Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Высокая пропускная способность, в режиме реального времени, двойного считывания Тестирование внутриклеточного антимикробной активности и эукариотической клетки цитотоксичность

Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54841
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center

Abstract

Традиционные меры внутриклеточного антимикробной активности и эукариотических клеток цитотоксичности полагаются на конечных анализов. Такие конечные точки анализы требуют несколько дополнительных экспериментальных шагов до начала считывания, такие как лизис клеток, определение элементарной колониеобразующих или добавления реагента. При выполнении тысячи анализов, например, во время высокопроизводительного скрининга, усилие вниз по течению, необходимое для этих типов анализов значительна. Поэтому, чтобы облегчить высокую пропускную способность противомикробное открытие, мы разработали анализ в режиме реального времени для одновременного идентификации ингибиторов внутриклеточного роста бактерий и оценки эукариотической клетки цитотоксичность. В частности, обнаружение внутриклеточный рост бактерий в режиме реального времени стало возможным благодаря маркировке бактериальных штаммов скрининга либо с бактериальным лк оперона (1 - е поколение) для анализа или флуоресцентный белок репортеров (2 - го поколения, ортогональным анализ). Нетоксичное, клеточная мембрана-impermeant, кислотно-связывающий краситель нуклеиновойТакже была добавлена ​​во время первичного инфицирования макрофагов. Эти красители исключаются из жизнеспособных клеток. Тем не менее, нежизнеспособные клетки-хозяева теряют целостность мембраны, разрешающий вход и флуоресцентного мечения ядерной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Следует отметить, что связывание с ДНК связано с большим увеличением флуоресцентного квантовым выходом, который обеспечивает считывание решение на основе гибели клетки-хозяина. Мы использовали этот комбинированный анализ для выполнения экран высокой пропускной способностью в формате микропланшетов, а также для оценки внутриклеточного роста и цитотоксичности с помощью микроскопии. Следует отметить, что противомикробные может демонстрировать синергизм в которых комбинированное действие двух или более антимикробных при применении вместе больше, чем при применении по отдельности. Тестирование на синергии в пробирке против внутриклеточных патогенов , как правило, чудовищный задача , как должна быть оценена комбинаторные перестановками антибиотиков при различных концентрациях. Тем не менее, мы обнаружили, что наши в режиме реального времени анализа в сочетании с автоматизированной, цифровой технологии раздаточного рermitted легкое тестирование синергии. Используя эти подходы, мы были в состоянии систематически обследовать действие большого числа одних антимикробных и в сочетании с внутриклеточным патогеном, легионелл.

Introduction

Возбудители, которые растут или временно проживают в внутриклеточным трудно терапевтически искоренить. Облигатные или относительно облигатные внутриклеточные патогены , такие как легионелл, Coxiella burnetii, Brucella SPP. , Francisella tularensis и Mycobacterium SPP. часто требуют длительного курса антибактериальной терапии для лечения, которые могут варьироваться от нескольких месяцев до даже лет. Кроме того, внеклеточные патогены могут скоротечно занимают внутриклеточные ниши и таким образом избежать зазора обычными курсами антибактериальной терапии, а затем появляются, чтобы начать новые раунды вирулентных инфекции. Золотистый стафилококк 1 и уропатогенные Enterobacteriaceae 2,3 инфекции два все чаще признаются примеры. Таким образом, основной целью обнаружения наркотиков является выявление новых противомикробных препаратов, которые проникают во внутриклеточные отсеки. Оптимальная терапия быстро ликвидироватьвнутриклеточные микроорганизмы и предотвратить развитие резистентности через суб-ингибиторной антимикробного воздействия особенно желательно.

С этой целью мы разработали технологию высокопроизводительного скрининга для выявления внутриклеточных-пенетранта противомикробные препараты , нацеленные на внутриклеточный рост модели патогена, легионелл. 4 Предыдущие клинические наблюдения указывают на то, что стандартное тестирование чувствительность к антибиотикам не точно предсказать , в естественных условиях терапевтической эффективности против этого организма. 5 В частности, это произошло потому , что основные классы противомикробных , таких как бета-лактамов и аминогликозидов, хотя они весьма эффективны против axenically выращенного Legionella, не в достаточной степени проникают в внутриклеточные отсеки , где Legionella проживает. 5,6 Впоследствии данные свидетельствуют о том, что технически более сложные анализы внутриклеточного роста эффективно предсказали клиническую эффективность. 7

Таким образом, мы разработали технологию для определения в реальном времени внутриклеточного роста бактерий. 6 Это было достигнуто за счет использования бактериального штамма модифицированного путем интеграции либо бактериальной люциферазы оперон 8 (проба первого поколения, описанный ранее) 4 или флуоресцентный белок 9 репортеров (второго поколения, ортогональный анализе описано здесь) в бактериальную хромосому. Таким образом, люминесцентный или флуоресцентный сигнал обеспечивает заменяющим, в режиме реального времени отсчет бактериального числа.

Тем не менее, эти атрибуты не затрагивают основную confounder внутриклеточного infectioп анализы, вне цели воздействия на клетки-хозяева. В частности, гибель клетки-хозяина по своей сути ограничивает внутриклеточный рост и приводит к ложной положительной идентификации антимикробного эффекта. Поскольку многие соединения в библиотеках скрининга являются эукариотической клетки токсические, такие ложные срабатывания будут подавлять истинные противомикробные средства, что требует большого количества наблюдения, конечная точка цитотоксичности для разрешения.

