Abstract
تعتمد المعايير التقليدية للنشاط مضادات الميكروبات داخل الخلايا والسمية لخلايا حقيقية النواة على المقايسات نقطة النهاية. وتتطلب هذه المقايسات نقطة النهاية العديد من الخطوات التجريبية الإضافية قبل قراءات، مثل تحلل الخلية، مستعمرة تشكيل وحدة المصير، أو إضافة كاشف. عند تنفيذ الآلاف من المقايسات، على سبيل المثال، أثناء فحص عالية الإنتاجية، وجهد المصب المطلوبة لهذه الأنواع من المقايسات لا بأس بها. لذلك، لتسهيل عالية الإنتاجية اكتشاف مضادات الميكروبات، قمنا بتطوير فحص في الوقت الحقيقي لتحديد وقت واحد مثبطات نمو البكتيريا داخل الخلايا وتقييم السمية لخلايا حقيقية النواة. على وجه التحديد، وتمكين الوقت الحقيقي للكشف عن نمو البكتيريا داخل الخلايا عن طريق وضع علامة السلالات البكتيرية فحص إما مع الاوبرون البكتيرية لوكس (1 شارع الجيل فحص) أو صحفيين ببروتين (2 الثانية جيل، فحص متعامد). وغير سامة، وخلية غشاء impermeant، النووي صبغ ملزم حمضوأضاف خلال العدوى الأولية الضامة. وتستبعد هذه الأصباغ من خلايا قابلة للحياة. ومع ذلك، تفقد الخلايا المضيفة غير قابلة للحياة سلامة الغشاء تسمح بدخول ووضع العلامات الفلورية من الحامض النووي (حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين). والجدير بالذكر أن الحمض النووي ملزمة يرتبط مع زيادة كبيرة في العائد الكم الفلورسنت التي توفر قراءات الحل القائم على وفاة الخلية المضيفة. وقد استخدمنا هذا الاختبار المشترك لأداء شاشة عالية الإنتاجية في شكل صفيحة، وتقييم نمو الخلايا والسمية الخلوية بواسطة المجهر. والجدير بالذكر، أن مضادات الميكروبات تظهر التآزر التي التأثير المشترك لاثنين أو أكثر من مضادات الجراثيم عند تطبيقها معا أكبر مما كانت عليه عندما تطبق بشكل منفصل. اختبار لفي المختبر التآزر ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا عادة مهمة هائلة كما يجب تقييم التباديل اندماجي من المضادات الحيوية بتركيزات مختلفة. ومع ذلك، وجدنا أن لدينا فحص في الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع الآلي، والاستغناء عن التكنولوجيا الرقمية صermitted اختبار التآزر سطحي. باستخدام هذه الأساليب، كنا قادرين على مسح منهجي عمل لعدد كبير من مضادات الجراثيم وحده، والجمع ضد مسببات المرض داخل الخلايا، البكتيريا المستروحة.
Introduction
مسببات الأمراض التي تنمو أو يقيمون مؤقتا في حجرات داخل الخلايا صعبة للقضاء على علاجيا. إلزام أو إلزام نسبيا مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل البكتيريا المستروحة، الكوكسيلا البورنيتية، البروسيلا النيابة. ، الفرنسيسيلة التولارية، والمتفطرة النيابة. غالبا ما تتطلب دورات من العلاج المضادة للميكروبات لفترات طويلة للعلاج والتي قد تتراوح من أشهر إلى سنوات حتى. وعلاوة على ذلك، يمكن لمسببات الأمراض خارج الخلية تحتل عابر منافذ داخل الخلايا، وبهذه الطريقة الهروب إجازته الدورات العادية العلاج المضادة للميكروبات وتظهر في وقت لاحق لبدء جولات جديدة من العدوى الخبيثة. المكورات العنقودية الذهبية (1) وuropathogenic المعوية 2،3 الالتهابات مثالين المعترف بها على نحو متزايد. ولذلك، فإن الهدف الأساسي اكتشاف المخدرات هو تحديد مضادات الميكروبات الرواية التي تخترق المقصورات داخل الخلايا. العلاج الأمثل للقضاء بسرعةالكائنات الحية داخل الخلايا ومنع تطور المقاومة من خلال التعرض للميكروبات دون كابح أمر مرغوب فيه خاصة.
تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير تقنية فحص الإنتاجية العالية لتحديد مضادات الميكروبات، داخل الخلايا توغل تستهدف نمو الخلايا من مسببات المرض نموذج، البكتيريا المستروحة. وتشير 4 الملاحظات السريرية السابقة أن معيار اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات لم تتنبأ بدقة في الجسم الحي الكفاءة العلاجية ضد هذا الكائن الحي. 5 على وجه التحديد، وكان هذا بسبب فئات رئيسية من مضادات الميكروبات مثل β-اكتام وأمينوجليكوزيدات، على الرغم من فعالية عالية ضد نمت axenically البكتيريا، لا تخترق بدرجة كافية في حجرات داخل الخلايا حيث تتواجد البكتيريا. اقترح 5،6 الأدلة في وقت لاحق أن المقايسات نمو الخلايا فنيا أكثر تعقيدا توقعت فعال الفعالية السريرية. 7
لذلك، قمنا بتطوير تكنولوجيا لتحديد الوقت الحقيقي لنمو البكتيريا داخل الخلايا. 6 وقد تحقق ذلك من خلال استخدام السلالة البكتيرية المعدلة من خلال دمج إما بكتيري وسيفيراز الاوبرون 8 (أول فحص جيل، وصفت سابقا) 4 أو الفلورسنت البروتين 9 صحفيين (الجيل الثاني، فحص متعامد، وصفت هنا) في كروموسوم البكتيريا. وبهذه الطريقة، الانارة أو إشارة الفلورسنت توفر بديل، في الوقت الحقيقي قراءات من عدد البكتيريا.
ومع ذلك، هذه الصفات لا تعالج المحير رئيسيا في infectio داخل الخلاياالمقايسات ن، والآثار بعيدا عن الهدف في الخلايا المضيفة. على وجه الخصوص، وفاة الخلية المضيفة يحد بطبيعتها نمو الخلايا وتؤدي إلى تحديد هوية كاذبة من تأثير مضاد للميكروبات. كما العديد من المركبات في المكتبات الفحص هي أن الخلايا حقيقية النواة السامة، هذه ايجابيات كاذبة تطغى مضادات الجراثيم الحقيقية، مما يستلزم عددا كبيرا من المتابعة، المقايسات نقطة النهاية السمية الخلوية للقرار.
