Abstract
Traditionele maatregelen van intracellulair antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit afhankelijk eindpunt assays. Dergelijke eindpunt assays vereisen een aantal extra experimentele stappen voorafgaand aan het uitlezen, zoals cellysis, kiemgetal bepaling of reagens toevoeging. Bij het uitvoeren van duizenden testen, bijvoorbeeld tijdens high-throughput screening, de stroomafwaartse inspanning vereist voor deze soorten tests is aanzienlijk. Daarom bij hoge doorvoer antimicrobiële ontdekking vergemakkelijken, hebben we een real-time test gelijktijdig remmers van intracellulaire bacteriële groei bepalen en beoordelen eukaryote cel cytotoxiciteit. Specifiek werd realtime intracellulaire groei van bacteriën detectie mogelijk gemaakt door het markeren bacteriële screening stammen met ofwel een bacteriële lux operon (1e generatie-test) of fluorescerend eiwit reporters (2 e generatie, orthogonale test). Een niet-toxisch, celmembraan-impermeante, nucleïnezuurbindende dyewerd toegevoegd tijdens aanvankelijke infectie van macrofagen. Deze kleurstoffen zijn uitgesloten van levensvatbare cellen. Echter, niet-levensvatbare gastheercellen verliezen membraan integriteit waardoor binnenkomst en tl-etikettering van nucleair DNA (desoxyribonucleïnezuur). Met name DNA binding is geassocieerd met een grote toename van fluorescentie kwantumopbrengst dat een oplossing op basis uitlezen van ontvangst celdood verschaft. We hebben deze gecombineerde test gebruikt om een high-throughput screen in microplate format uitvoeren en intracellulaire groei en cytotoxiciteit beoordeeld met behulp van microscopie. Met name kan antimicrobiële synergie waarin het gecombineerde effect van twee of meer antimicrobiële stoffen wanneer zij samen toegepast groter dan wanneer afzonderlijk toegepast demonstreren. Testen op in vitro synergie tegen intracellulaire pathogenen gewoonlijk een wonderbaarlijke taak combinatoriële permutaties van antibiotica bij verschillende concentraties worden beoordeeld. Toch vonden we dat onze real-time analyse in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie permitted facile synergie testen. Met behulp van deze benaderingen konden we systematisch overzicht werking van een groot aantal antimicrobiële alleen en in combinatie met het intracellulaire pathogeen, Legionella pneumophila.
Introduction
Ziekteverwekkers die in intracellulaire compartimenten groeien of verblijven tijdelijk moeilijk te therapeutisch roeien. Verplichten of relatief obligaat intracellulaire pathogenen zoals Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis en Mycobacterium spp. vereisen vaak langdurige cursussen van de antimicrobiële therapie voor de genezing die kunnen variëren van maanden tot zelfs jaren. Bovendien kan extracellulaire ziekteverwekkers tijdelijk bezet intracellulaire niches en zo ontsnappen goedkeuring door normale levels van antimicrobiële therapie en later ontstaan nieuwe serie virulente infectie te veroorzaken. Staphylococcus aureus 1 en uropathogene Enterobacteriaceae 2,3 infecties zijn twee steeds meer erkend voorbeelden. Daarom is een fundamentele ontdekking van geneesmiddelen doel is om nieuwe antibiotica die doordringen in intracellulaire compartimenten identificeren. Optimale therapie om snel uit te roeienintracellulaire organismen en de ontwikkeling van resistentie door middel van sub-remmende antimicrobiële blootstelling te voorkomen is in het bijzonder wenselijk.
Hiervoor hebben we een high-throughput screening technologie intracellulaire penetrant antimicrobiële targeting naar de intracellulaire groei van het model pathogeen, Legionella pneumophila identificeren. 4 Vorige klinische observaties wijzen erop dat standaard antimicrobiële gevoeligheid testen niet nauwkeurig te voorspellen in vivo therapeutische werkzaamheid tegen dit organisme. 5 In het bijzonder, was dit omdat grote klassen van antimicrobiële middelen, zoals β-lactamen en aminoglycosiden, hoewel zeer effectief tegen axenisch gegroeid Legionella, onvoldoende doordringen in de intracellulaire compartimenten waarin Legionella woont. 5,6 Later bewijs suggereerde dat technisch complexer intracellulaire groei assays effectief voorspeld klinische werkzaamheid. 7
Daarom ontwikkelden we technologie voor real-time bepaling van intracellulaire groei van bacteriën. 6 Dit werd bereikt door het gebruik van een bacteriële stam gemodificeerd door integratie van zowel een bacteriële luciferase operon 8 (eerste generatie assay hierboven beschreven) 4 of fluorescerend eiwit 9 reporters (tweede generatie orthogonale test hier beschreven) in het bacteriële chromosoom. Zo luminescerende of fluorescerend signaal verschaft een surrogaat, real-time uitlezen van aantal bacteriën.
Echter, deze attributen niet te pakken een belangrijke verstorende factor in de intracellulaire infection assays, off-target effecten op gastheercellen. In het bijzonder, de dood van de gastheercel beperkt inherent intracellulaire groei en leidt tot vals positieve identificatie van antimicrobieel effect. Zoals veel verbindingen in screening bibliotheken eukaryote cel giftig, zoals valse positieven zou gelden antimicrobiële overweldigen, noodzakelijk een groot aantal van de follow-up, endpoint cytotoxiciteit assays voor een oplossing.