Таким образом, это был большой интерес, чтобы быть в состоянии оценить жизнеспособность клеток эукариот и внутриклеточный рост одновременно. Следует отметить, что характеристика нежизнеспособных эукариотических клеток является потеря целостности клеточных мембран. Поэтому Зонды, которые проверяют проницаемость клеточной мембраны, могут быть использованы для оценки жизнеспособности клеток. Ранее мы охарактеризовали способность ряда предполагаемо клеточных мембран-impermeant, флуоресцентный, ДНК-связывающих красителей для доступа и окрашивает ядерную ДНК мертвых клеток. 4 При связывании ядерную ДНК, эти красители показывать значительное увеличение quantuм флуоресцентный выход приводит к увеличению сигнала над фоном раствора флуоресценции. Таким образом, эти красители при условии количественного считывания эукариотической клеточной гибели. 4 Следует отметить, что мы обнаружили , что некоторые были не токсичны сами по себе в течение длительного совместной инкубации с J774 макрофагами. При добавлении во время первичной инфекции, они обеспечили в режиме реального времени, флуоресцентный отсчет эукариотической клеточной смерти, которая может быть измерена с помощью микропланшет флуориметре или наблюдаемую микроскопически.

Таким образом, путем объединения использование бактериального репортера и нетоксичного, мембранная-impermeant, ДНК-связывающие красители, мы смогли разработать простой, неразрушающий, в режиме реального времени анализа для измерения как бактериальной нагрузки и эукариотической клетки цитотоксичность одновременно. Этот анализ позволил нам экран в 384-луночного формата пластины ~ 10000 известных биоактивных включая ~ 250 антимикробные и> 240000 малые молекулы с функционально неохарактеризованной активностью по способности ингибировать внутриклеточный ростЛегионелл, в то же время при создании эукариотических данных цитотоксичности для каждого соединения. 6 Наш анализ известных антимикробных против внутриклеточного роста легионелл был наиболее полное исследование этого типа на сегодняшний день. 6

На основе эффективности нашего формате анализа, мы также исследовали в дальнейшем потенциально синергетические эффекты известных антимикробных при использовании в комбинации. Одним из наиболее распространенных тестов синергии, так называемый шахматный анализ, Стандартно выполняется путем оценки комбинаторных эффектов двукратными серийными разведениями двух или более противомикробных препаратов. 10 В этих анализах, синергизм определяется наблюдением большего эффекта , когда два или более противомикробные препараты применяются вместе , чем сумма эффектов каждого применяемого отдельно. Следует отметить, что до сих пор, только целенаправленным и селективным тестирование синергии проводили против внутриклеточных легионелл

Для облегчения тестирования синергии, мы использовали наш реального времени внутриклеточного роста / эукариотической анализа на цитотоксичность в сочетании с автоматизированной цифровой технологией раздаточного 6. Это автоматизации позволило нам обойтись серийных разведений соединений, растворенных в диметилсульфоксиде или в отдельности или в комбинации в виде 384-водного раствора. 11 Кроме того, такая надежная технология жидкости обработка позволила нам легко выполнять более высокое разрешение, квадратного корня из двух (а не стандарт, более низкое разрешение, удвоение) комбинации разбавления для достижения более высоких уровней специфичности в нашем двумерная, в шахматном порядке синергии анализ. Это разрешение было особенно ценно в решении проблем в области синергии о воспроизводимости при использовании двукратном разбавлении серии 12. И, наконец, наш анализ был количественным, а также TherEfore измеряется градаций торможения. В результате, анализ захватили полноту ингибиторной информации, экспрессируемый в isocontour isobolograms, в котором isocontours соединить комбинаторные концентрации с аналогичными уровнями ингибирования роста. 6 Эта стратегия позволила визуализировать построение комбинаторных кривых доза-ответ. Чтобы проиллюстрировать нашу методологию, мы описываем наш протокол для выполнения этих анализов и показывают репрезентативные результаты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. в реальном масштабе времени внутриклеточный роста и эукариотической клетки цитотоксичности