وبالتالي، كان من اهتمام كبير لتكون قادرة على تقييم بقاء الخلية حقيقية النواة ونمو الخلايا في وقت واحد. والجدير بالذكر، سمة من سمات الخلايا حقيقية النواة غير قابلة للحياة هي فقدان النزاهة غشاء الخلية. ولذا قد تحقيقات أن اختبار نفاذية غشاء الخلية أن تستخدم لتقييم قابلية الخلية. وتتميز نحن سابقا قدرة سلسلة من خلية مزعومة غشاء impermeant، فلوري، والأصباغ الحمض النووي ملزم للوصول إلى وصمة عار الحامض النووي من الخلايا الميتة. (4) في الحمض النووي ملزم النووي، هذه الأصباغ عرض زيادة كبيرة في quantuم العائد الفلورسنت مما أدى إلى زيادة إشارة على حل الخلفية مضان. على هذا النحو، وفرت هذه الأصباغ قراءات كمية من موت الخلايا حقيقية النواة. 4 والجدير بالذكر أن وجدنا أن عددا منهم كان غير سامة أنفسهم خلال فترة طويلة شارك في الحضانة مع الضامة J774. عندما تضاف أثناء الإصابة الأولية، قدموا في الوقت الحقيقي، قراءات الفلورسنت من موت الخلايا حقيقية النواة التي يمكن أن يقاس على مقياس التألق صفيحة أو احظ مجهريا.
لذلك، من خلال الجمع بين استخدام مراسل البكتيرية وغير سامة، غشاء impermeant، والأصباغ الحمض النووي ملزم، كنا قادرين على تطوير بسيط، غير مدمرة، في الوقت الحقيقي فحص لقياس كل الحمولة الجرثومية وحقيقية النواة السمية لخلايا في وقت واحد. وقد سمح هذا الاختبار لنا على الشاشة في 384 بئر شكل لوحة ~ 10،000 bioactives المعروفة بما في ذلك ~ 250 مضادات الميكروبات و> 240،000 جزيئات صغيرة مع النشاط uncharacterized وظيفيا عن القدرة على كبح نمو الخلايا منالبكتيريا المستروحة، بينما في الوقت نفسه توليد بيانات الخلية سمية الخلايا حقيقية النواة لكل مجمع. وكان 6 تحليلنا لمضادات الميكروبات المعروفة ضد نمو الخلايا من البكتيريا استكشاف أشمل من هذا النوع حتى الآن. 6
وبناء على كفاءة التنسيق فحص لدينا، ونحن أيضا استكشاف في وقت لاحق من الآثار المحتملة المستمرة للمضادات الحيوية المعروفة عند استخدامها في الجمع. واحد من الاختبارات التآزر الأكثر شيوعا، ما يسمى فحص اللوحة، يتم تنفيذ standardly من خلال تقييم الآثار اندماجي من التخفيفات المسلسل شقين اثنين أو أكثر من مضادات الميكروبات. 10 وفي هذه المقايسات، ويعرف التآزر من خلال رصد تأثير أكبر عندما يتم تطبيق اثنين أو أكثر من مضادات الميكروبات معا من مجموع آثار كل تطبيق على حدة. وتجدر الإشارة، حتى الآن، ركز فقط وأجري اختبار التآزر انتقائية ضد الخلايا المستروحة البكتيريا
لتسهيل اختبار التآزر، التي قطعناها على أنفسنا استخدام ما لدينا في الوقت الحقيقي نمو الخلايا / حقيقيات النوى فحص السمية الخلوية في تركيبة مع الآلية التكنولوجيا الاستغناء الرقمية (6). هذا أتمتة يسمح لنا الاستغناء التخفيفات المسلسل من المركبات الذائبة في DMSO أو محلول مائي منفردة أو مجتمعة في شكل 384 أيضا. 11 وعلاوة على ذلك، فإن مثل هذه قوية تكنولوجيا معالجة السائل يسمح لنا لأداء بسهولة دقة أعلى، مربع الجذر لطفلين (بدلا من المعيار، دقة أقل، ومضاعفة) مجموعات تخفيف لتحقيق مستويات أعلى من الدقة في منطقتنا ثنائي الأبعاد، الشطرنج التآزر تحليل. وكان هذا القرار قيمة خاصة في معالجة الشواغل في مجال التآزر حول استنساخ عند استخدام شقين التخفيف سلسلة 12. وأخيرا، كان لدينا فحص الكمي وأيضا ذرefore قياس التدرج من كبت. ونتيجة لذلك، استولت على فحص مجمل المعلومات المثبطة، التعبير عنه في isobolograms isocontour التي isocontours ربط تركيزات اندماجي مع مستويات مماثلة من تثبيط النمو. 6 سمحت هذه الاستراتيجية التآمر تصور اندماجي منحنيات الاستجابة للجرعة. لتوضيح منهجية لدينا، ونحن تصف بروتوكول لدينا لأداء هذه المقايسات وتظهر نتائج ممثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. في الوقت الحقيقي بين الخلايا النمو وخلية حقيقية النواة السمسة الفحص
- إعداد خلايا المضيف (خلايا J774A.1)
- ثقافة J774A.1 المصحف العضلة الخلايا الشبيهة بلعم معلق في RPMI 1640 بنسبة 9٪ تستكمل الحديد العجل المصل. في البداية مرور في قوارير زراعة الأنسجة. بعد الخلايا أصبحت متكدسة في 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة في 15 مل من المتوسط، وتقسيم عن طريق كشط والتخفيف إلى 65 مل مع نفس النوع من المتوسط، منها 15 مل يتم إرجاعها إلى قارورة زراعة الأنسجة و50 مل يتم نقل إلى 250 مل البكتيرية قارورة شاكر.
- لزيادتها والثقافة معلق في 250 مل و / أو 1000 قوارير البكتيرية مل شغل إلى المجلد الخامس واحد مع متوسط زراعة الأنسجة. تهوية عن طريق تحديد سرعة دوران في حوالي 120 لفة في الدقيقة. لنمو مستمر، في احتضان بالضبط 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
- خلايا الحصاد عندما تصل الكثافة في حدود 2.5 × 10 6 خلايا/ مل إلى 5 × 10 6 خلية / مل. ضمان نسبة الخلايا الميتة (يعاير بسهولة عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق) لا تتجاوز 25٪، والخلايا الميتة سيزيد من الضوضاء في الخلفية في فحوصات السمية الخلوية.