Het was dus van groot belang om te kunnen eukaryote levensvatbaarheid van de cellen en intracellulaire groei tegelijkertijd beoordelen. Met name, een kenmerk van niet-levensvatbare eukaryote cellen is het verlies van celmembraanintegriteit. Probes die de permeabiliteit van de celmembraan testen kunnen daarom gebruikt worden om cellevensvatbaarheid te bepalen. We eerder gekarakteriseerde het vermogen van een reeks vermoedelijk celmembraan-impermeante, fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen om vlekken en nucleaire DNA van dode cellen. 4 op binding nucleair DNA, deze kleurstoffen vertonen een grote toename van Quantum fluorescerende opbrengst resulteert in een verhoogde signaal over achtergrond oplossing fluorescentie. Als zodanig zijn deze kleurstoffen heeft het een kwantitatieve uitlezing van eukaryote celdood. 4 name, vonden we dat verschillende waren niet giftig zich tijdens langdurige co-incubatie met J774 macrofagen. Wanneer toegevoegd tijdens de eerste infectie, mits hij realtime de fluorescentie van eukaryote celdood kan worden gemeten met een microplaat fluorimeter of geobserveerd microscopisch.
Daarom combineert het gebruik van een bacteriële reporter en niet-toxisch, membraan-impermeante, DNA-bindende kleurstoffen, konden we een eenvoudige, niet-destructieve, real-time bepaling van zowel bacteriologische belasting en eukaryote cel cytotoxiciteit tegelijk meten. Deze test heeft ons toegelaten om het scherm in 384-well plaat formaat ~ 10.000 bekende bioactieve stoffen, waaronder ~ 250 antimicrobiële stoffen en> 240.000 kleine moleculen met functioneel uncharacterized activiteit voor de mogelijkheid om intracellulaire groei van de remmenLegionella pneumophila, terwijl tegelijkertijd het genereren eukaryote cel cytotoxiciteit voor elke verbinding. 6 Onze analyse van bekende antimicrobiële middelen tegen intracellulaire groei van Legionella was de meest uitgebreide verkenning van dit type tot nu toe. 6
Op basis van de efficiëntie van onze testformaat we vervolgens onderzocht de mogelijke synergistische effecten van bekende antimicrobiële stoffen bij gebruik in combinatie. Een van de meest voorkomende synergie proeven, de zogenaamde dambord assay wordt uitgevoerd door het bepalen standaard combinatorische effecten van tweevoudige seriële verdunningen van twee of meer antimicrobiële middelen. 10 In deze testen wordt synergie bepaald door de waarneming van groter effect wanneer twee of meer antimicrobiële middelen samen dan de som van de effecten van elk gemonteerde toegepast. Van de nota, tot nu toe, alleen gericht en selectieve synergie testen werden uitgevoerd tegen intracellulaire Legionella pneumophila
Synergie kunnen testen, maakten we gebruik van onze real-time intracellulaire groei / eukaryotische cytotoxiciteit assay in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie 6. Deze automatisering mogen wij seriële verdunningen van verbindingen opgelost in DMSO of waterige oplossing alleen of in combinatie in 384 putjes afgeven. 11 Bovendien, zo krachtige vloeistofverwerking technologie mogen wij eenvoudig uitvoeren hogere resolutie, vierkantswortel van twee (in plaats van de standaard, resolutieverschillen verdubbeling) verdunning combinaties met hogere specificiteit in onze tweedimensionale bereiken, schaakbord synergie analyse. Deze resolutie is bijzonder waardevol bij het aanpakken van problemen op het gebied van synergie over de reproduceerbaarheid bij het gebruik van tweevoudige verdunningsreeks 12. Tenslotte onze test was kwantitatief en ook therefore gemeten gradaties van remming. Als resultaat was de zuiverheid gevangen het geheel van remmende informatie expressie in isocontour isobolograms waarin isolijnen verbinding combinatorische concentraties met een vergelijkbaar niveau van groeiremming. 6 Deze plotten strategie liet visualisatie van combinatorische dosis-respons curves. Om onze methodologie te illustreren, beschrijven we ons protocol voor het uitvoeren van deze testen en tonen representatieve resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Real Time Intracellulaire groei en eukaryote cel cytotoxiciteit Assay
- Het voorbereiden van gastheercellen (J774A.1 Cells)
- Cultuur J774A.1 Mus musculus macrofaag-achtige cellen in suspensie in RPMI 1640 met 9% ijzer aangevuld kalfsserum. Aanvankelijk passage in weefselkweek kolven. Na cellen confluent in een 75 cm2 weefselkweek kolf in 15 ml medium geworden, gesplitst door schrapen en verdunnen tot 65 ml met hetzelfde type medium, waarvan 15 ml wordt teruggevoerd naar de weefselkweek kolf en 50 ml overgebracht een 250 ml schudkolf bacteriën.
- Voor opschaling cultuur in suspensie in 250 ml en / of 1000 ml bacteriële kolven gevuld tot een vijfde volume met weefselkweekmedium. Beluchten door rotatiesnelheid ongeveer 120 omwentelingen per minuut. Voor een consistente groei incuberen bij precies 5% CO2 en 37 ° C.
- Oogst cellen wanneer ze de dichtheid te bereiken in het bereik van 2,5 x 10 6 cellen/ ml tot 5 x 10 6 cellen / ml. Zorg ervoor dat dode cel percentage (het gemakkelijkst bepaald door trypan blauwe vlekken) niet meer dan 25%, zoals dode cellen achtergrondgeluid in cytotoxiciteit assays zal toenemen.
- Plaat in het wit, weefselkweek behandeld, 384-putjes 5 x 10 4 J774A.1 cellen in 30 ul weefselkweek medium per well. Incubeer overnacht microplaten tot 90% confluentie op de dag van het experiment bereiken.