  1. Подготовка клетки-хозяева (J774A.1 клетки)
    1. Культура J774A.1 Mus Musculus макрофагами , как клетки в суспензии в среде RPMI 1640 с 9% железа с добавкой сыворотки теленка. Первоначально канал в культуре ткани колбы. После того, как клетки становятся конфлюэнтными в 75 см 2 культуре ткани колбу в 15 мл среды, разделить их скребком и разбавлением до 65 мл с тем же типом среды, из которых 15 мл возвращают в колбу с тканевой культурой и 50 мл переносят в 250 мл бактериальной шейкер колбу.
    2. Для расширения масштабов, культуры в суспензии в 250 мл и / или 1000 мл бактериальных колб, заполненных до одной пятой объема с тканевой культуральной среде. Аэрируйте путем установки скорости вращения при приблизительно 120 оборотов в минуту. Для последовательного роста, инкубировать ровно в 5% CO 2 и 37 ° С.
    3. Урожай клетки , когда они достигают плотности в диапазоне 2,5 × 10 6 клеток/ мл до 5 × 10 6 клеток / мл. Убедитесь, что мертвый процент клеток (наиболее легко анализировали с помощью окрашивания трипановым синим) не превышает 25%, а мертвые клетки увеличат фоновый шум в цитотоксичности.
    4. Тарелка в белом цвете, культуре ткани лечение, 384-луночных микропланшетов при 5 × 10 4 клеток J774A.1 в 30 мкл тканевой культуральной среде на лунку. Инкубируйте микропланшеты в течение ночи, чтобы достигнуть 90% сплошности на день эксперимента.
  2. Подготовка люминесцентный или флуоресцентный легионелл
    1. Прохождение L. pneumophila (LP02 :: Flaa :: лк 8) бактерии на соответствующей среде, то есть, буферный древесный уголь дрожжевой экстракт (BCYE) среды. При использовании тимидина ауксотрофного штамма, дополняют среду с 100 мкг / мл тимидина. Подготовить участки бактерий для экспериментов путем распространения организмов толстым слоем на новой BCYE пластине и инкубирования в один прекрасный день (если из предыдущей пластины прохода) или два-три дня (если из замороженной), чтобы получить сливающиесярост.
      1. Готовят BCYE пластины путем растворения 10 г дрожжевого экстракта, 10 г N - (2-ацетамидо) -2-аминоэтансульфоновая кислоты, 0,35 г K 2 HPO 4, и 1 г одноосновного калия α-кетоглутарат в 950 мл деионизированной воды. Доведения рН до 6,9 с помощью гидроксида калия (≥2.5 мл 11,9 М раствора).
      2. Добавьте 15 г агара и 2 г активированного угля; и довести до 1 л конечного объема. Добавление магнитной мешалкой и автоклав. Охлаждающей среды до 55 ° С и добавляют стерилизованным фильтрацией растворов, содержащих 0,4 г L-цистеин и 0,42 г аммоний железа (III) цитрат, растворенный в деионизированной воде. Используйте магнит мешалка для смешивания перед заливкой чашек Петри.
      3. Для тестирования роста pneumophila L. в аксенными среде роста, готовят ACES-дрожжевой экстракт бульон (Айе) путем объединения всех химических реагентов , используемых для BCYE древесный уголь , за исключением и агар. Фильтр стерилизовать и использовать сразу или заморозить для дальнейших экспериментов.
    2. Ресуспендируют организмы в продая среда тканевой культуры использовали для J774A.1 клеток с 100 мкг / мл тимидина добавок в зависимости от обстоятельств.
  3. Макрофаги инфекции
    1. Добавить представляющих интерес тестируемых соединений (скрининга соединений, а также положительный и отрицательный контроль для бактериального ингибирования роста и эукариотических клеток лизис). Предпочтительно, чтобы растворить маточные растворы при ≥500x в ДМСО (диметилсульфоксид), или водный раствор, чтобы обеспечить достаточное разбавление транспортного средства.
      1. Хотя исходные растворы можно хранить в замороженном виде, избежать циклов замораживания-оттаивания для лабильных соединений и противомикробных препаратов.
    2. Развести светящихся бактерий к мишенью 2,5 х 10 6 КОЕ (колониеобразующих единица) / м и флуоресцентные репортерные-меченых бактерий до 1,0 × 10 7 КОЕ / мл в тканевой культуральной среде , и добавить соответствующий нетоксичный, мембранно-impermeant, нуклеиновые кислоты- связывание красителя в 2.5x конечной концентрации для анализа.
    3. Добавьте 20 мкл смеси для каждой J774A.1 культуры хорошо, конечный объем анализа50 мкл, конечная концентрация бактериальной 1 × 10 6 КОЕ / мл (люкс оперон репортер) или 4 х 10 10 6 КОЕ / мл (флуоресцентный репортер белка).
    4. Инкубируют при 37 ° С в течение 1-3 дней в атмосфере 5% СО 2 при 100% относительной влажности , чтобы предотвратить испарительные краевых эффектов.
  4. Анализ счётчика
    1. Read бактериальный рост и токсичности эукариотической клетки на микропланшет-фотометр и флуориметре, применительно к репортерам используется.
      1. Для того, чтобы избежать температурных ассоциированных с краевыми эффектами, термически уравновешивания микропланшетов перед чтением люминесценции путем размещения в один слой на лабораторном столе с крышками приоткрыта в течение приблизительно 20 мин (или в кабинете биологической безопасности с крышками выключенном в течение примерно 10 мин).
    2. Возвращение микропланшетов в инкубатор, если в режиме реального времени считывания в более поздние моменты времени желательно.

Анализ 2. Данные

  1. Нормализация данных в положительной и отрицательной кондля расчета управления установлен процент или Fold-торможение для внутриклеточного роста бактерий и процент цитотоксичности для эукариотических клеток.
  2. Для оценки анализа надежности, расчета статистического разделения между положительным и отрицательным контролем как для бактериального ингибирования роста и цитотоксичности с использованием Z-фактор (Z ') анализа , где Z' = 1 - 3 (σ р + σ п) / | х р + ц п |. В этом уравнении, о р и σ п являются стандартные отклонения для положительных и отрицательных контрольных скважин, соответственно; μ р и ц п представляют собой средние значения для положительных и отрицательных контрольных лунок, соответственно.
    1. Для скрининга с высокой пропускной способностью, вычисления стандартных Z-баллы (или другой альтернативы, количественные статистические показатели) для оценки воздействия испытуемых соединений, представляющих интерес. В качестве альтернативы, рассчитать простую Наклоняемый сокращение или лог-кратное снижение как потенциально физиологически более актуальной мера эффекта величины для геометрически реплицирующимися бактерий.

