa de aquecimento.
- Aplicar uma pressão de compressão de 12 kPa no molde PDMS usando blocos de metal do lado do vidro do molde PDMS.
- Aumentar a temperatura da placa de aquecimento a 180 ° C e mantê-lo durante 15 min.
Cuidado: A película fundida PS pode funcionar como um lubrificante. Preste atenção para evitar que os blocos de metal de deslizar para fora. - Desligue a placa de aquecimentoe arrefecer a instalação inteira.
NOTA: Um ventilador pode ser usado para acelerar o processo de resfriamento. - Remover os blocos de metal após a temperatura cai abaixo de 50 ° C, e cuidadosamente descascar para fora do molde PDMS cosido a partir do filme de PS.
NOTA: O filme nanopatterned PS vai servir como um molde mestre para produzir substratos PDMS de trabalho.
- Prepara-se uma película fina PS
4. Nanotopographical modulação do comportamento celular
Nota: células epiteliais humanas são cultivadas nas nanotopographies representativos para demonstrar modulação nanotopographical da célula se espalhando.
- Fundido substratos de trabalho PDMS do molde mestre gerado a partir de qualquer Passo 3.1 ou 3.2, dependendo da aplicação.
- Usando um arco de aço oco perfurador, cortar os substratos PDMS nanopatterned em discos para se ajustar a configuração de uma placa multi-poço específico (por exemplo, placa, de 24 poços).
- Utilize uma pinça para colocar os discos PDMS nas cavidades ófa placa multi-poços.
- Esterilizar os substratos PDMS usando 70% de etanol e, em seguida, a exposição de UV, durante 30 minutos cada.
- Lavar o PDMS substratos com 1x de fosfato estéril tamponado salino (PBS) três vezes.
- Revestir os substratos PDMS com proteínas de matriz extracelular (por exemplo, 20 ug / ml de fibronectina) durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lavar os substratos PDMS três vezes com PBS estéril, cada uma durante 5 minutos.
- Suspender A549 de células de cancro de pulmão humano em meio de Eagle modificado por Dulbecco com soro bovino fetal a 10% e contar as células utilizando um hemocitómetro.
- Placa as células a uma densidade de sementeira de 2.000 células / cm2 sobre os substratos e cultura PDMS-los a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO 2 durante um dia.
- Lavam-se as células com PBS três vezes.
- Fixar as células em uma mistura de paraformaldeído a 4% e 2% de glutaraldeído em PBS durante 4 h e desidratar as células usando um CO 2 PO críticasecador de int para a digitalização de observação microscópica electrónica 29.
Atenção: O paraformaldeído e glutaraldeído pode causar queimaduras na pele e lesões oculares graves. Operar em uma capa química e utilizar EPI adequado.
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Representative Results
A técnica do ponto pode gerar uma grande área de substratos nanopatterned com alta fidelidade. A Figura 1a e 1b exibir a grande área de nanopatterns transferidos a partir do molde PDMS costurada a placa PS e PS película fina sobre um substrato de Si, respectivamente. A comparação entre o molde original é EBL-escrita (Figura 1C) e o PDMS finais de substrato de trabalho (Figura 1D), confirma que os nanopatterns EBL-escrita pode ser fielmente transferida para o substrato de trabalho. Nanotopografia de diversas geometrias e dimensões podem ser usadas para modular o comportamento celular. Como demonstrado na Figura 2 com A549, uma linha epitelial basal adenocarcinomic células como células de modelo, os nanogratings anisotrópicas pode alongar as células ao longo da direcção nanograting comparada com a morfologia multipolar que as células A549 exibir nas nanopillars isotrópicas.
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Figura 1. Geração de uma grande área de substratos nanopatterned utilizando a técnica do ponto. (A, b) As imagens ópticas das nanopatterns transferidos para placa PS e película fina PS, respectivamente. As setas indicam o aumento de polímero nos interstícios dos moldes PDMS costurados. (C, d) as imagens SEM do nanopatterns no molde e EBL PDMS finais de substrato de trabalho, respectivamente. As barras de escala são 1 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Nanotopographical modulado o espalhamento das células de células A549. (a) nanogratings de 500 nm de largura de linha, 500 nm em espaçamento e 560 nm de altura e (b) nanopillars de 500 nm de diâmetro, 450 nm no espaçamento de borda a borda e 560 nm de altura , respectivamente. As barras de escala são 10 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós apresentamos um método simples, acessível, mas versátil para gerar uma grande área de substrato nanopatterned. Para expandir fielmente nanopatterns altamente definidos, grande atenção deve ser dada às várias etapas críticas. O primeiro é para aparar as PDMS vários moldes. unpatterned áreas dos moldes PDMS precisa ser removido. Além disso, as paredes laterais dos moldes deve ser cortada verticalmente perfeito quanto possível para minimizar as diferenças entre os moldes. Colectivamente, a porção de áreas unpatterned no molde do ponto final pode ser reduzido. Em segundo lugar, a superfície nanopatterned destes PDMS moldes tem de ser alinhado, sem qualquer distorção no substrato de silício. Porque as nanoestruturas PDMS são propensos a deformar-se, ela é crítica para colocar as superfícies nanopatterned contra um lado do espelho do substrato de silício suavemente e uniformemente (evitar retenção de ar entre o molde e a superfície de silicone PDMS). Os moldes PDMS será alinhado tão perto quanto possível, mas não tocando o neighboring moldes para minimizar ainda mais a porção unpatterned do molde ponto final. Caso contrário, as nanoestruturas tocados irá deformar-se durante nanoimpressão. Em terceiro lugar, a espessura dos moldes PDMS pode variar de lote para lote, e portanto é crítico para fazer a espessura uniforme, além de fazer a espessura uniforme de cada molde de nivelamento do pequeno molde de fundição de Si perfeitamente antes PDMS. Embora a variação de espessura entre os moldes PDMS pode ser compensada através do ajuste da espessura do pré-polímero de PDMS (adesivo) camada lançada sobre uma lâmina de vidro, uma camada de espessura pré-polímero pode ser problemática. O pré-polímero pode ser puxado através dos interstícios entre os moldes PDMS à superfície modelada pela força de capilaridade, e, consequentemente, danificar as nanopatterns. A variação da espessura pode ser minimizado mediante a preparação de a mesma quantidade de mistura de PDMS ao transmitir a partir do molde EBL. Como resultado, uma fina camada de pré-polímero de PDMS pode ser usado. Alternativamente, curar parcialmente a prepolymecamada de r aumentará a sua viscosidade, e, portanto, reduzir o seu aumento e eventualmente eliminar o possível dano de superfícies nanopatterned.