- Het voorbereiden van Lichtgevende of Fluorescent Legionella pneumophila
- Passage L. pneumophila (LP02 :: Flaa :: lux 8) bacteriën op geschikt medium, dat wil zeggen, gebufferd houtskool gistextract (BCYE) medium. Bij gebruik van een thymidine auxotrofe stam medium aangevuld met 100 ug / ml thymidine. Bereid stukjes bacteriën experimenten door het verspreiden organismen dik op een nieuwe BCYE plaat en incuberen van één dag (of een eerdere passage plaat) of 2:58 (waar van ingevroren voorraad) te verkrijgen confluentegroei.
- Bereid BCYE platen door het oplossen van 10 g gistextract, 10 g N - (2-aceetamido) -2-aminoethaansulfonzuur, 0,35 g K 2 HPO 4 en 1 g monobasisch kaliumfosfaat α-ketoglutaraat in 950 ml gedeïoniseerd water. Op pH 6,9 met kaliumhydroxide (11,9 ml ≥2.5 molaire oplossing).
- Voeg 15 g agar en 2 g geactiveerde kool; en breng aan 1 L eindvolume. Voeg een magnetische roerstaaf en autoclaaf. Koel medium tot 55 ° C en voeg filtergesteriliseerd oplossingen die 0,4 gram L-cysteïne en 0,42 g ammonium ijzer (III) citraat, opgelost in gedeïoniseerd water. Gebruik magneet roer plaat te mengen voorafgaand aan het gieten van Petri platen.
- Voor het testen van L. pneumophila groei in axenic groeimedium, bereiden ACES-gistextract bouillon (AYE) door het combineren van alle chemische reagentia gebruikt voor BCYE niet voor houtskool agar. Filter steriliseren en onmiddellijk te gebruiken, of de vriezer bewaren voor latere experimenten.
- Resuspendeer organismen in de same kweekmedium weefsel voor J774A.1 cellen met 100 ug / ml thymidine suppletie waar nodig.
- Passage L. pneumophila (LP02 :: Flaa :: lux 8) bacteriën op geschikt medium, dat wil zeggen, gebufferd houtskool gistextract (BCYE) medium. Bij gebruik van een thymidine auxotrofe stam medium aangevuld met 100 ug / ml thymidine. Bereid stukjes bacteriën experimenten door het verspreiden organismen dik op een nieuwe BCYE plaat en incuberen van één dag (of een eerdere passage plaat) of 2:58 (waar van ingevroren voorraad) te verkrijgen confluentegroei.
- macrofaag Infectie
- Voeg testverbindingen plaats (screenen van verbindingen en positieve en negatieve controles voor bacteriële groeiremming en eukaryote cel lysis). Bij voorkeur lossen voorraadoplossingen in ≥500x in DMSO (dimethylsulfoxide) of een waterige oplossing voldoende verdunning van voertuig mogelijk.
- Hoewel de voorraad oplossingen bevroren kunnen worden opgeslagen, vermijd vries-dooi cycli voor labiele verbindingen en antimicrobiële middelen.
- Verdun lichtgevende bacteriën targeten van 2,5 x 10 6 CFU (kolonievormende eenheid) / m en fluorescerende reporter-gemerkte bacteriën 1,0 x 10 7 CFU / ml in weefselkweekmedium en voeg geschikte niet-toxische, membraan-impermeante, nucleïnezuur- bindende kleurstof bij 2,5x eindassayconcentratie.
- Voeg 20 ul van het mengsel aan elk J774A.1 cultuur goed, de definitieve test volume50 pl, bacteriële uiteindelijke concentratie 1 x 10 6 CFU / ml (lux operon reporter) of 4 x 10 6 10 CFU / ml (reporter fluorescent eiwit).
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-3 dagen in 5% CO2 bij 100% relatieve vochtigheid verdamping randeffecten te voorkomen.
- Voeg testverbindingen plaats (screenen van verbindingen en positieve en negatieve controles voor bacteriële groeiremming en eukaryote cel lysis). Bij voorkeur lossen voorraadoplossingen in ≥500x in DMSO (dimethylsulfoxide) of een waterige oplossing voldoende verdunning van voertuig mogelijk.
- assay uitlezing
- Lees bacteriegroei en eukaryote cel toxiciteit op een microplaat luminometer en fluorimeter afhankelijk van reporters gebruikt.
- To-temperatuur geassocieerde randeffecten te vermijden, thermisch evenwicht microplaten vóór luminescentie lezing plaatsing in een enkele laag op een laboratoriumtafel met deksels kier ongeveer 20 minuten (of in een biologische veiligheidskast met deksels ongeveer 10 min).
- Terug microplaten om incubator als real-time uitlezing op latere tijdstippen gewenst is.
- Lees bacteriegroei en eukaryote cel toxiciteit op een microplaat luminometer en fluorimeter afhankelijk van reporters gebruikt.
2. Data Analysis
- Normaliseren van gegevens naar positieve en negatieve conbedieningstoetsen aan procent of fold-remming te berekenen voor intracellulaire groei van bacteriën en het percentage cytotoxiciteit voor eukaryote cellen.
- Om assay robuustheid beoordelen, berekenen statistische scheiding tussen positieve en negatieve controles voor zowel bacteriegroei inhibitie en cytotoxiciteit via Z-factor (Z) meten waarbij Z '= 1-3 (σ p + σ n) / | p p + p n |. In deze vergelijking, σ σ p en n de standaardafwijkingen van de positieve en negatieve controleputjes toegevoegd, respectievelijk; μ p p en n zijn de gemiddelde waarden voor de positieve en negatieve controleputjes toegevoegd, respectievelijk.