3. Одно и многомерный (т.е. Synergy) доза-ответ Тестирование и интерпретация данных

  1. Приготовьте макрофаги и бактерии, как описано в разделе 1 протокола.
  2. Непосредственно перед инфекцией или аксенными инкубации, добавить противомикробные препараты экспериментального интереса к сериалу, удвоение серии разбавления, с целью Spanning на высоком конце концентрацию , которая полностью исключает рост (т.е. минимальная подавляющая концентрация или MIC) и низким положить конец концентрации, которая не проявляет никакой очевидной активностью.
  3. Используйте автоматизированную систему обработки жидкости для облегчения однократную дозу-ответ и комбинаторной установку тестирования синергии путем прямого, автоматического добавления антимикробных разведениях в соответствии с протоколом производителя.
  4. Рассмотрим использование суб-удвоенных разведений, например,841 / 54841eq1.jpg "/> - кратной серии разведений, и анализ размножается для повышения точности и воспроизводимости данных.
  5. Для макрофагальной инфекции, разбавить люминесцирующие бактерии мишенью 2,5 × 10 6 КОЕ (колониеобразующих единица) / мл в тканевой культуральной среде. Добавьте 20 мкл смеси для каждой культуры J774A.1, а конечный объем анализа 50 мкл, конечная концентрация 1 бактериальной х 10 6 КОЕ / мл; и инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 при 100% относительной влажности.
    1. Для аксенными испытаний на рост, разбавленные светящихся бактерий до конечной концентрации 1 × 10 6 КОЕ / мл в среде AYE, добавляют по 50 мкл в каждую лунку 384-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 при 100% относительной влажности.
  6. Вычислить дробный индекс концентрации ингибитора для антимикробных комбинаций, которые ингибируют рост бактерий. Для каждого лекарственного средства в комбинации (а, б,.. П), что приводит к полному или> 99% ингибирования бактериального гrowth, рассчитать индивидуальную дробной подавляющей концентрации (FIC а, б, п...) следующим образом : FIC а = концентрация соединения "а" , разделенное на минимальной концентрации ингибитора "а" сам по себе. , Используя ту же формулу, вычислить FIC B, и т.д. Затем вычислить комбинаторный индекс FIC или Уравнение 2 FIC = FIC а + FIC B +. , .FIC П для каждой тормозной комбинации.
    1. Используйте комбинаторный индекс, который отклоняется от 1,0 дальше всего для оценки эффекта синергии. Рассмотрим отсечку ≤0.5 как консервативную указанием синергетического эффекта и ≥4, эффект антагониста. 12
    2. Участок isobolograms, isocontour isobolograms, и / или изоповерхность isobolograms 6 в качестве альтернативных графических представлений комбинаторных эффектов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Микропланшетов внутриклеточный анализ роста

Рисунок 1 Схемы этапы анализа. Автоматизированные шаги, показанные могут быть выполнены вручную. Однако пропускная способность значительно облегчается с использованием жидких систем обработки.

На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты из 384-луночный микропланшет, двойного считывания, в режиме реального времени в процессе внутриклеточного развития и эукариотических анализа цитотоксичности с использованием штамма Legionella (LP02) помеченный либо лк оперона (Фигуры 2А, 2В) или mNeptune2 флуоресцентного белка ( Рисунок 2C, 2D) репортер. Положительные и отрицательные контрольные соединения (ДМСО, антибиотики, сапонины), были добавлены к пластинам путем использования передаточной штырьковый робота для имитации производительности в условиях скрининга с высокой пропускной способностью. Значительное Legionella (2А, 2В) можно легко отличить по сравнению с сапонина лизиса и антибиотиков контрольной группой, обработанной при 24 до 72 ч для светящихся бактерий и от 48 до 72 ч для mNeptune2-меченых бактерий, соответственно. Легионелл обычно лизирует клетки - хозяева , после тиражирования в течение 48 до 72 часов. Это может быть оценено на фигурах 1В и 1D, которые заключаются в увеличении флуоресценции Sytox Грин (репрезентативной, impermeant, связывающего кислоту красителя и маркера смерти клетки - хозяина нуклеиновой) с течением времени. Цитотоксичность в конечном итоге достигает максимального количества наблюдаемого в стиральном (сапонины), лизис клеток хозяина, положительного контроля. mNeptune2 меченные организмы были добавлены в четыре раза выше, чем инокулята люкс оперона-меченых бактерий, вероятно, составляя больше убийства быстрого клетки-хозяина и ранее связанный рост флуоресцентного сигнала в экспериментах mNeptune2. Как и следовало ожидать, эффективная антибактериальная терапия (левофлоксацин или азитромицин) предыдущаятованный как бактериальный лизис клеток роста и хозяина. И наоборот, цитотоксические соединения , которые ограничены внутриклеточный рост путем разрушения клетки - хозяина (например, сапонины) может быть легко идентифицированы с помощью комбинации низкой люминесценции или флуоресценции mNeptune2 и высокую цитотоксичность , связанный сигнал. Кроме того, наблюдение в сочетании снижению и люминесценции и mNeptune2 флуоресценции (бактериальный рост) и цитотоксичности при условии , достаточную уверенность в том, что соединение является истинным ингибитором внутриклеточного роста (например, азитромицин и левофлоксацин положительного контроля) , а не ложный положительный результат в результате ложного вмешательства бактериальная репортер сигнала.