- لوحة بيضاء، زراعة الأنسجة المعالجة، 384 جيدا microplates في 5 × 10 4 خلايا J774A.1 في 30 ميكرولتر المتوسطة زراعة الأنسجة لكل بئر. احتضان بين عشية وضحاها microplates لتحقيق 90٪ التقاء في يوم من التجربة.
- إعداد الفلورسنت أو نيون البكتيريا المستروحة
- مرور L. المستروحة (LP02 :: :: flaA لوكس 8) البكتيريا على المتوسط المناسب، أي مخزنة الفحم خلاصة الخميرة (BCYE) متوسطة. في حالة استخدام سلالة العوز الغذائي الثيميدين، تكملة المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل الثيميدين. إعداد بقع من البكتيريا للتجارب عن طريق نشر الكائنات غزيرا على طبق من ذهب BCYE جديدة واحتضان يوم واحد (إذا كان من ممر لوحة السابق) أو 2-3 أيام (إذا كان من الأوراق المالية المجمدة) للحصول على متكدسةنمو.
- إعداد لوحات BCYE عن طريق إذابة 10 جم خلاصة الخميرة، و 10 غرام N - (2-acetamido) حمض -2-aminoethanesulfonic، 0.35 ز ك 2 هبو 4، و 1 غرام أحادي القاعدة البوتاسيوم α كيتوغلوتارات في 950 مل من الماء منزوع الأيونات. ضبط درجة الحموضة إلى 6.9 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (≥2.5 مل من 11.9 حل الرحى).
- إضافة 15 غراما أجار و 2 ز الفحم المنشط. وجلب إلى 1 L الحجم النهائي. إضافة شريط مغناطيسي وجهاز التعقيم. متوسطة بارد إلى 55 درجة مئوية وإضافة حلول فلتر تعقيم تحتوي على 0.4 غرام L-السيستين و 0.42 غرام الأمونيوم الحديد (III) سترات المذاب في الماء منزوع الأيونات. استخدام مغناطيس لوحة ضجة لمزيج قبل صب لوحات بيتري.
- لاختبار نمو المستروحة L. في متوسط النمو ممحوضة، وإعداد ACES وخلاصة الخميرة مرق (آي) عن طريق الجمع بين كل الكواشف الكيميائية المستخدمة لBCYE باستثناء الفحم وأجار. فلتر تعقيم واستخدام على الفور، أو تجميد للتجارب لاحقة.
- الكائنات resuspend في سالي الأنسجة مستنبت المستخدمة لخلايا J774A.1 مع 100 ميكروغرام / مل مكملات الثيميدين حسب الاقتضاء.
- مرور L. المستروحة (LP02 :: :: flaA لوكس 8) البكتيريا على المتوسط المناسب، أي مخزنة الفحم خلاصة الخميرة (BCYE) متوسطة. في حالة استخدام سلالة العوز الغذائي الثيميدين، تكملة المتوسطة مع 100 ميكروغرام / مل الثيميدين. إعداد بقع من البكتيريا للتجارب عن طريق نشر الكائنات غزيرا على طبق من ذهب BCYE جديدة واحتضان يوم واحد (إذا كان من ممر لوحة السابق) أو 2-3 أيام (إذا كان من الأوراق المالية المجمدة) للحصول على متكدسةنمو.
- العدوى بلعم
- إضافة مركبات اختبار الفائدة (مركبات الفحص، والضوابط الإيجابية والسلبية لتثبيط نمو البكتيريا وتحلل الخلايا حقيقية النواة). يفضل حل حلول السهم عند ≥500x في DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل) أو محلول مائي للسماح للتخفيف كاف من السيارة.
- على الرغم من أن الحلول الأسهم يمكن تخزينها المجمدة، وتجنب تجميد أذاب دورات للمركبات عطوب ومضادات الميكروبات.
- تمييع البكتيريا الانارة لاستهداف من 2.5 × 10 6 كفو (مستعمرة تشكيل وحدة) / م والبكتيريا المسمى مراسل الفلورسنت إلى 1.0 × 10 7 خلية / مل في مستنبت النسيج وإضافة غير سامة، غشاء impermeant، الحمضية نوكليك مناسبا صبغة ملزمة في 2.5x و تركيز الفحص النهائي.
- إضافة 20 ميكرولتر من الخليط إلى كل ثقافة J774A.1 جيدا، وحجم الفحص النهائي50 ميكرولتر، تركيز البكتيريا النهائي 1 × 10 6 خلية / مل (لوكس الاوبرون مراسل) أو 4 × 10 10 6 خلية / مل (الفلورسنت مراسل البروتين).
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام في 5٪ CO 2 في 100٪ الرطوبة النسبية لمنع الآثار حافة التبخر.
- إضافة مركبات اختبار الفائدة (مركبات الفحص، والضوابط الإيجابية والسلبية لتثبيط نمو البكتيريا وتحلل الخلايا حقيقية النواة). يفضل حل حلول السهم عند ≥500x في DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل) أو محلول مائي للسماح للتخفيف كاف من السيارة.
- فحص قراءات
- قراءة نمو البكتيريا وسمية الخلايا حقيقية النواة على luminometer صفيحة ومقياس التألق بما يتناسب مع صحفيين المستخدمة.
- لتجنب الآثار الحافة المرتبطة درجة الحرارة، وتتوازن حراريا microplates قبل القراءة التلألؤ من وضع في طبقة واحدة على مقاعد البدلاء المختبر مع الأغطية مواربا لحوالي 20 دقيقة (أو في خزانة السلامة البيولوجية مع الأغطية قبالة لحوالي 10 دقيقة).
- العودة microplates إلى الحاضنة إذا هو المطلوب في الوقت الحقيقي قراءات في نقطة زمنية لاحقة.
- قراءة نمو البكتيريا وسمية الخلايا حقيقية النواة على luminometer صفيحة ومقياس التألق بما يتناسب مع صحفيين المستخدمة.
تحليل 2. البيانات
- تطبيع البيانات ليخدع الإيجابية والسلبيةمفاتيح التحكم لحساب المئة أو أضعاف لتثبيط نمو البكتيريا داخل الخلايا وفي المئة السمية الخلوية للخلايا حقيقية النواة.
- لتقييم فحص متانة، وحساب الفصل إحصائية بين الضوابط الإيجابية والسلبية على حد سواء تثبيط نمو البكتيريا والسمية الخلوية باستخدام Z-عامل (Z ') تحليل حيث Z' = 1-3 (σ ص + σ ن) / | ميكرون ص + ميكرون ن |. في هذه المعادلة، σ p و σ ن هي الانحرافات المعيارية للآبار المراقبة الإيجابية والسلبية، على التوالي؛ μ p و ميكرون ن هي القيم المتوسطة لآبار الإيجابية والسلبية السيطرة على التوالي.