- Voor high-throughput screening assays, berekent standaard z-scores (of andere alternatieve kwantitatieve statistische maten) effecten van testverbindingen plaats bepalen. Als alternatief, berekenen een eenvoudige fold-reductie of log-voudige verlaging als een potentieel fysiologisch relevanter maatregel effect magnitude voor geometrisch repliceren bacteriën.
3. Single en multi-dimensionale (dat wil zeggen, Synergy) Dosis-respons testen en interpretatie van gegevens
- Bereid macrofagen en bacteriën zoals beschreven in protocol paragraaf 1.
- Juist voorafgaand aan infectie of axenic incubatie antimicrobiële experimentele toevoegen belang in een seriële, verdubbeling verdunning serie, met het doel spanning aan de hoge kant een concentratie die groei volledig elimineert (dwz de minimale remmende concentratie of MIC) en de lage uiteindelijk een concentratie die geen duidelijke activiteit toont.
- Gebruik een geautomatiseerd vloeistofverwerkingsysteem enkelvoudige dosis-respons en combinatorische synergie meetopstelling via directe, geautomatiseerde toevoeging van antimicrobiële verdunningen volgens het protocol van de fabrikant vergemakkelijken.
- Overweeg gebruik van verder tweevoudige verdunningen, bijvoorbeeld,841 / 54841eq1.jpg "/> - voudige verdunning series en assay repliceert om de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de gegevens te verhogen.
- Voor macrofaag infectie, verdunnen lichtgevende bacteriën te richten van 2,5 x 10 6 CFU (kiemgetal) / ml in weefselkweek medium. Voeg 20 ul van het mengsel aan elk J774A.1 cultuur goed, de uiteindelijke assay volume 50 pl, uiteindelijke bacteriële concentratie 1 x 10 6 CFU / ml; en incuberen bij 37 ° C in 5% CO 2 bij 100% relatieve vochtigheid.
- Voor axenic groei testen verdund lichtgevende bacteriën tot een eindconcentratie van 1 x 10 6 CFU / ml in AYE medium, voeg 50 ul aan elk putje van een 384-wells plaat en incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2 bij 100% relatieve vochtigheid.
- Bereken fractionele remmerconcentratie index antimicrobiële combinaties die bacteriegroei te remmen. Voor elk geneesmiddel in de combinatie (a, b,.. N) die leidt tot volledige of> 99% remming van bacteriële gGROEI Bereken de afzonderlijke fractionele remmende concentratie (FIC a, b, n...) als volgt: FIC a = de concentratie van de verbinding "a" gedeeld door de minimale concentratie van inhibitor "een" als zodanig. . Met behulp van dezelfde formule, bereken FIC b, enz. Bereken vervolgens de combinatorische FIC-index of
FIC = FIC a + b + FIC. . .FIC N voor elke remmende combinatie. - Gebruik de combinatorische index die het verst afwijkt van 1,0 tot synergie te beoordelen. Overweeg een cutoff van ≤0.5 als een conservatieve indicatie van een synergetisch effect en ≥4, een antagonist effect. 12
- Plot isobolograms, isocontour isobolograms, en / of isosurface isobolograms 6 als alternatieve grafische voorstellingen van combinatorische effecten.
FIC = FIC a + b + FIC. . .FIC N voor elke remmende combinatie. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microplate intracellulaire groei assay
Figuur 1 schema de test stappen. De geautomatiseerde getoonde stappen kunnen handmatig worden uitgevoerd. Echter doorzet aanzienlijk vergemakkelijkt middels vloeistofverwerking systemen.
Figuur 2 toont representatieve resultaten van een 384-well microplaat, dual-uitlezing, real-time intracellulaire groei en eukaryote cel cytotoxiciteit assay met een Legionella stam (LP02) met ofwel een lux operon (figuren 2A, 2B) of mNeptune2 fluorescerend eiwit gemerkt ( figuur 2C, 2D) reporter. Positieve en negatieve controle verbindingen (DMSO, antibiotica, saponine) werden toegevoegd aan platen met gebruik van een pen overdrachtsrobot prestaties simuleren een high-throughput screening opstelling. significant Legionella (Figuren 2A, 2C) gemakkelijk onderscheiden ten opzichte saponine lysis en antibioticum behandelde controles na 24 tot 72 uur voor lichtgevende bacteriën en 48 tot 72 uur voor mNeptune2-gelabelde bacteriën, respectievelijk. Legionella lyseert typisch gastheercellen na repliceren gedurende 48 tot 72 uur. Dit kan duidelijk in Figuren 1B en 1D, die tonen verhoogde fluorescentie van SYTOX Green (een vertegenwoordiger impermeant, nucleïnezuur-bindende kleurstof en teller host celdood) in de tijd. Cytotoxiciteit bereikt uiteindelijk de maximale hoeveelheid waargenomen in de detergens (saponine), gastheer cel lysis, positieve controle. mNeptune2 gemerkte organismen werden bij vier maal hoger dan inoculum lux-operon gemerkte bacteriën, waarschijnlijk goed voor snellere gastheercel doden en minder daarmee gepaard gaande stijging in fluorescentie signaal mNeptune2 experimenten. Zoals verwacht, effectieve antimicrobiële behandeling (levofloxacine of azithromycin) prevteerde zowel de groei van bacteriën en gastheer cellysis. Omgekeerd, cytotoxische verbindingen die intracellulaire groei beperkt tot vernietiging van de gastheercel (bijvoorbeeld saponine) kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door een combinatie van lage luminescentie of mNeptune2 fluorescentie en hoge cytotoxiciteit geassocieerde signaalpeptide. Verder observatie Gecombineerd afname van zowel luminescentie en mNeptune2 fluorescentie (bacteriegroei) en cytotoxiciteit indien er voldoende vertrouwen dat een verbinding een echte intracellulaire groei remmer (bijvoorbeeld azithromycine en levofloxacine positieve controles) boven een vals positieve gevolg van valse verstoring bacteriële reporter signaal.