Таблица 1 - 3 показывает репрезентативную Z 'для трех различных бактериальных репортеров (люкс оперон, mNeptune2, tdTomato) и соответствующие показания флуоресценции по сравнению с контрольной группой . А Я '> 0,5 указывает на STATISTICALLY надежный анализ подходит для установок с высокой пропускной способностью; Тем не менее, ниже Z 'могут быть пригодны в зависимости от экспериментальных целей, то есть возможность надежно различать более или менее тонкие эффекты тестируемых соединений или возмущений. На основании результатов из рисунка 2, mNeptune2 не был столь же чувствителен , как репортер бактериальной люциферазы оперона. Поэтому, как и следовало ожидать, надежная разница между сигналом mNeptune2 в отрицательной (ДМСО) и положительный (левофлоксацин, азитромицин, сапонины) роста контроля ингибитора не наблюдалось до дня 2 или 3-й день инкубации, в отличие от ранней, достаточно прочный сигнал люкс оперон репортер бактерий на 1-й день после заражения. В противоположность этому, tdTomato, альтернативный бактериальная люминесцентная репортер, показал, неоптимальный Z 'на протяжении всего инфекционного курса. Субоптимальный флуоресцентные характеристики привели частично посягательству возбуждения флуоресценции и эмиссионной хвоста в используемом диапазоне для оптимального считывания tdTomato signal. Это посягательство может быть оценена из положительного Z ', найденного в tdTomato сапонина против левофлоксацина сравнения (что предполагает существенное различие в бактериальных чисел при двух условиях, при которых бактерии не должны повторить). Этот результат можно объяснить сапонина лизисом вызывает сильный сигнал флуоресценции, чей хвост определяется как излучение tdTomato, и, следовательно, приводит к паразитной разнице между сапонина и управления антибиотику. Таким образом, в то время как бактериальная лк и репортеры mNeptune2 в сочетании с флуоресценции появляются пригодным для двойного считывания, решения на основе, в режиме реального времени, в анализах tdTomato и комбинации флуоресценции, по крайней мере, без дальнейшего математического деконволюции сигнала, не делает.

На рисунке 3 показано ранее опубликованы примеры кривых дозовой известных антимикробных использованием лк оперон, репортёр-меченых организмов. 6 Следует отметить, что Legionella делаетне растут в тканевой культуральной среде. Таким образом, репликация бактерий в макрофагами анализах инфекции исключительно представляет внутриклеточный рост. Тем не менее, Legionella будет расти axenically в специализированном, с низким содержанием натрия, жидкие ТУЗЫ (N - (2-ацетамидо) -2-аминоэтансульфоновая кислота) дрожжевой экстракт среда. Сравнивались 20 Здесь влияние на внутриклеточный и аксенными роста. С помощью этих двух систем роста, мы наблюдали, что полярные противомикробные средства, такие как бета-лактамы (меропенем, цефтриаксон) и аминогликозиды (данные не показаны) являются плохими ингибиторами внутриклеточного роста, в отличие от их сильное влияние на аксенными роста. Предположительно плохой эффективности в макрофагами анализах инфекции основана на невозможности доступа к внутриклеточной Legionella репликативной нишу. В противоположность этому, эукариотической клетки-пенетранта противомикробные средства, такие как хинолоны (левофлоксацина) и азитромицин, продемонстрировали сильное воздействие на внутриклеточной и аксенический бактерий.

50 (концентрация для 50% ингибирования роста бактерий) и могут быть определены КС 50 (концентрация, индуцирующего 50% эукариотической гибель клеток), а также селективности, CC 50 / IC 50, вычисленная. Все три показателя являются важными критериями, прогрессирования соединения в усилиях поиска новых лекарственных препаратов. На рисунке 4 показан пример таких двух сторон , кривых доза-ответ в ответ на антибиотик доксициклин, данные , полученные из тех же самых скрининговых скважин с течением времени. На рисунке 4A, на 1 -й день инфекции, приблизительно в сто раз бактериальной репликации проявляется в нулевых антибиотических испытаний скважин по сравнению с самыми высокими уровнями торможения , наблюдаемых с антибиотиком. Был минимальным Ассоциированные эукариотической клетке токсичности за исключением очень высоких doxycyCline концентрации (≥10 мкг / мл). На 2 -й день (4В), бактериальный сигнал лк был приблизительно в 10 раз больше , чем 1 -й день с существенной бактериальной репликации-ассоциированной цитотоксичности наблюдаемой при низких концентрациях , антимикробные. Как и следовало ожидать, бактериальной репликации-индуцированной гибели клеток хозяина отслеживает в тесном взаимодействии с бактериальными числами (лк) сигнала по всей антимикробной кривой доза-реакция. При более высоких антибактериальных концентрациях цитотоксичность не снижается до исходного уровня, до очень высокой концентрации, где доксициклин снова появляется токсичны, как отмечено в день 1. Видимое смещение люминесценции доза-реакция по отношению к немного более высокой антимикробной концентрации по сравнению с измерениями на цитотоксичность флуоресценции на основе несколько преувеличено при построении люминесценции и цитотоксичность на бревенчатых и линейных весов, соответственно, как показано на рисунке. IC 50 для роста бактерий составляла приблизительно 100 нг / мл в то время как CC 50 составляла приблизительно 10 мкг / мл, СС50 было описано ранее для лечения доксициклином лейкоцитарной линии, HL-60 клеточной линии. 21 Таким образом, общая селективность определяется в этом двойного считывания эксперимента составляла приблизительно 100.