- لفحوصات الكشف الإنتاجية العالية، وحساب القياسية ض عشرات (أو بديل آخر، المقاييس الإحصائية الكمية) لتقييم آثار المركبات اختبار الفائدة. بدلا من ذلك، وحساب بسيطة للحد أضعاف أو تسجيل أضعاف الحد كما يحتمل أن تكون من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية قياس تأثير حجم للبكتيريا تكرار هندسيا.
3. واحد ومتعدد الأبعاد (أي، التآزر) الجرعة والاستجابة اختبار وبيانات التفسير
- إعداد الضامة والبكتيريا كما هو موضح في قسم البروتوكول 1.
- فقط قبل الإصابة أو حضانة ممحوضة، إضافة مضادات الميكروبات من الفائدة التجريبية في المسلسل، ومضاعفة سلسلة التخفيف، وذلك بهدف الممتدة في نهاية عالية التركيز من شأنها أن تزيل تماما النمو (أي التركيز المثبط الأدنى أو MIC) وعلى انخفاض إنهاء الاعتقال التي لم تظهر اي نشاط واضح.
- استخدام نظام مناولة السائل الآلية لتسهيل واحدة بين الجرعة والاستجابة واندماجي إعداد اختبار التآزر من خلال المباشرة، بالإضافة الآلي من التخفيفات المضادة للميكروبات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- النظر في استخدام التخفيفات-مضاعفة الفرعية، على سبيل المثال،841 / 54841eq1.jpg "/> - أضعاف سلسلة التخفيف، وفحص يعيد إلى زيادة دقة واستنساخ البيانات.
- للعدوى بلعم، وتمييع البكتيريا الانارة لاستهداف من 2.5 × 10 6 كفو (مستعمرة تشكيل وحدة) / مل في مستنبت الأنسجة. إضافة 20 ميكرولتر من الخليط إلى كل ثقافة J774A.1 جيدا، وحجم الفحص النهائي 50 ميكرولتر، تركيز البكتيريا النهائي 1 × 10 6 خلية / مل. واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في الرطوبة النسبية 100٪.
- لاختبار نمو ممحوضة، وتمييع البكتيريا الانارة لتركيز النهائي من 1 × 10 6 خلية / مل في آي المتوسطة، إضافة 50 ميكرولتر من كل بئر من 384 لوحة جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في الرطوبة النسبية 100٪.
- حساب مؤشر تركيز مثبط كسور لمجموعات مضادة للميكروبات التي تمنع نمو البكتيريا. لكل دواء في الجمع بين (أ، ب،.. ن) أن يؤدي إلى تثبيط كامل أو> 99٪ من البكتيريا زrowth، وحساب تركيز مثبط كسور الفردية (FIC أ، ب، ن...) على النحو التالي: اللجنة المالية و= تركيز مركب "أ" مقسوما على تركيز مثبط الحد الأدنى من "أ" في حد ذاته. . باستخدام نفس الصيغة، وحساب اللجنة المالية ب، وما إلى ذلك ثم حساب مؤشر FIC اندماجي أو
اللجنة المالية = اللجنة المالية واللجنة المالية + ب +. . .FIC ن لكل تركيبة المثبطة. - استخدام مؤشر اندماجي أن ينحرف أبعد من 1.0 إلى تقييم التآزر. النظر في قطع من ≤0.5 كمؤشر المحافظ من تأثير متناغم و≥4، لها تأثير مضاد. 12
- isobolograms المؤامرة، isobolograms isocontour، و / أو isosurface isobolograms 6 رسوما بيانية كما بديلة من آثار اندماجي.
اللجنة المالية = اللجنة المالية واللجنة المالية + ب +. . .FIC ن لكل تركيبة المثبطة. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
صفيحة فحص نمو الخلايا
البيانية الشكل 1 الخطوات الفحص. الخطوات الآلي يظهر لا يمكن أن يؤديها يدويا. ومع ذلك، ومما يسهل الإنتاجية إلى حد كبير باستخدام أنظمة مناولة السائل.
ويبين الشكل 2 النتائج تمثيلية من 384 بئر صفيحة، مزدوجة قراءات، في الوقت الحقيقي نمو الخلايا وحقيقية النواة فحص الخلايا السمية الخلوية باستخدام سلالة البكتيريا (LP02) التي تحمل إما الاوبرون لوكس (أرقام 2A، 2B) أو mNeptune2 ببروتين ( الشكل 2C، 2D) المراسل. ([دمس، والمضادات الحيوية، سابونين) تم إضافة مركبات الإيجابية والسلبية التحكم لوحات من خلال استخدام الروبوت نقل دبوس لمحاكاة الأداء في إعداد فحص عالية الإنتاجية. البكتيريا كبيرة (أرقام 2A، 2C) يمكن تمييزها بسهولة بالمقارنة مع تحلل سابونين وضوابط المعالجة المضادات الحيوية في 24-72 ساعة للبكتيريا الانارة و 48 إلى 72 ساعة للبكتيريا وصفت mNeptune2، على التوالي. البكتيريا عادة انحلال الخلايا المضيفة بعد تكرار ل48 إلى 72 ساعة. وهذا يمكن أن يكون موضع تقدير في أرقام 1B و1D، والتي تظهر زيادة مضان من SYTOX الأخضر (ممثل، impermeant، النووي صبغ ملزم حامض وعلامة على موت الخلية المضيفة) مع مرور الوقت. سمية الخلايا في نهاية المطاف تصل كمية ممكنة لوحظ في المنظفات (سابونين)، الخلية المضيفة تحلل، مراقبة إيجابية. تم إضافة الكائنات المسماة mNeptune2-في اللقاح تزيد بأربعة أضعاف من لوكس البكتيريا المسمى الاوبرون، من المرجح أن يمثل أكثر المضيفة السريع قتل الخلية وترتبط في وقت سابق ارتفاع في إشارة مضان في التجارب mNeptune2. كما هو متوقع، والعلاج المضادة للميكروبات فعالة (الليفوفلوكساسين أو أزيثروميسين) السابقented النمو والمضيف البكتيريا تحلل الخلية. على العكس من ذلك، والمركبات السامة للخلايا أن يقتصر نمو الخلايا عن طريق تدمير الخلايا المضيفة (على سبيل المثال، سابونين) يمكن بسهولة التعرف من خلال مزيج من التألق منخفضة أو mNeptune2 مضان، وارتفاع إشارة المرتبطة السمية الخلوية. وعلاوة على ذلك، رصد انخفاض جنبا إلى جنب في كل من التألق وmNeptune2 مضان (نمو البكتيريا)، والسمية الخلوية قدمت معقولة من الثقة أن المجمع هو المانع من نمو الخلايا صحيح (على سبيل المثال، أزيثروميسين والليفوفلوكساسين الضوابط الإيجابية) بدلا من إيجابية كاذبة الناجمة عن تدخل زائفة مع إشارة مراسل البكتيرية.