Tabel 1-3 toont representatieve Z 'voor drie verschillende bacteriële reporters (lux operon, mNeptune2, tdTomato) en bijbehorende fluorescentie metingen bij de controlegroepen. A Z '> 0,5 geeft een Statistically robuuste test die geschikt is voor high-throughput-instellingen; evenwel lagere Z 'geschikt zijn, afhankelijk van experimentele doelen, namelijk het vermogen om betrouwbaar onderscheid min of meer subtiele effecten van testverbindingen of verstoringen. Gebaseerd op resultaten van figuur 2, mNeptune2 was niet zo gevoelig reporter als bacteriële luciferase operon. Derhalve, zoals verwacht, een robuuste verschil tussen mNeptune2 signaal negatief (DMSO) en positieve (levofloxacine, azithromycine, saponine) groeiremmer controles werd niet waargenomen tot dag 2 en dag 3 van de incubatie, in tegenstelling tot begin, redelijk sterk signaal van lux operon reporter bacteriën op dag 1 na infectie. Daarentegen tdTomato een alternatieve bacteriële fluorescerende reporter toonde suboptimale Z 'gehele besmettelijke cursus. Suboptimale fluorescerende eigenschappen resulteerde in een deel van aantasting van de fluorescentie excitatie en staart emissie naar het bereik wordt gebruikt voor een optimale uitlezing van tdTomato signal. Deze aantasting kan worden begrepen uit de positieve Z 'in de tdTomato saponine versus levofloxacine vergelijking (wat een aanzienlijk verschil in bacteriële aantallen onder twee omstandigheden waarbij bacteriën niet mag repliceren). Dit resultaat kan worden verklaard door saponine lysis veroorzaakt een sterke fluorescentie signaal, waarvan de staart wordt gedetecteerd als tdTomato emissie en derhalve leidt tot een valse verschil tussen saponine en antibiotische controle. Daarom, terwijl de bacteriële lux en mNeptune2 reporters in combinatie met fluorescentie lijkt bruikbaar voor dual-uitlezing, oplossing-gebaseerde real-time assays, de tdTomato en fluorescentie samen ten minste ongewijzigde signaal wiskundige deconvolutie, niet.
Figuur 3 toont eerder gepubliceerde voorbeelden van dosis-respons curven van bekende antibiotica gebruik lux operon-reporter gemerkte organismen. 6 Met name doet Legionellaniet groeien in weefselkweekmedium. Daarom replicatie van bacteriën in macrofaag infectie assays alleen vertegenwoordigt intracellulaire groei. Echter, Legionella axenisch groeien in een gespecialiseerde, laag natriumgehalte, vloeibare ACES (N - (2-aceetamido) -2-aminoethaansulfonzuur) gistextract medium. 20 Hier effecten op intracellulaire en axenische groei vergeleken. Met deze twee groeisystemen namen wij waar dat polaire antimicrobiële middelen zoals β-lactamen (meropenem, ceftriaxone) en aminoglycosiden (gegevens niet getoond) slecht remmers van intracellulaire groei, in tegenstelling tot hun potente effecten op axenische groei. Vermoedelijk slechte werkzaamheid bij macrofaag infectie assays zijn gebaseerd op het onvermogen om de intracellulaire Legionella replicatieve niche. Daarentegen eukaryotische cel-penetrant antimicrobiële middelen zoals chinolonen (levofloxacine) en azithromycine toonden krachtige effecten op zowel intracellulair axenische bacteriën.
IC50 (concentratie 50% bacteriële groeiremming) en CC50 (concentratie die 50% eukaryote celdood induceert) worden bepaald en selectiviteit, CC50 / IC50 berekend. Alle drie de maatregelen zijn belangrijke criteria voor samengestelde progressie in drug discovery inspanningen. Figuur 4 toont een voorbeeld van een dergelijke dubbele dosis-response curves in reactie op het antibioticum doxycycline, verkregen uit dezelfde screening putjes tijd. In figuur 4A, op dag 1 van de infectie, ongeveer honderdvoudig bacteriële replicatie blijkt in de nul antibioticum testputjes vergeleken met de hoogste niveaus van remming waargenomen met antibiotica. Er was minimaal bijbehorende eukaryote cel toxiciteit, behalve bij zeer hoge doxycycline concentraties (≥10 ug / ml). Op dag 2 (Figuur 4B), bacteriële lux signaal ongeveer 10 maal hoger dan 1 dag met aanzienlijke bacteriële replicatie-geassocieerde cytotoxiciteit waargenomen bij lage concentraties antimicrobieel. Zoals verwacht, sporen bacteriële replicatie-geïnduceerde celdood nauw samen met bacteriële aantallen (lux signaal) gedurende de antimicrobiële dosis-responscurve. Bij hogere concentraties antimicrobieel cytotoxiciteit wordt verlaagd tot basislijn tot zeer hoge concentraties, waarbij doxycycline opnieuw verschijnt toxisch waargenomen op dag 1. De schijnbare verplaatsing van de luminescentie dosis-respons richting iets hogere antimicrobiële concentraties vergeleken met fluorescentie gebaseerde cytotoxiciteit metingen enigszins overdreven bij het plotten luminescentie en cytotoxiciteit op log en lineaire schalen, respectievelijk, zoals weergegeven. IC 50 voor bacteriële groei was ongeveer 100 ng / ml terwijl CC 50 ongeveer 10 pg / ml, CC50 eerder beschreven voor doxycycline behandeling van leukocyt lijn, HL-60 cellijn. 21 Daarom totale selectiviteit bepaald tweevoudig uitlezing experiment ongeveer 100.