На рисунке 5 показано ранее опубликованных isocontour isobolograms , связанные с двумерными синергетических испытаний , в которых были испытаны попарные комбинации антимикробных препаратов для улучшенного эффекта против внутриклеточных L. pneumophila. 6 Хотя стандартные isobolograms соединяют низкие комбинаторные концентрации антибиотиков , которые полностью ингибируют рост, мы остановили свой выбор на основе имеющихся количественных данных ингибирующих, чтобы соединить точки с аналогичными уровнями торможения с использованием isocontours. Право наиболее isocontour на этих диаграммах соответствует стандартному изоболограмме линии. Вогнутые isobolograms как правило, указывают на синергизм, в то время как выпуклая isobolograms Generallу указывают на безразличие или антагонизм. Примеры синергетических (панелей переменного тока) и безразличия показаны (DF), в этом случае соответствующие значениям индекса торной <0,5 и ≥1 соответственно. 6

Следует отметить, что попарные комбинации азитромицина, миноциклин и рифампицина продемонстрировали синергии. Таким образом, эти агенты были протестированы вместе в трехстороннем комбинации , как показано на рисунке 6 , 6. Здесь поверхность была разработана, чтобы соединить самые низкие комбинаторные концентрации трех антимикробных, которые привели к> 99% ингибирования бактериального внутриклеточного роста. Наблюдаемое вогнутой формы поверхности, само по себе наводит на мысль о трехмерной синергии, соответствует низким индексом FIC (0,325), которые свидетельствуют о существенном синергетического эффекта.


Таблица 1: Z 'для люкс-оперона отчетаэ - э, Legionella infection- сравнение положительных и отрицательных контролей. Z 'соответствуют точкам данных , показанных на фигуре 2А, 2В. Эта таблица была изменена с Chiaraviglio и Kirby 2014. 4 Положительная люминесценция Z '> 0.25 выделены желтыми буквами на черном фоне.


Таблица 2: Z 'для mNeptune2-репортера, Legionella инфекции - сравнение положительных и отрицательных контролей. Z 'соответствуют точкам данных , показанных на рисунке 2C, 2D. Положительная mNeptune2 флуоресценции Z '> 0,25 выделяются красными символами.


Таблица 3: Z 'для tdTomatо-репортер, Legionella инфекции - сравнение положительных и отрицательных контролей. Положительная tdTomato флуоресценции Z '> 0,25 выделяются красными символами. Ложноположительный Z '> 0,25, связанные с перекрытию Sytox Грина и эмиссии tdTomato выделяются зелеными символами.

Рисунок 1
Рисунок 1: графическое представление установки для анализа двойного репортера. (A) Replating из J774A.1 клеток , выращенных в суспензии в 384-луночных планшетах. (В) Добавление соединений , представляющих интерес для микропланшетов. (С) Одновременная инфекция и добавление красителей нуклеиновых кислот-связывающих; Инкубационный; и считывание. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого рис Юр.

фигура 2
Рисунок 2: Двойной, в режиме реального времени отсчет внутриклеточного роста бактерий и эукариотических цитотоксичности в формате с высокой пропускной способностью . Соответствующая люминесценцию (А) и сигналы флуоресцентный (B) во внутриклеточной инфекции J774A.1 клеток с лк оперона экспрессирующих легионелл. Соответствующий флуоресцентный белок (С) и сигналы , флуоресцентные (D) во внутриклеточной инфекции J774A.1 клеток с mNeptune2 экспрессирующих легионелл. Четыре лечения показаны: отрицательный контроль ДМСО ( Уравнение 3 ); Положительный контроль цитотоксичность, сапонины ( Уравнение 5 ); и положительных бактерий контролирует торможение роста, азитромицин (ние 4 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) и левофлоксацин ( Уравнение 5 ). Точки данных представляют собой среднее значение и стандартное отклонение 96 повторах, выполненных в двух экземплярах, 384-луночные планшеты. Обратите внимание, стандартные планки погрешностей отклонения для некоторых точек данных были минимальными, и поэтому скрыты внутри символов точек данных. Панели А и В были изменены из Chiaraviglio и Kirby 2014. 4 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Типичные примеры анализов одномерно, доза-реакция. J774A.1 клетки инфицировали лк оперон-экспрессирующих, L. pneumophila и обрабатывают двукратно серии разведений указанных антибактериальных препаратов (лабелед как "внутриклеточный"). Параллельно лк оперон-экспрессирующих, легионелл разбавляли до той же конечной концентрации в асов дрожжевого экстракта среды (AYE) и обрабатывали идентичным двукратные серии разведений (помечен как "стерильный"). Свечение было прочитано два дня после бактериальной инокуляции и наносили на график в зависимости от концентрации противомикробного. Группа А включает в себя антимикробные препараты широко используются для лечения инфекции Legionella. Панель B сравнивает активность различных макролидных антибиотиков. Группа C включает в себя несколько различных классов антибактериальных препаратов с различной , а иногда контрастных внутриклеточные и аксенический потенции. Точки данных представляют средние значения и стандартные отклонения трех отдельных испытаний скважин на каждое условие. Эта цифра была изменена с Chiaraviglio и Kirby 2015. 6 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличеннуюверсия этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Пример двойного считывания, эксперимента доза-реакция для определения IC 50, CC 50 и селективность. Эффекты доксициклина на внутриклеточный рост и J774A.1 цитотоксичности определяли в дни 1 и 2 после инфицирования. Точки данных представляют средние значения и стандартные отклонения трех отдельных испытаний скважин на каждое условие. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Пример двумерных синергетических анализов. Комбинаторные серийный разбutions пар антимикробных испытывали на синергии против внутриклеточного роста легионелл в J774A.1 макрофагов. Isocontours линии соединяют точки аналогичного процента ингибирования. Крайний правый изоболограмме соединяет комбинации с полным внутриклеточного ингибирования роста (> 99% -ное снижение люминесценции по сравнению с необработанным контролем) и соответствует стандарту изоболограмме сюжета. Затенение указывает процент ингибирования, как это описано с помощью ключа цветовым кодированием в каждом графике. Isocontours слева направо соответствуют 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 и 1% роста по сравнению с необработанными контрольными. Эта цифра была изменена с Chiaraviglio и Kirby 2015. 6 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Пример трехмерного анализа синергизма. Самые низкие комбинаторные концентрации азитромицина, миноциклин и рифампицина, повлекшего> ингибирования роста 99% были связаны с образованием изоболограммы поверхности участка. Эта цифра была изменена с Chiaraviglio и Kirby 2015. 6 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описываем анализы в режиме реального времени для одновременного обнаружения внутриклеточного роста бактерий и клетки-хозяина цитотоксичности. Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, для надежного проведения анализа, должно быть достаточным, спектральное разделение между бактериальными и цитотоксичности считываний. Такое разделение свойственно для комбинаций люциферазы репортеров оперона и флуоресцентные ДНК-связывающих красителей. Однако, основываясь на нашем опыте (Таблица 1-3, Рисунок 2), использование двойного, флуоресцентное считывание требует неперекрывающиеся флуоресцентные сигналы (например, использование дальнего красного флуоресцентного белка репортера и зеленого пятна нуклеиновой кислоты) , чтобы получить надежные, данные решения на основе. Кроме того, из предыдущего опыта, потенциально связанных с доступными считывателей оптики или свойств раствора флуоресценции, только ДНК пятна с зеленым или оранжевым излучением дали полезных данных цитотоксичности, т.е. Z 'больше чем> 0,5, мера , указывающего Stronг производительность анализа. 4 Таким образом, решение на основе двойного считывания анализы несколько ограничены с точки зрения того, что может быть использовано репортеры.