يظهر 3 Z التمثيلي "لمدة ثلاثة صحفيين البكتيرية المختلفة (الاوبرون لوكس، mNeptune2، tdTomato) وما يقابلها من قراءات مضان بالنسبة لضوابط - الجدول 1. A Z '> 0.5 يشير إلى STATISTICAالقوي LLY الفحص المناسب لإعدادات عالية الإنتاجية؛ ومع ذلك، أقل Z 'قد تكون مناسبة اعتمادا على أهداف تجريبية، أي القدرة على التمييز بشكل موثوق آثار أكثر أو أقل دهاء من المركبات اختبار أو اضطرابات. وبناء على نتائج الشكل 2، كان mNeptune2 ليس كما حساسة مراسل باعتبارها الاوبرون وسيفيراز البكتيرية. لذلك، كما هو متوقع، فرقا قوية بين إشارة mNeptune2 في السالب ([دمس]) والموجب (الليفوفلوكساسين، أزيثروميسين، سابونين) لم يكن لوحظ الضوابط المانع النمو حتى يوم 2 أو 3 أيام من الحضانة، على النقيض من وقت مبكر، إشارة قوية إلى حد معقول من لوكس البكتيريا مراسل الاوبرون في يوم 1 بعد الإصابة. في المقابل، tdTomato، مراسل الفلورسنت البكتيرية بديل، أظهر Z الأمثل "طوال المعدية. أسفرت خصائص الفلورسنت دون المستوى الأمثل في جزء من التعديات من الإثارة مضان والذيل الانبعاثات في نطاق استخدامها لقراءات المثلى من tdTomato الصورةignal. يمكن تقدير هذا التعدي من Z إيجابي "وجدت في tdTomato سابونين مقابل المقارنة الليفوفلوكساسين (في إشارة إلى اختلاف كبير في أعداد البكتيريا تحت شرطين حيث أن البكتيريا لا تكرار). هذه النتيجة يمكن تفسير تحلل سابونين مما تسبب في إشارة مضان قوية، الذين الكشف عن الانبعاثات tdTomato، وبالتالي يؤدي إلى اختلاف زائفة بين سابونين والضوابط المضادات الحيوية الذيل. لذلك، في حين أن لوكس البكتيرية وصحفيين mNeptune2 في تركيبة مع مضان تظهر قابلة للاستخدام المزدوج قراءات،، المقايسات الحل القائم في الوقت الحقيقي، وtdTomato والجمع بين مضان، على الأقل دون مزيد من deconvolution إشارة الرياضي، لا.
ويبين الشكل 3 تنطبق أمثلة من منحنيات الاستجابة للجرعة من مضادات الميكروبات المعروفة باستخدام الاوبرون لوكس، والكائنات المسمى المراسل. 6 والجدير بالذكر أن البكتيريا لا لا تنمو في مستنبت الأنسجة. لذلك، وتكرار البكتيريا في فحوصات العدوى بلعم لا تعبر سوى نمو الخلايا. ومع ذلك، فإن البكتيريا تنمو axenically في وكالة متخصصة، منخفض الصوديوم، ACES السائل (N - (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic حامض) خلاصة الخميرة المتوسطة. وتمت مقارنة 20 هنا التأثيرات على نمو الخلايا وممحوضة. باستخدام هذه الأنظمة النمو اثنين، لاحظنا أن مضادات الميكروبات القطبية مثل β-اكتام (الميروبينيم، سيفترياكسون) وأمينوجليكوزيدات (لا تظهر البيانات) هي مثبطات الفقيرة من نمو الخلايا، وعلى النقيض من تأثيرات قوية على النمو ممحوضة. يفترض أن يستند فعالية الفقيرة في فحوصات العدوى بلعم على عدم القدرة على الوصول إلى داخل الخلايا البكتيريا المتخصصة تنسخي. في المقابل، مضادات الميكروبات خلايا حقيقية النواة توغل مثل الكينولون (الليفوفلوكساسين) والأزيتروميسين، أظهرت آثار قوية على كل من البكتيريا داخل الخلايا وممحوضة.
together.within الصفحات = "1"> بالإضافة إلى ذلك، استخدام الفحص سمح منحنيات الاستجابة للجرعة مزدوجة قراءات لكل من تثبيط البكتيريا وسمية الخلايا حقيقية النواة يتم تحديده لاحقا في نفس التجربة. على وجه التحديد، IC 50 (تركيز 50٪ تثبيط نمو البكتيريا) وCC 50 (تركيز أن يدفع 50٪ حقيقيات النوى موت الخلية) يمكن تحديده، والانتقائية، CC 50 / IC 50، محسوبة. جميع التدابير الثلاثة هي المعايير الهامة للتقدم المركب في جهود اكتشاف المخدرات. ويبين الشكل 4 مثال على هذه المزدوجة، منحنيات الاستجابة للجرعة ردا على الدوكسيسيكلين المضادات الحيوية، والبيانات التي تم الحصول عليها من نفس الآبار فحص مع مرور الوقت. في الشكل 4A، في يوم 1 من العدوى، عن تكرار البكتيرية مئات أضعاف هو واضح في آبار اختبار المضادات الحيوية الصفر مقارنة مع أعلى مستويات تثبيط لوحظ مع المضادات الحيوية. كان هناك الحد الأدنى المرتبطة سمية الخلايا حقيقية النواة إلا في doxycy عالية جداتركيزات كلاين (≥10 ميكروغرام / مل). في يوم 2 (الشكل 4B)، وكانت البكتيرية إشارة لوكس ما يقرب من 10 أضعاف أكبر من يوم 1 مع سمية الخلايا المرتبطة تكرار البكتيرية كبيرة عند التركيزات المنخفضة المضادة للميكروبات. كما هو متوقع، ويتتبع البكتيرية الناجمة عن تكرار موت الخلية المضيفة بشكل وثيق مع أرقام البكتيرية (إشارة لوكس) في جميع أنحاء منحنى الاستجابة للجرعة مضادات الميكروبات. في تركيزات مضادات الميكروبات أعلى يتم تقليل السمية الخلوية إلى خط الأساس، حتى تركيزات عالية جدا، حيث يظهر الدوكسيسيكلين مرة أخرى سامة كما لوحظ في يوم 1. التحول الواضح من التألق الاستجابة للجرعة نحو تركيزات مضادات الميكروبات أعلى قليلا مقارنة القياسات السمية الخلوية القائم على مضان مبالغ فيه إلى حد ما عندما يخططون التلألؤ والسمية الخلوية في سجل والخطية المقاييس، على التوالي، كما هو مبين. كان IC 50 لنمو البكتيريا ما يقرب من 100 نانوغرام / مل في حين كان CC 50 ما يقرب من 10 ميكروغرام / مل، 50 التي سبق وصفها لتلقي العلاج الدوكسيسيكلين من سلالة الكريات البيض، HL-60 خط الخلية. 21 لذلك، كانت الانتقائية الشاملة المحددة في هذه التجربة المزدوجة قراءات ما يقرب من 100.