A técnica de ponto é limitada pela natureza elastomérica de PDMS. Embora a litografia macia foi aplicada para replicar tamanhos característicos tão pequeno quanto 2 nm 32 e, em princípio, pode alcançar uma resolução de menos do que 0,5 nm, 18, as características de PDMS em nano-escala não podem ser replicados na perfeição quando a relação de aspecto entre a altura ea largura é demasiado elevado (> 2) ou muito baixo (<0,2). Os nanofeatures pode entrar em colapso quando a proporção é muito alta, ou resultar em alívio insuficiente quando o carimbo de PDMS de um <0,2 relação é utilizada 33. Além disso, vários moldes de PDMS não pode ser costurada perfeitamente devido aos interstícios e aparar incompleta dos moldes de PDMS, e, portanto, existem áreas unpatterned e desalinhados (em particular para nanopatterns contínuos, tais como nanogratings). Dada a pequena percentagem da Defectedárea sobre a área de superfície total, a técnica de ponto ainda fornece uma maneira simples e acessível para produzir uma grande área de substratos nanopatterned. Além disso, quando o molde é costurado nanoimprinted no substrato polímero, o polímero fundido pode fluir para dentro do interstício, resultando em uma superfície irregular (Figura 1a). A superfície irregular torna difícil coletar amostras para análises biológicas celulares ou moleculares. Em aplicações de microfluidos, o aumento também provoca uma vedação incompleta quando microcanais são selados contra o substrato modelado. O problema superfície irregular pode ser prontamente resolvido pela aplicação de técnicas de película fina de polímero para minimizar o aumento através de ajuste da espessura do filme (Figura 1b).
Embora a técnica de ponto precisa de um molde mestre definido para a expansão, é simples e acessível em comparação com outras técnicas como a litografia step-and-flash e uma lithogra nanoimpressão roll-to-rollphy. A técnica requer apenas do ponto placas quentes e uma forma de exercer forças de compressão durante o processo de costura e nanoimpressão, mas não equipamentos caros. Além disso, o processo do ponto pode ser realizado em um ambiente limpo, mas não necessariamente em uma sala limpa.
A técnica de ponto é também versátil. Além de ampliar um nanopattern idêntica a uma grande área, a técnica do ponto pode ser aplicado para os moldes que consistem em micro e / ou em nanoescala características de várias formas, dimensões e arranjos. Para este respeito, uma biblioteca combinatória de micro / nanotopographies pode ser construído para fornecer a plataforma de alto rendimento para investigar as interações célula-topografia. Esta técnica ponto simples, acessível e versátil pode potencialmente ser alargado para criar dispositivos de micro / nano-escala com componentes híbridos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEOL field emission SEM | JEOL | JSM-7600F | EBL |
| E-beam evaporator | Kurt J. Lesker | Model: LAB 18 e-beam evaporator | nickel deposition |
| Trion Minilock III ICP/RIE | Trion technology | Model: Minilock-phantom III | |
| Press machine | PHI Hydraulic Press | Molde: SQ-230H | |
| Spin coater | Laurell Technologies | Modle: WS-400A-6NPP-LITE | |
| CO2 critical dryer | Tousimis | Modle: Autosamdri-815 | |
| Silicon wafer | University Wafer | 1080 | |
| Aluminum plates | McMaster-carr | 9057K123 | |
| Teflon sheets | McMaster-carr | 8711K92 | |
| 100 mm Petri dish | FALCON | 353003 | |
| 60 mm Petri dish | FALCON | 353004 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-34 | |
| Disposable weighing boats | Fisher Scientific | 13-735-743 | |
| Glass desiccator | Fisher Scientific | 02-913-360 | |
| Plastic desiccator | Bel-Art Products | F42025-000 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110049SH | |
| Tweezer | Ted Pella, inc. | 5726 | |
| Blade | Fisher Scientific | S17302 | |
| Metal blocks | McMaster-carr | ||
| Punch | Brettuns Village Leather Craft Supplies | Arch punch | |
| Poly(methyl methacrylate) | MicroChem | 495 PMMA A4 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | |
| Polystyrene | Dow Chemical | Styron 685D | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilane | Oakwood Chemical | 7142 | |
| Developer | MicroChem | MIBK/IPA at 1: 3 ratio | |
| Remover | MicroChem | Remover PG | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Toluene | Fisher Scientific | T324-500 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microsopy Science | 15712-S | |
| Glutaraldehyde | Fisher Chemical | G151-1 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL-185 |
References
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