Figuur 5 toont eerder gepubliceerd isocontour isobolograms geassocieerd met tweedimensionale synergie testen waarbij paarsgewijze combinaties van antimicrobiële middelen werden getest op verbeterde werking tegen intracellulaire L. pneumophila. 6 Hoewel standaard isobolograms sluit de laagste combinatorische concentraties antibiotica die de groei volledig te remmen, hebben we gekozen, op basis van beschikbare kwantitatieve remmende gegevens, om punten te verbinden met een vergelijkbaar niveau van remming met behulp van isolijnen. De meest rechtse isocontour in deze diagrammen komt overeen met de standaard isobologram lijn. Concave isobolograms algemeen geven synergie, terwijl convex isobolograms generally geven onverschilligheid of antagonisme. Voorbeelden van synergie (kaders AC) en onverschilligheid getoond (DF), in dit geval overeenkomt met FIC-indexwaarden van <0,5 en ≥1 respectievelijk. 6
Van de nota, paarsgewijze combinaties van azitromycine, minocycline en rifampicine aangetoond synergie. Daarom werden deze middelen samen getest driewegcombinatie zie figuur 6 6. Hier werd een oppervlak getrokken naar de laagste combinatorische concentraties van de drie antimicrobiële stoffen die tot> 99% remming van bacteriële groei intracellulaire verbinding. De waargenomen hol gevormde oppervlak, op zichzelf suggereren driedimensionale synergie, overeen met een lage FIC index (0,325) indicatief voor aanzienlijke synergie.
Tabel 1: Z 'voor lux operon-rapportER, Legionella Infectie vergelijking van positieve en negatieve controles. Z 'corresponderen met datapunten getoond in figuur 2A, 2B. Deze tabel is gewijzigd ten opzichte van Chiaraviglio en Kirby 2014. 4 Positieve luminescentie Z '> 0,25 zijn gemarkeerd met gele letters op een zwarte achtergrond.
Tabel 2: Z 'voor mNeptune2-reporter, legionellainfectie - vergelijking van positieve en negatieve controles. Z 'corresponderen met datapunten getoond in figuur 2C, 2D. Positieve mNeptune2 fluorescentie Z '> 0,25 zijn gemarkeerd met rode tekens.
Tabel 3: Z 'voor tdTomato-reporter, legionellainfectie - vergelijking van positieve en negatieve controles. Positieve tdTomato fluorescentie Z '> 0,25 zijn gemarkeerd met rode tekens. Valse positieve Z '> 0,25 in verband met overlap van SYTOX Groen en tdTomato emissie zijn gemarkeerd met groene tekens.
Figuur 1: Schilder vertegenwoordiging van dual-reporter assay setup. (A) opnieuw uitplaten van J774A.1-cellen gekweekt in suspensie in 384 putjes. (B) Toevoeging van verbindingen van belang zijn voor microplaten. (C) Gelijktijdige infectie en toevoeging van nucleïnezuur-bindende kleurstoffen; incubatie; en uitlezing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken ure.
Figuur 2: Dual, real-time uitlezen van intracellulaire groei van bacteriën en eukaryote cytotoxiciteit in high-throughput formaat. Overeenkomstige luminescentie (A) en fluorescentie (B) -signalen tijdens intracellulaire infectie van J774A.1-cellen met lux-operon tot expressie Legionella pneumophila. Overeenkomstige fluorescerend eiwit (C) en fluorescentie (D) signalen tijdens intracellulaire infectie van cellen met mNeptune2 J774A.1-expressie Legionella pneumophila. Vier behandelingen worden getoond: negatief DMSO controle ( 
); positieve cytotoxiciteit controle, saponine ( 
); en positieve bacteriële groeiremming controls, azithromycine (tie 4 "src =" / files / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) en levofloxacine ( 
). Coördinaten stellen gemiddelde en standaardafwijking van 96 herhalingen in duplo, 384 putjes. Let op, standaarddeviatie foutbalken voor een aantal data punten waren minimaal en dus binnen gegevenspuntsymbolen verborgen. Panelen A en B zijn gewijzigd ten opzichte van Chiaraviglio en Kirby 2014. 4 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve voorbeelden van ééndimensionale, dosis-respons tests. J774A.1-cellen werden geïnfecteerd met lux operon tot expressie, L. pneumophila en behandeld met een tweevoudige verdunningsreeks van antimicrobiële aangegeven (laBeled als "intracellulaire"). Tegelijkertijd lux operon tot expressie, Legionella werden verdund tot dezelfde uiteindelijke concentratie azen gistextractmedium (AYE) en behandeld met een identieke, tweevoudige verdunningsreeks (als 'axenische). Luminescentie werd voorgelezen twee dagen na bacteriële inoculatie en uitgezet tegen antimicrobiële concentratie. Paneel A omvat antibiotica vaak gebruikt voor de behandeling van Legionella-infectie. Paneel B vergelijkt activiteit van verschillende macrolide antibiotica. Paneel C bevat een aantal verschillende klassen van antimicrobiële middelen met verschillende en soms contrasterende intracellulair axenische potentie. Data punten vertegenwoordigen de gemiddelden en standaarddeviaties van drie afzonderlijke proefboringen per aandoening. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Chiaraviglio en Kirby 2015. 6 Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.