الرقم 5 معارض تنطبق isobolograms isocontour المرتبطة الاختبارات التآزر ثنائية الأبعاد التي تم اختبارها تركيبات البشرى من مضادات الجراثيم للحصول على تأثير معزز ضد الخلايا المستروحة L.. 6 وعلى الرغم من isobolograms معيار ربط أقل تركيز اندماجي من المضادات الحيوية التي تمنع تماما النمو، اخترنا، استنادا إلى البيانات المثبطة الكمية المتاحة، لتوصيل النقاط مع مستويات مماثلة من تثبيط استخدام isocontours. الحق الأكثر isocontour في هذه المخططات يتوافق مع خط isobologram القياسية. تشير isobolograms مقعرة عموما التآزر، في حين جنرل محدب isobologramsذ تشير إلى اللامبالاة أو العداء. وترد أمثلة على التآزر (لوحات AC) واللامبالاة (DF)، في هذه الحالة المقابلة لقيم مؤشر FIC من <0.5 و ≥1، على التوالي. 6
وتجدر الإشارة، تظاهر تركيبات البشرى من أزيثروميسين، المينوسكلين، والريفامبيسين التآزر. لذلك، تم اختبار هذه العوامل معا في تركيبة ثلاثية كما هو مبين في الشكل (6) (6). هنا، وجه سطح لربط أقل تركيز اندماجي من مضادات الميكروبات الثلاثة التي أدت إلى> 99٪ تثبيط نمو الخلايا البكتيرية. السطح على شكل مقعر، لاحظ، في حد ذاته يوحي التآزر ثلاثي الأبعاد، يتفق مع مؤشر FIC المنخفض (0.325) يدل على تأثير التآزر كبير.
الجدول 1: Z 'لوكس الاوبرون-تقريرإيه، البكتيريا infection- المقارنة بين الضوابط الإيجابية والسلبية. Z 'تتوافق مع نقاط البيانات هو مبين في الشكل 2A، 2B. تم تعديل هذا الجدول من تشيارافيجليو وكيربي 2014. 4 إيجابي التلألؤ Z '> 0.25 يتم تسليط الضوء مع شخصيات الصفراء على خلفية سوداء.
الجدول 2: Z 'لmNeptune2-مراسل البكتيريا عدوى - مقارنة بين الضوابط الإيجابية والسلبية. Z 'تتوافق مع نقاط البيانات هو مبين في الشكل 2C، 2D. ويسلط الضوء mNeptune2 إيجابي مضان Z '> 0.25 مع شخصيات الحمراء.
الجدول 3: Z 'لtdTomatس مراسل البكتيريا عدوى - مقارنة بين الضوابط الإيجابية والسلبية. ويسلط الضوء الإيجابي tdTomato مضان Z '> 0.25 مع شخصيات الحمراء. ويسلط الضوء Z ايجابية كاذبة '> 0.25 المتعلقة التداخل في SYTOX الخضراء وانبعاث tdTomato مع شخصيات الخضراء.
الشكل 1: تمثيل تصويري من إعداد مقايسة ثنائي المراسل. (A) Replating الخلايا J774A.1 نمت في تعليق في أطباق 384 أيضا. (ب) إضافة للمركبات التي تهم microplates. (ج) الإصابة في وقت واحد وإضافة الأصباغ ملزم الحمض النووي. حضانة؛ وقراءات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا التين لدى عودتهم.
الشكل 2: المزدوج، في الوقت الحقيقي قراءات من نمو البكتيريا داخل الخلايا وسمية الخلايا حقيقية النواة في شكل الإنتاجية العالية. المقابلة التلألؤ (A) وإشارات فلوري (ب) خلال العدوى داخل الخلايا من الخلايا J774A.1 مع لوكس، معربا عن الاوبرون البكتيريا المستروحة. المقابلة ببروتين (C) وإشارات الفلورسنت (D) خلال العدوى داخل الخلايا من الخلايا J774A.1 مع mNeptune2، معربا عن البكتيريا المستروحة. وتظهر أربعة العلاج: السيطرة DMSO السلبية ( 
)؛ السيطرة سمية الخلايا إيجابية، سابونين ( 
)؛ وإيجابية البكتيرية الضوابط تثبيط النمو، أزيثروميسين (نشوئها 4 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) والليفوفلوكساسين ( 
). وتمثل نقاط البيانات متوسط والانحراف المعياري من 96 مكررات أداء في لوحات مكررة، 384 أيضا. وكانت المذكرة، ومعيار أشرطة الخطأ انحراف لبعض نقاط البيانات الحد الأدنى، وبالتالي مخبأة داخل حرف نقطة البيانات. لوحات ألف وباء قد تم تعديلها من تشيارافيجليو وكيربي 2014. 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): أمثلة التمثيلية للفحوصات ذات بعد واحد، الاستجابة للجرعة. أصيب خلايا J774A.1 مع لوكس الاوبرون، معربا عن، L. المستروحة وتعامل مع سلسلة تخفيف شقين من مضادات الجراثيم وأشارت (لاbeled باسم 'داخل الخلايا). في موازاة ذلك، لوكس معربا عن الاوبرون، كانت تضعف البكتيريا إلى نفس تركيز النهائي في ACES خلاصة الخميرة المتوسطة (آي) وتعامل مع متطابقة، سلسلة تخفيف شقين (وصفت بأنها "ممحوضة '). وقد قرأ التلألؤ يومين التلقيح آخر البكتيرية وتآمر مقابل تركيز مضادات الميكروبات. لوحة وتشمل مضادات الجراثيم تستخدم عادة لعلاج عدوى البكتيريا. لوحة ب يقارن نشاط المضادات الحيوية ماكرولايد مختلفة. لوحة C تشمل عدة فئات مختلفة من مضادات الميكروبات مع اختلاف وتباين داخل وقوة ممحوضة في بعض الأحيان. وتمثل نقاط البيانات المتوسطات والانحرافات المعيارية من ثلاث آبار اختبار منفصلة لكل حالة. تم تعديل هذا الرقم من تشيارافيجليو وكيربي عام 2015. 