Другим важным шагом является отношение заражать бактерий макрофагами. Бактериальные инфекции вызывает гибель клетки-хозяина. Таким образом, слишком высокая посевного материала может привести к ранней смерти клетки-хозяина, относительно низкие уровни бактериальной репликации и потенциальной запутывания прямых цитотоксических эффектов противомикробных препаратов в рамках исследования. Соответствующее заражать соотношение может быть определено эмпирически и может зависеть от вирулентности конкретного штамма бактериального исследуемого. Низкое соотношение примерно 1: 1 является хорошей отправной точкой. Эксперименты , такие как те , которые показаны на рисунке 2 и в таблицах 1 - 3 выполнены с несколькими коэффициентами инфекции позволит оценку и оптимизацию условий для использования в будущих анализов. Следует отметить, что для Legionella , в частности, использование штамма фон с физраторов нижняя клетка - хозяин цитотоксичность (а флагеллином мутант) 8 внесли значительный вклад в высокой анализа надежности полученного. Кроме того, перевод техники двойного считывания с другими внутриклеточными, системы патоген-хозяин могут также потребоваться дополнительные корректировки протокола инфекции. Legionella не растет в среде тканевой культуры, что позволяет отнести увеличение сигнала репортера к внутриклеточной роста в одиночку. Тем не менее, многие внутриклеточные патогены (например, Brucella) может расти в той или иной степени как внутриклеточно и в тканевой культуральной среде. Таким образом, дополнительные операции, такие как лечение гентамицином и промывки клеток-хозяев после заражения могут быть необходимы для снижения внеклеточного репликации и позволяют селективную изучении внутриклеточных способности репликации. 22

Анализ масштаба для использования в высокопроизводительного скрининга и тестирования синергии связан со своим собственным набором проблем. Наиболее частностиLY, мы обнаружили , что большое количество клеток , необходимых J774A.1 лучше всего можно культивировать в бактериальных , а не традиционных флаконах для культуры ткани (рисунок 1). Тем не менее, для поддержания культуры стерильность, губка пены или другие фильтрующие заглушки для этих колб было обнаружено предпочтительнее стандартных бактериальных колбах колпачками. Размещение небольшой орбитальной платформе шейкера внутри стандартной тканевой культуры инкубатор позволило нам выполнить масштабный план культуры с оборудованием под рукой. И, наконец, использование автоматизированных систем дозирования (1А, Б) значительно облегчило установку для анализа и тестирования комбинаторной серии разведений.

Следует отметить, что адекватное обнаружение бактериальной репликации зависит от способности достаточно выразить либо лк оперон или флуоресцентного белка в бактериальных штаммах интереса. С этой целью мы создали набор флуоресцентных и люкс оперона репортер транспозонов с приводом от сильного конститутивного промотора, который должен позволить фаCile маркировки различных видов бактерий (Kang и Kirby, данные не показаны). В качестве альтернативы, для болезнетворных микроорганизмов, внутриклеточный репликации доказывает цитотоксические для клетки-хозяина, измерения цитотоксичности в режиме реального времени сами по себе могут быть использованы в качестве суррогата внутриклеточной репликации. Тем не менее, в этом случае, цитотоксические и неактивные соединения не может быть надежно отличить в одном анализе.