Figuur 4: Voorbeeld van een dual-uitlezing, dosis-respons-experiment voor de bepaling van IC50, CC50 en selectiviteit. Effecten van doxycycline intracellulaire groei en J774A.1 celcytotoxiciteit werden bepaald op dag 1 en 2 na infectie. Data punten vertegenwoordigen de gemiddelden en standaarddeviaties van drie afzonderlijke proefboringen per aandoening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeld van tweedimensionale synergie assays. Combinatorische seriële dilutions paren van antimicrobiële middelen werden getest op synergie tegen intracellulaire groei van Legionella in J774A.1 macrofagen. Isolijnen lijnen verbinden punten van soortgelijke percentage remming. De meest rechtse isobologram verbindt combinaties met volledige intracellulaire groeiremming (> 99% luminescentie reductie vergeleken met onbehandelde controles) en komt overeen met de standaard isobologram plot. Arcering geeft percentage remming zoals afgebakend door de kleurgecodeerde sleutel in elke grafiek. Isolijnen van links naar rechts corresponderen met 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 en 1% toename ten opzichte van onbehandelde controles. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Chiaraviglio en Kirby 2015. 6 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven real-time assays voor gelijktijdige detectie van intracellulaire groei van bacteriën en gastheercellen cytotoxiciteit. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. Ten eerste, voor robuuste test prestaties, moet er voldoende spectrale scheiding tussen bacteriële en cytotoxiciteit uitlezingen zijn. Een dergelijke scheiding is intrinsiek voor combinaties van luciferase operon reporters en TL-DNA-bindende kleurstoffen. Op basis van onze ervaring (Tabel 1-3, figuur 2), het gebruik van dubbele, fluorescente uitlezing vereist niet- overlappende fluorescentiesignalen (bijvoorbeeld toepassing van een ver-fluorescerende reporter proteïne en nucleïnezuur groene kleuring) robuuste verkrijgen, -oplossing op basis van gegevens. Bovendien, uit eerdere ervaring, die mogelijk verband houden beschikbaar lezer optica of oplossing fluorescentie eigenschappen, alleen DNA vlekken met groene of oranje emissie gaf bruikbare gegevens over de cytotoxiciteit, dat wil zeggen, Z 'groter dan> 0,5, een maatregel indicatief strong assay prestaties. 4 Derhalve-oplossing gebaseerde, dual-uitlezing testen zijn enigszins beperkt in termen van wat reporters kan worden gebruikt.
Een andere belangrijke stap is de verhouding van infecterende bacteriën macrofagen. Bacteriële infectie induceert celdood gastheer. Derhalve kan te hoog inoculum leiden tot vroegtijdige gastheer celdood relatief lage bacteriële replicatie en potentiële verwarring van directe cytotoxische effecten van antimicrobiële bestudeerd. De geschikte infecteren verhouding kan empirisch worden bepaald en kan afhangen van virulentie van de specifieke bacteriestam bestudeerd. Een lage verhouding van ongeveer 1: 1 is een goed uitgangspunt. Experimenten zoals die getoond in figuur 2 en tabel 1-3 uitgevoerd met diverse infectie ratio's beoordeling en optimalisering van de voorwaarden voor gebruik in toekomstige testen mogelijk. Van de nota, voor Legionella in het bijzonder het gebruik van een stam achtergrond met nattend lager gastheercel cytotoxiciteit (a flagelline mutant) 8 in belangrijke mate bijgedragen aan de hoge assay robuustheid verkregen. Bovendien is de vertaling van de dual-uitlezing techniek om andere intracellulaire, pathogeen-host-systemen kan ook eisen extra aanpassingen aan de infectie protocol. Legionella groeit niet in weefselkweek medium, waardoor we grotere reporter signaal alleen toeschrijven aan intracellulaire groei. Veel intracellulaire pathogenen (bijv Brucella) kan groeien of mindere mate zowel intracellulair als in weefselkweekmedium. Daarom zijn extra handelingen zoals gentamicine behandeling en wassen van gastheercellen na eerste infectie noodzakelijk zijn extracellulaire replicatie verlaagt en ruimte selectief onderzoek van intracellulaire replicatie capaciteit. 22
Assay scale-up voor gebruik in high-throughput screening en synergie testen in verband met zijn eigen uitdagingen. bijzonderstely, vonden we dat de grote aantallen cellen nodig J774A.1 best kan worden gekweekt in bacteriële plaats van traditionele weefselkweek kolven (zie figuur 1). Echter, om cultuur steriliteit te behouden, spons schuim of andere filter caps voor deze kolven werden verkiezen standaard bacteriële kolf caps gevonden. Plaatsing van een kleine rondschudapparaat platform in een standaard weefselkweek incubator toegestaan ons scale-up cultuur uit te voeren met de apparatuur aan de hand. Tenslotte gebruik van geautomatiseerde doseersystemen (Figuren 1A, B) aanzienlijk vergemakkelijkt assay opzetten en testen van combinatorische verdunningsreeks.
Met name adequate detectie van bacteriële replicatie is afhankelijk van de mogelijkheid om ofwel een lux operon of fluorescerend eiwit voldoende expressie in de bacteriestam plaats. Daartoe hebben we een set van fluorescerende en lux operon reporter transposons gedreven door een sterke constitutieve promotor die fa moet toelaten gecreëerdcile merken van verschillende soorten bacteriën (Kang en Kirby, gegevens niet getoond). Als alternatief voor pathogenen waarvan de intracellulaire replicatie blijkt cytotoxisch voor de gastheercel, real-time metingen cytotoxiciteit alleen kan worden gebruikt als een surrogaat voor intracellulaire replicatie. In dit geval, cytotoxische en inactieve verbindingen kunnen niet betrouwbaar onderscheiden in één assay.
De beschikbaarheid van real-time uitlezing out biedt bijzonder voordeel voor high-throughput screening assays. In het bijzonder, het vermijden van eindpunt beoordeling van de groei van bacteriën (kiemgetal bepaling) 7 en cytotoxiciteit (toevoeging van levensvatbaarheid van de cellen reagens bij beëindiging van de test) 23,24 elimineert verschillende experimentele stappen en de bijbehorende arbeid. Bovendien tijdsverloop gemakkelijk worden in dezelfde test wells met minimale toename experimentele inspanning gevolgd. Belangrijk is dat de beschikbaarheid van twee verschillende soorten van bacteriële replicatie reporters (bacteriënl lux operon en fluorescerend eiwit) heeft een bijzondere betekenis voor high-throughput screening assay ontwikkeling. In het bijzonder, kunnen vals-positieve antimicrobiële uitlezing als gevolg van valse interferentie met lux operon of fluorescerende reporter uitgang door het gebruik van beide reporters worden aangepakt opeenvolgend in complementaire orthogonale assays in primaire en secundaire screening, respectievelijk 25. Met name, we vonden dat de bacteriële lux operon was gevoeliger reporter kiem- met een ongeveer 20-voudig tot 100-voudig lager dan de detectiegrens onze fluorescent proteïne reporters. Echter, lux uitgang is waarschijnlijk onder meer valse positieven op basis van de verschillende genproducten en de stappen die nodig zijn voor lichtopbrengst. 26 Meer in het bijzonder, in tegenstelling tot eukaryotische enkel gen luciferase reporters, de bacteriële lux operon is een vijf-gencluster dat zowel een tweecomponenten luciferase-enzym codeert en genen voor endogene synthese van luciferase substraat. Het zouzinvol daarom de lux operator reporter te gebruiken in een primaire scherm om voldoende gevoeligheid te garanderen, en het fluorescerende eiwit verslaggevers in secundaire analyses specificiteit te waarborgen.
Samengevat, de beschreven methodologie biedt real-time, non-destructieve alternatieven eindpunt assays voor het meten bacteriële replicatie en eukaryote cytotoxiciteit dus daarmee methodologisch eenvoudige en veelzijdige werkwijze voor het beoordelen antimicrobiële effecten op intracellulaire pathogenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Onderzoek gemeld in dit manuscript werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten van de National Institutes of Health onder award nummer R01AI099122 om Jek De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Gezondheid. We willen graag bedanken Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu en Rachel Warden uit de ICCB-Longwood Screening Facility en / of het National Screening Laboratorium voor de New England Regionale Centers of Excellence in Biodefense en Emerging Infectious Diseases (gesteund door U54AI057159) voor hun hulp bij de ontwikkeling en de prestaties van high-throughput screening assays. We willen ook graag bedanken Kenneth P. Smith voor nuttige opmerkingen over het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J774A.1 cells | American Type Culture Collection | TIB-67 | Host cell |
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Yeast extract, ultrafiltered | Becton-Dickinson/Difco | 210929 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors |
| Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt | Sigma-Aldrich | K2000 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Potassium phosphate, dibasic | Thermo Fisher Scientific | P288-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7755 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Ammonium iron(III) citrate | Sigma-Aldrich | F5879 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately |
| Potassium hydroxide solution, concentrated | Thermo Fisher Scientific | SP236-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Deonized water | N/A | N/A | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Thymidine (tissue culture grade) | Sigma-Aldrich | T1895 | For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640 |
| RPMI 1640, standard formulation | Corning via Thermo Fisher Scientific | 10-040-CV | For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine |
| RPMI 1640 lacking phenol red | Corning via Thermo Fisher Scientific | 17-105-CV | For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use |
| L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) | HyClone via Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration |
| Iron-supplemented calf serum | Gemini Bioproducts | 100-510 | For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density |
| SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S7020 | For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration. |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-255-26 | For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead) |
| Orbital shaker | BellCo Glass | 7744-01010 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately) |
| Shaker flasks (250 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-04 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (250 ml) | BellCo Glass | 7744-16250 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker flasks (1,000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-07 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (1,000 ml) | BellCo Glass | 7744-16100 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-1490-038 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps |
| MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes |
| Combi standard bore manifold | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl |
| White 384 well dishes treated for tissue culture | Corning | 3570 | For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully |
| DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving positive control and test compounds |
| Azithromycin | Sigma-Aldrich | PHR1088 | Antibiotic positive control |
| Saponin (from Quillaja bark) | Sigma-Aldrich | S-4521 | Cytoxicity positive control |
| Multichannel pipettor | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette | For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing |
| Epson pin transfer robot | Epson/ICCB-L | (Custom equipment) | For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays |
| D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | D300 | For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl |
| T8+ cartridges for D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | T8+ | For dispensing test compounds |
| Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera | Nikon | Ti | For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution |
| Glass-bottom tissue culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope. These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms. |
| Photoshop CS6 | Adobe | Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images. | |
| Mathematica 10 | Wolfam | For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms. |
References
- Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
- Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
- Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones? Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
- Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
- Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
- Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).
- Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
- Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
- Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
- Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
- Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457 (2014).
- Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).