6 الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على ثنائي قراءات، تجربة الجرعة والاستجابة لتحديد IC 50، CC 50 والانتقائية. وتم تحديد آثار الدوكسيسيكلين على النمو والخلايا J774A.1 الخلايا السمية الخلوية في أيام 1 و إصابة آخر 2. وتمثل نقاط البيانات المتوسطات والانحرافات المعيارية من ثلاث آبار اختبار منفصلة لكل حالة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال لفحوصات التآزر ثنائية الأبعاد. ديل التسلسلي اندماجيتم اختبار utions من أزواج من مضادات الجراثيم للتآزر ضد نمو الخلايا من البكتيريا في الضامة J774A.1. خطوط Isocontours ربط نقاط في المئة تثبيط مماثل. وisobologram أقصى اليمين يربط معا مع كامل تثبيط نمو الخلايا (> 99٪ تخفيض التلألؤ مقارنة مع الضوابط غير المعالجة) ويتوافق مع مؤامرة isobologram القياسية. يشير التظليل في المئة تثبيط كما تحددها مفتاح مرمزة في كل رسم بياني. Isocontours من اليسار إلى اليمين تتوافق مع 100، 90، 80، 70، 60، 50، 40، 30، 20، 10، 5، و 1٪ نمو بالنسبة لعلاج الضوابط. تم تعديل هذا الرقم من تشيارافيجليو وكيربي عام 2015. 6 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفنا فحوصات في الوقت الحقيقي للكشف في وقت واحد من نمو البكتيريا داخل الخلايا والسمية لخلايا المضيف. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. أولا، لأداء فحص قوي، يجب أن يكون هناك ما يكفي من الفصل الطيفي بين قراءات البكتيرية والسمية الخلوية. هذا الفصل هو جوهري لمجموعات من الصحفيين الاوبرون وسيفيراز والأصباغ الحمض النووي ملزم الفلورسنت. ومع ذلك، استنادا إلى تجربتنا (الجدول 1-3، الشكل 2)، واستخدام مزدوج، قراءات الفلورسنت يتطلب إشارات فلوري متداخلة غير (على سبيل المثال، استخدام بعيدة الحمراء مراسل بروتين فلوري والأخضر وصمة عار الحمض النووي) للحصول على القوي، البيانات القائمة على الحل. وعلاوة على ذلك، من خبرة سابقة، يحتمل أن تكون متصلة البصريات القارئ المتاحة أو خصائص حل مضان، فقط بقع الحمض النووي مع انبعاث الأخضر أو البرتقالي فرت بيانات قابلة للاستخدام سمية الخلايا، أي Z 'أكبر من> 0.5، وهو مقياس يدل على stronز أداء الفحص. 4 لذلك، يتم تقييد على أساس حل، فحوصات مزدوجة قراءات نوعا ما من حيث ما يمكن أن تستخدم للصحفيين.
خطوة حاسمة أخرى هي نسبة إصابة البكتيريا إلى الضامة. عدوى بكتيرية يدفع موت الخلية المضيفة. لذلك، وارتفاع مفرط اللقاح قد يؤدي إلى أوائل موت الخلية المضيفة، ومستويات منخفضة نسبيا من تكرار البكتيرية، والتشويش المحتملة الآثار السامة للخلايا مباشرة من مضادات الميكروبات تحت الدراسة. نسبة اصابة المناسبة يمكن تحديد تجريبيا وقد تعتمد على فوعة سلالة بكتيرية معينة قيد الدراسة. وهناك نسبة منخفضة من حوالي 1: 1 هو نقطة انطلاق جيدة. تجارب مثل تلك التي تظهر في الشكل 2 والجداول 1 - 3 سوف يقوم مع العديد من نسب الإصابة يسمح التقييم والتحسين من الظروف لاستخدامها في المقايسات في المستقبل. وتجدر الإشارة، لالبكتيريا على وجه الخصوص، واستخدام خلفية التوتر مع ناتively أقل سمية الخلايا الخلية المضيفة (المسخ فلاجيلين) 8 ساهمت إلى حد كبير في متانة فحص عالية التي تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، ترجمة تقنية مزدوجة قراءات في داخل الخلايا الأخرى، قد تتطلب أنظمة الممرض في استضافة أيضا تعديلات إضافية على بروتوكول العدوى. البكتيريا لا تنمو في وسط زراعة الأنسجة، مما يسمح لنا أن نعزو زيادة إشارة مراسل لنمو الخلايا وحدها. ومع ذلك، فإن العديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا (على سبيل المثال، البروسيلا) يمكن أن تنمو بدرجات متفاوتة سواء داخل الخلية والمتوسطة في زراعة الأنسجة. لذلك، خطوات إضافية مثل العلاج جنتاميسين وغسل الخلايا المضيفة بعد الإصابة الأولية قد تكون ضرورية للحد من تكاثر الخلية ويسمح الفحص الانتقائي للقدرة تكرار داخل الخلايا. 22
ويرتبط الفحص على نطاق والمتابعة للاستخدام في الإنتاجية العالية الفحص والتآزر اختبار مع مجموعتها الخاصة من التحديات. الأكثر خاصلاي، وجدنا أن أعداد كبيرة من الخلايا J774A.1 اللازمة يمكن أن يكون أفضل مثقف في قوارير زراعة الأنسجة البكتيرية بدلا من التقليدية (انظر الشكل 1). ومع ذلك، للحفاظ على عقم الثقافة، تم العثور على إسفنج أو غيرها من القبعات مرشح لهذه القوارير الأفضل القياسية قبعات قارورة البكتيرية. وضع منصة شاكر المدارية الصغيرة داخل نسيج الثقافة الحاضنة القياسية يسمح لنا لأداء ثقافة على نطاق ومع المعدات في متناول اليد. وأخيرا، استخدام أنظمة صرف الآلي (الشكلان 1A، B) سهلت كثيرا الإعداد فحص واختبار سلسلة تخفيف اندماجي.
والجدير بالذكر أن الكشف الكافي النسخ المتماثل البكتيرية يعتمد على القدرة على التعبير بما فيه الكفاية إما الاوبرون لوكس أو ببروتين في سلالة بكتيرية من الفائدة. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بإنشاء مجموعة من الترانسبوزونات مراسل الفلورسنت والاوبرون لوكس يقودها المروج التأسيسية القوي الذي يجب أن تسمح كرة القدمcile وضع علامات على أنواع مختلفة من البكتيريا (كانغ وكيربي، لا تظهر البيانات). بدلا من ذلك، لمسببات الأمراض التي يثبت السامة للخلايا لخلية المضيف تكرار داخل الخلايا، والقياسات السمية الخلوية في الوقت الحقيقي وحده يمكن أن تستخدم كبديل للنسخ المتماثل بين الخلايا. ومع ذلك، في هذه الحالة، والمركبات السامة للخلايا وغير نشطة لا يمكن تمييزها بشكل صحيح في فحص واحد.
توافر الوقت الحقيقي قراءات من يوفر ميزة خاصة لفحوصات الكشف الإنتاجية العالية. على وجه التحديد، وتجنب تقييم نقطة النهاية للنمو البكتيري (مستعمرة تشكيل وحدة المصير) (7) والسمية الخلوية (إضافة كاشف بقاء الخلية في إنهاء الفحص) 23،24 يزيل العديد من الخطوات التجريبية والعمل المرتبطة بها. وعلاوة على ذلك، دوام يمكن بسهولة المتبعة في نفس الآبار فحص مع الحد الأدنى من الزيادة في جهد تجريبي. الأهم من ذلك أن توافر نوعين متميزين من الصحفيين تكرار البكتيريا (الجراثيمل الاوبرون والبروتين الفلوري لوكس) له أهمية خاصة بالنسبة للالإنتاجية العالية تطوير فحص فحص. على وجه التحديد، كاذبة قراءات مضادات الميكروبات الإيجابية الناتجة عن تدخل زائفة مع الاوبرون لوكس أو الإخراج مراسل فلوري يمكن معالجتها من خلال استخدام كل من صحفيين بالتتابع في المقايسات المتعامدة التكميلية في الفحص الابتدائي والثانوي، على التوالي 25. والجدير بالذكر أن وجدنا أن لوكس الاوبرون البكتيري كان مراسل أكثر حساسية للنمو البكتيري مع ما يقرب من 20 أضعاف لتصل إلى 100 أضعاف الحد كشف أقل من مراسلي البروتين الفلوري. ومع ذلك، خرج لوكس من المرجح تخضع لمزيد من ايجابيات كاذبة على أساس العديد من المنتجات الجينات والخطوات المطلوبة لإخراج الضوء. 26 وبشكل أكثر تحديدا، في المقابل للصحفيين وسيفيراز جين واحد وحيد الخلية، ولوكس الاوبرون الجرثومية مجموعة خمسة الجينات التي تكود كل من الانزيم والجينات وسيفيراز ثنائي مكون لتخليق الذاتية الركيزة وسيفيراز. أنه سيكونمعنى بالتالي لاستخدام مراسل المشغل لوكس في الشاشة الرئيسية لضمان حساسية كافية، وصحفيين البروتين الفلوري في المقايسات الثانوية لضمان خصوصية.
أخذت معا، فإن المنهجية المبينة يوفر في الوقت الحقيقي، والبدائل غير مدمرة لنقطة النهاية فحوصات لقياس تكرار البكتيرية والسمية الخلوية حقيقية النواة، وبالتالي تمثل بسيط المنهجية والأسلوب تنوعا لتقييم الآثار المضادة للميكروبات على مسببات الأمراض داخل الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد دراسة نشرت في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم جائزة R01AI099122 إلى JEK المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية لل الصحة. ونود أن نشكر جنيفر سميث، ديفيد روبل، سو تشيانغ، دوغ الفيضانات، شون جونستون، جنيفر Nale، ستيوارت Rudnicki، بول يان، ريتشارد سيو، وراشيل واردن من مرفق فحص ICCB-لونجوود و / أو مختبر الفحص الوطني ل للمراكز الإقليمية لنيو إنجلاند للتميز في الدفاع البيولوجي والأمراض المعدية (بدعم من U54AI057159) للمساعدة في التنمية وأداء المقايسات فحص عالية الإنتاجية الناشئة. كما نود أن نشكر كينيث سميث لتعليقات مفيدة على المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J774A.1 cells | American Type Culture Collection | TIB-67 | Host cell |
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Yeast extract, ultrafiltered | Becton-Dickinson/Difco | 210929 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors |
| Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt | Sigma-Aldrich | K2000 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Potassium phosphate, dibasic | Thermo Fisher Scientific | P288-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7755 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Ammonium iron(III) citrate | Sigma-Aldrich | F5879 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately |
| Potassium hydroxide solution, concentrated | Thermo Fisher Scientific | SP236-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Deonized water | N/A | N/A | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Thymidine (tissue culture grade) | Sigma-Aldrich | T1895 | For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640 |
| RPMI 1640, standard formulation | Corning via Thermo Fisher Scientific | 10-040-CV | For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine |
| RPMI 1640 lacking phenol red | Corning via Thermo Fisher Scientific | 17-105-CV | For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use |
| L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) | HyClone via Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration |
| Iron-supplemented calf serum | Gemini Bioproducts | 100-510 | For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density |
| SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S7020 | For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration. |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-255-26 | For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead) |
| Orbital shaker | BellCo Glass | 7744-01010 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately) |
| Shaker flasks (250 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-04 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (250 ml) | BellCo Glass | 7744-16250 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker flasks (1,000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-07 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (1,000 ml) | BellCo Glass | 7744-16100 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-1490-038 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps |
| MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes |
| Combi standard bore manifold | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl |
| White 384 well dishes treated for tissue culture | Corning | 3570 | For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully |
| DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving positive control and test compounds |
| Azithromycin | Sigma-Aldrich | PHR1088 | Antibiotic positive control |
| Saponin (from Quillaja bark) | Sigma-Aldrich | S-4521 | Cytoxicity positive control |
| Multichannel pipettor | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette | For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing |
| Epson pin transfer robot | Epson/ICCB-L | (Custom equipment) | For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays |
| D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | D300 | For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl |
| T8+ cartridges for D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | T8+ | For dispensing test compounds |
| Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera | Nikon | Ti | For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution |
| Glass-bottom tissue culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope. These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms. |
| Photoshop CS6 | Adobe | Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images. | |
| Mathematica 10 | Wolfam | For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms. |
References
- Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
- Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
- Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones? Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
- Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
- Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
- Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).
- Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
- Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
- Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
- Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
- Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457 (2014).
- Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).