Наличие в режиме реального времени считывания из обеспечивает особое преимущество для скрининга с высокой пропускной способностью. В частности, отказ от оценки конечной точки роста бактерий (колониеобразующих определения единицы) 7 и цитотоксичности (добавление реагента жизнеспособности клеток при окончании анализа) 23,24 устраняет несколько экспериментальных шагов и связанных с ними труда. Более того, время курсов легко могут следовать в том же самом анализе скважин с минимальным увеличением экспериментальных усилий. Важно отметить, что наличие двух различных типов бактериальных репортеров репликации (бактериил лк оперон и флуоресцентный белок) имеет особое значение для развития скрининга для анализа с высокой пропускной способностью. В частности, ложный положительный противомикробное отсчет в результате паразитных помех с лк оперона или флуоресцентной выход репортер может быть решена за счет использования обоих репортеров последовательно в дополнительных ортогональных анализов в первичном и вторичном скрининге, соответственно 25. Следует отметить, что мы обнаружили, что бактериальная лк оперон был более чувствительным репортер бактериального роста с примерно в 20 раз до 100 раз ниже предела обнаружения, чем наши флуоресцентных репортеров белка. Тем не менее, выход люкс, скорее всего, при условии более ложных срабатываний на основе нескольких генных продуктов и шагов, необходимых для выхода света. 26 Более конкретно, в отличие от эукариотических одиночных репортерами гена люциферазы, бактериальный лк оперон представляет собой пяти-кластер генов, кодирующий как двухкомпонентного фермента люциферазы и гены для эндогенного синтеза субстрата люциферазы. Было быПоэтому имеет смысл использовать репортеру оператора лк в первичном экране, чтобы обеспечить достаточную чувствительность, и флуоресцентного белка репортеров во вторичных анализах для обеспечения специфичности.

Взятые вместе, описанная методология обеспечивает в режиме реального времени, неразрушающие альтернативы конечная точка анализы для измерения бактериальной репликации и эукариотических цитотоксичность и, следовательно, представляет собой методологическую простой и универсальный метод оценки противомикробное действие на внутриклеточных патогенов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Исследования сообщили в этой рукописи была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национального института здоровья под номером награду R01AI099122 к JEK Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института Здоровье. Мы хотели бы поблагодарить Дженнифер Смит, Дэвид Wrobel, Су Чан, Даг Flood, Шон Джонстон, Дженнифер Nale, Стюарт Рудницкий, Пол Ян, Ричард С.Ю., и Рэйчел Стража из Screening фонда ICCB-Longwood и / или национальной лаборатории скрининга для Новой Англии региональных центров передового опыта в Biodefense и вновь возникающих инфекционных болезней (при поддержке U54AI057159) за их помощь в разработке и выполнении скрининговых исследований с высокой пропускной способностью. Мы также хотели бы поблагодарить Кеннет П. Смита за полезные замечания по рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
J774A.1 cells American Type Culture Collection TIB-67 Host cell
ACES Sigma-Aldrich A9758  For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered Becton-Dickinson/Difco 210929 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt Sigma-Aldrich K2000 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic Thermo Fisher Scientific P288-500 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine Sigma-Aldrich C-7755 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate Sigma-Aldrich F5879 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated Thermo Fisher Scientific SP236-500 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water N/A N/A For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade) Sigma-Aldrich T1895 For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation Corning via Thermo Fisher Scientific 10-040-CV For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red Corning via Thermo Fisher Scientific 17-105-CV For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) HyClone via Thermo Fisher Scientific SH30034.02 For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum Gemini Bioproducts 100-510 For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154 For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO Thermo Fisher Scientific S7020 For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific 13-255-26 For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker BellCo Glass 7744-01010 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-2038-04 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml) BellCo Glass 7744-16250 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-2038-07 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml) BellCo Glass 7744-16100 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-1490-038 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump Thermo Fisher Scientific 5840300 For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold Thermo Fisher Scientific 24072670 Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture Corning 3570 For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) Sigma-Aldrich D2650 For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin Sigma-Aldrich PHR1088 Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark) Sigma-Aldrich S-4521 Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor Thermo Fisher Scientific Finnpipette For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot Epson/ICCB-L (Custom equipment) For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system Hewlett-Packard via Tecan D300 For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system Hewlett-Packard via Tecan T8+ For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera Nikon Ti For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6 Adobe Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10 Wolfam For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
  2. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
  3. Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
  4. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
  5. Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
  6. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
  7. Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones? Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
  8. Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
  9. Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
  10. Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).
  11. Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
  12. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  15. Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
  17. Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
  18. Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
  19. Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
  20. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
  21. Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457 (2014).
  22. Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
  23. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
  24. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
  25. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
  26. Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).

Tags

Инфекция выпуск 117 синергия высокой пропускной способностью скрининг в режиме реального времени, Внутриклеточный рост антимикробным антибиотик минимальная подавляющая концентрация доза-реакция цитотоксичность изоболограмме
Высокая пропускная способность, в режиме реального времени, двойного считывания Тестирование внутриклеточного антимикробной активности и эукариотической клетки цитотоксичность
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiaraviglio, L., Kang, Y. S.,… More

Chiaraviglio, L., Kang, Y. S., Kirby, J. E. High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (117), e54841, doi:10.3791/54841 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter