Abstract
מדדים מסורתיים של פעילות מיקרוביאלית תאיים cytotoxicity תא אוקריוטים להסתמך על מבחני הסיום. מבחני הסיום כאלה דורשים כמה צעדים ניסיוניים נוספים לפני readout, כגון תמוגה התא, נחישות יחידת המושבה להרכיב, או בנוסף מגיב. בעת ביצוע אלף מבחנים, למשל, במהלך הקרנת תפוקה גבוהה, המאמץ במורד הזרם הנדרש עבור סוגים אלה של מבחנים הוא ניכר. לכן, כדי להקל על גילוי מיקרוביאלית תפוקה גבוה, פתחנו assay בזמן אמת לזהות מעכבים הזמניים של התפתחות חיידקים תאית ולהעריך cytotoxicity תא האיקריוטים. באופן ספציפי, זיהוי התפתחות חיידקים תאית בזמן האמת היה מופעל על ידי סימון זני הקרנה חיידקי גם עם אופרון לוקס בקטריאלי (1 assay דור st) או כתבי חלבון פלואורסצנטי (2 דור nd, assay המאונך). לצבוע רעיל, קרום התא-impermeant, חומצות גרעין מחייבגם נוסף במהלך הדבקה ראשונית של מקרופאגים. צבעים אלה אינם נכללים תאי קיימא. עם זאת, תאי מארחים לא-ישימים לאבד שלמות קרום המתיר כניסה וסימון ניאון של DNA הגרעיני (חומצת deoxyribonucleic). יש לציין, DNA כריכה קשור לעלייה גדולה תשואת קוונטים פלורסנט המספקת הודעת פתרון המבוסס על מות תא מארח. השתמשנו assay המשולב הזה לבצע מסך תפוקה גבוהה בפורמט microplate, ועל מנת להעריך את הצמיחה ואת cytotoxicity תאיים על ידי מיקרוסקופ. יש לציין, antimicrobials עשוי להפגין סינרגיה שבו ההשפעה המשולבת של שתיים או יותר antimicrobials כאשר מיושמים יחד עולה כאשר מיושמים בנפרד. בדיקת לסינרגיה במבחנה נגד פתוגנים תאיים היא בדרך כלל משימה אדירה כמו פרמוטציות קומבינטורית של אנטיביוטיקה בריכוזים שונים צריך להיבדק. עם זאת, מצאנו כי assay בזמן האמת שלנו בשילוב עם אוטומטיות, דיגיטלי מחלק הטכנולוגיה permitted בדיקות סינרגיה קליל. באמצעות גישות אלו, הצלחנו לסקור פעולה שיטתית של מספר רב של antimicrobials לבד או ביחד נגד הפתוגן התאי, pneumophila הלגיונלה.
Introduction
פתוגנים גדלים או מתגוררים באופן זמני בתאים תאיים קשים למגר טיפולי. לחייב או יחסית לחייב פתוגנים תאיים כגון pneumophila הלגיונלה, burnetii Coxiella, spp Brucella. Francisella, tularensis, ו spp Mycobacterium. לעתים קרובות דורשים ממושך קורסים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי לריפוי כי עשוי לנוע בין חודשים ואף שנים. יתר על כן, פתוגנים תאיים עשויים זמני לכבוש נישות תאיות בדרך זו לברוח אישור על ידי קורסים רגילים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי, ואחר כך יוצא להתחיל סיבובים חדשים של זיהום ארסי. Staphylococcus aureus 1 וזיהומי uropathogenic 2,3 Enterobacteriaceae הם שתי דוגמאות להכרה גוברת. לכן, מטרת גילוי תרופות בסיסית היא לזהות antimicrobials רומן חודרים לתאים תאיים. טיפול אופטימלי במהירות לבעראורגניזמים תאיים ולמנוע התפתחות של עמידות באמצעות חשיפה מיקרוביאלית תת-מעכבות במיוחד רצוי.
לשם כך, פתחנו טכנולוגית הקרנת תפוקה גבוהה לזהות antimicrobials תאי-penetrant מיקוד הצמיחה התאית של הפתוגן המודל, pneumophila הלגיונלה. 4 תצפיות קליניות קודמות עולות כי בדיקות רגישות מיקרוביאלית תקן לא לחזות במדויק יעילות טיפולית vivo נגד אורגניזם זה. באופן ספציפי 5, זה היה בגלל סוגים עיקריים של antimicrobials כמו β-lactams ו אמינוגליקוזידים, למרות יעיל מאוד נגד axenically גדלה הלגיונלה, אינם חודרים מספיק לתוך התאים התאיים שבו הלגיונלה מתגורר. 5,6 ראיות בהמשך הציעו טכני מורכבים יותר מבחני צמיחה תאית חזה יעילות קלינית ביעילות. 7
לכן, פתחנו טכנולוגיה לקביעה בזמן האמת של התפתחות חיידקים תאית. 6 הדבר זה הושג באמצעות שימוש זן חיידקים השונה באמצעות שילוב של אחת המעמד של חיידקים בלוציפראז אופרון 8 (assay הדור הראשון, שתואר לעיל) 4 או פלורסנט חלבון 9 עיתונאים (דור שני, assay המאונך, המתוארת כאן) לתוך כרומוזום החיידקים. בדרך זו, זורח או אות ניאון מספק פונדקאית, readout בזמן אמת של מספר חיידקים.
עם זאת, תכונות אלה לא להתייחס מתערבים מרכזיים infectio התאימבחני n, השפעות חוץ-היעד בתא הפונדקאי. בפרט, מותו של תא המארח מגביל מטבעו צמיחה תאית וגורם זיהוי חיובי כוזב של אפקט מיקרוביאלית. כמו תרכובות רבות בספריות הקרנה הן תאים איקריוטיים, רעילות תוצאות חיוביות שגויות כאלה היו להציף antimicrobials נכון, דבר מחייב מספר גדול של מעקב, מבחני cytotoxicity קץ לשם קבלת החלטה.
לכן, זה היה עניין רב כדי להיות מסוגל להעריך כדאיויות תא האיקריוטים וצמיחה תאית זמנית. יש לציין, מאפיין של תאים איקריוטיים הלא קיימא הוא הפגיעה בשלמות קרום התא. בדיקות הבודקים את החדירות של קרום התא עשוי אפוא לשמש כדי להעריך כדאיות התא. אנחנו שאפיינו את היכולת של סדרת-impermeant קרום התא putatively, ניאון, צבעים-DNA מחייבת לגשת להכתים DNA הגרעיני של תאים מתים. 4 ביום ה- DNA מחייב גרעינית, צבעים אלה מהווים גידול גדול quantuמ פלורסנט תשואה וכתוצאה מכך האות מוגברת על קרינת פתרון רקע. ככזה, צבעים אלה ספקו הודעה כמותי של מוות של תאים איקריוטיים. 4 יש לציין, מצאנו כי כמה היו רעילים עצמם במהלך שיתוף דגירה ממושכת עם מקרופאגים J774. כאשר נוספו במהלך הזיהום הראשוני, הם סיפקו בזמן אמת, ההודעה ניאון של מוות של תאים איקריוטיים שניתן למדוד על ידי fluorimeter microplate או שנצפה מיקרוסקופית.
לכן, על ידי שילוב של השימוש עיתונאי חיידקים ולא רעיל, קרום impermeant, צבעי ה- DNA מחייב, הצלחנו לפתח assay פשוט, שאינו הרסני, בזמן אמת כדי למדוד הן עומס חיידקים ו cytotoxicity תא אוקריוטים זמנית. assay זו אפשרה לנו להקרין בפורמט צלחת 384 גם ~ 10,000 bioactives ידוע כולל ~ 250 antimicrobials ו> 240,000 מולקולות קטנות עם פעילות uncharacterized מבחינה תפקודית עבור היכולת לעכב צמיחה תאית שלPneumophila הלגיונלה, בעוד באותו הזמן להפקת נתוני cytotoxicity התא אוקריוטים לכל מתחם. 6 הניתוח שלנו של antimicrobials הידוע מפני צמיחה תאית של הלגיונלה היה החקר המקיף ביותר מסוג זה עד כה. 6
בהתבסס על היעילות של פורמט assay שלנו, אנו ובהמשך גם בחנו את ההשפעות סינרגיסטי הפוטנציאלי של antimicrobials ידוע מתי להשתמש בשילוב. אחד המבחנים סינרגיה הנפוצים ביותר, assay שחמט שנקרא, מבוצע standardly ידי הערכת ההשפעות קומבינטורית של דילולים סדרתי כפולה של שניים או יותר antimicrobials. 10 מבחנים אלה, סינרגיה מוגדרת על ידי התצפית של השפעה גדולה יותר כאשר שתיים או יותר antimicrobials מוחלים יחד מסכום ההשפעות של כל מיושמות בנפרד. מן ראוי לציין כי, עד כה, התמקד רק ובדיקת סינרגיה סלקטיבית בוצעה נגד pneumophila הלגיונלה התאי
כדי לאפשר בדיקת סינרגיה, עשינו שימוש הצמיחה תאית בזמן האמת שלנו / assay cytotoxicity איקריוטיים בשילוב עם טכנולוגיה מחלק דיגיטלית אוטומטית 6. אוטומציה זה מותר לנו לוותר דילולי סדרה של תרכובות המומסות DMSO או בתמיסה מימית לבד או בשילוב בפורמט 384 גם. 11 יתר על כן, טכנולוגית טיפול נוזל חזקה כאלה מותר לנו לבצע ברזולוציה גבוהה יותר בקלות, שורש ריבועי-של-שני (ולא סטנדרטי, רזולוציה נמוכה יותר, הכפלה) שילובי דילול להשיג רמות גבוהות יותר של סגוליות בסינרגיה דו הממדים, שחמט שלנו אָנָלִיזָה. החלטה זו הייתה יקרה במיוחד מענה לחששות בתחום סינרגיה על שחזור בעת שימוש סדרת דילול הכפול 12. לבסוף, assay שלנו הוא כמותי וגם יסefore נמדד דרגות של עיכוב. כתוצאה מכך, assay כבש את מכלול המידע מעכב, שבא לידי ביטוי isobolograms isocontour שבו isocontours להתחבר ריכוזים קומבינטורית עם רמות דומות של עיכוב צמיחה. 6 זה אסטרטגיה והתוויית מותרת להדמיה של עקומות קומבינטורית מנה-תגובה. כדי להמחיש המתודולוגיה שלנו, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע מבחנים אלה ולהציג תוצאות נציג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמיחה התאית Real Time ו Assay Cytotoxicity Cell איקריוטיים
- תאי מארח הכנה (תאי J774A.1)
- תרבות J774A.1 תאי מקרופאג דמוי musculus Mus ההשעיה ב RPMI 1640 עם 9% נסיוב עגל-בתוספת ברזל. בתחילה מעבר צלוחיות בתרבית רקמה. לאחר התאים הפכו ומחוברות בבקבוק תרבות 75 ס"מ 2 רקמות 15 מ"ל של מדיום, לפצל על ידי גירוד ודילול ל -65 מ"ל עם אותו סוג של מדיום, מתוכם 15 מ"ל מוחזר אל הבקבוק בתרבית רקמה ו -50 מ"ל מועבר בבקבוק שייקר 250 מיליליטר חיידקים.
- עבור מדרוג כלפי מעלה, תרבות ההשעיה ב 250 מ"ל ו / או 1,000 צלוחיות חיידקי מ"ל מלא עד נפח חמישית עם המדיום בתרבית רקמה. לאוורר ידי קביעת מהירות סיבוב של כ 120 סיבובים לדקה. עבור צמיחה עקבית, לדגור בדיוק 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
- קציר תאים כאשר הם מגיעים צפיפות בטווח 2.5 x 10 6 תאים/ מ"ל עד 5 x 10 6 תאים / מ"ל. ודא אחוז תאים המת (רוב assayed בקלות על ידי מכתים הכחול trypan) אינו עולה על 25%, כפי תאים מתים יגדלו רעשי רקע מבחני רעילות.
- פלייט בלבן, תרבות שטופלו רקמות, 384 גם microplates ב 5 x 10 4 תאים J774A.1 במדיום בתרבית רקמה 30 μl לכל טוב. דגירה microplates לילה להשיג מפגש 90% ביום של הניסוי.
- פלורסנט הכנה או pneumophila הלגיונלה פלורסנט
- מעבר pneumophila L. (Lp02 :: flaA :: לוקס 8) חיידקים על המדיום המתאים, כלומר, תמצית שמרים פחם שנאגרו (BCYE) בינוני. אם אתה משתמש זן thymidine auxotrophic, להשלים בינוני עם 100 מיקרוגרם / מ"ל thymidine. כן כתמי חיידקים לניסויים על ידי הפצת אורגניזמים עבה בצלחת BCYE חדשה דוגר יום אחד (אם מתוך קטע צלחת קודם) או שניים עד שלושה ימים (אם ממלאים קפוא) להשיג ומחוברותצְמִיחָה.
- הכן צלחות BCYE ידי המסת תמצית שמרים 10 גרם, 10 גרם N - (2-acetamido) חומצה -2-aminoethanesulfonic, 0.35 גרם K 2 4 HPO, ואשלגן monobasic 1 גרם α-ketoglutarate ב 950 מ"ל מים deionized. התאם ל -6.9 pH עם הידרוקסיד אשלגן (≥2.5 מיליליטר של 11.9 פתרון טוחן).
- הוסף 15 אגר גרם ו פחם פעיל 2 גרם; ומביאים 1 L נפח סופי. הוספת בר ומערבבים מגנטי החיטוי. בינוני מצננים 55 ° C ולהוסיף פתרונות מעוקרות מסנן המכיל ציטראט 0.4 גרם L-ציסטאין 0.42 גרם אמוניום ברזל (III) מומס במים deionized. השתמשו בצלחת ומערבבים מגנט לערבב לפני שוטף צלחות פטרי.
- לבדיקה של צמיחה pneumophila ל במדיום הגידול axenic, להכין מרק ACES-תמצית שמרים (AYE) על ידי שילוב כל ריאגנטים כימיים המשמשים BCYE למעט פחם אגר. סנן לעקר להשתמש מיד, או להקפיא לניסויים מאוחר יותר.
- אורגניזמים Resuspend ב saהמדיום שלי בתרבית רקמה המשמש תאים J774A.1 עם 100 מיקרוגרם / תוספי thymidine מ"ל לפי העניין.
- מעבר pneumophila L. (Lp02 :: flaA :: לוקס 8) חיידקים על המדיום המתאים, כלומר, תמצית שמרים פחם שנאגרו (BCYE) בינוני. אם אתה משתמש זן thymidine auxotrophic, להשלים בינוני עם 100 מיקרוגרם / מ"ל thymidine. כן כתמי חיידקים לניסויים על ידי הפצת אורגניזמים עבה בצלחת BCYE חדשה דוגר יום אחד (אם מתוך קטע צלחת קודם) או שניים עד שלושה ימים (אם ממלאים קפוא) להשיג ומחוברותצְמִיחָה.
- זיהום macrophage
- להוסיף תרכובות בדיקה של עניין (תרכובות הקרנה, בקרות חיוביות ושליליות עבור עיכוב התפתחות חיידקי תמוגה תא אוקריוטים). רצוי, לפזר פתרונות המניה ב ≥500x DMSO (sulfoxide דימתיל) או בתמיסה מימית לאפשר דילול מספיק של הרכב.
- למרות פתרונות מניות ניתן לאחסן קפוא, להימנע להקפיא להפשיר מחזורים עבור תרכובות antimicrobials יציבות.
- לדלל חיידקים זורח למקד של 2.5 x 10 6 CFU (יחידת המושבה להרכיב) / m וחיידקים הכתב שכותרתו ניאון כדי 1.0 x 10 7 CFU / ml במדיום בתרבית רקמה ולהוסיף רעיל, קרום impermeant המתאים דיאלקטרי גרעין מחייב לצבוע בריכוז assay 2.5x הסופי.
- הוסף 20 μl של תערובת לכל תרבות J774A.1 היטב, נפח assay הסופי50 μl, ריכוז חיידקי הסופי 1 x 10 6 CFU / ml (כתב אופרון לוקס) או 4 x 10 10 6 CFU / ml (כתב חלבון פלואורסצנטי).
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים ב 5% CO 2 ב 100% לחות יחסית כדי למנוע תופעות קצה אוויר.
- להוסיף תרכובות בדיקה של עניין (תרכובות הקרנה, בקרות חיוביות ושליליות עבור עיכוב התפתחות חיידקי תמוגה תא אוקריוטים). רצוי, לפזר פתרונות המניה ב ≥500x DMSO (sulfoxide דימתיל) או בתמיסה מימית לאפשר דילול מספיק של הרכב.
- assay Readout
- קרא התפתחות חיידקים רעילות לתא איקריוטיים על microplate luminometer ו fluorimeter בהתאם לכתבים בשימוש.
- כדי למנוע תופעות קצה הקשורים בטמפרטורה, תרמית לאזן microplates לפני קריאת הארה בהנפקה בשכבה אחת על ספסל במעבדה עם מכסים פתוחים למשך כ 20 דקות (או בתוך ארון בטיחות ביולוגי עם מכסים לסירוגין במשך כ 10 דק ').
- חזור microplates חממה אם הודעה בזמן האמת בנקודות זמן מאוחר יותר היא רצויה.
- קרא התפתחות חיידקים רעילות לתא איקריוטיים על microplate luminometer ו fluorimeter בהתאם לכתבים בשימוש.
ניתוח 2. נתונים
- לנרמל את הנתונים כדי con החיובית והשליליתקבוצת ביקורת לחשב אחוזים או לקפל-עיכוב התפתחות חיידקים תאי cytotoxicity אחוזים עבור תאים איקריוטיים.
- כדי להעריך החוסן assay, לחשב הפרדה סטטיסטית בין בקרות חיוביות ושליליות הן עיכוב התפתחות חיידקים cytotoxicity באמצעות Z-factor (Z ') ניתוח כאשר Z' = 1 - 3 (σ p + σ n) / | מיקרון p + מיקרון n |. ב p המשוואה, σ זה σ n הם סטיות התקן עבור בארות שליטה חיוביות ושליליות, בהתאמה; μ p ו מיקרון n הם הערכים הממוצעים עבור בארות שליטה חיוביות ושליליות, בהתאמה.
- עבור מבחני תפוקה גבוהה הקרנה, לחשב z-ציוני תקן (או חלופה אחרת, מדידות סטטיסטיות כמוני) להערכת תופעות של תרכובות בדיקה של עניין. לחלופין, לחשב מתקפל הפחתה פשוטה או להתחבר פי הפחתה כמו פיזיולוגית פוטנציאל ליותר רלוונטי מידה של גודל אפקט לחיידקים משכפלים גיאומטרי.
3. יחיד ורב ממדית (כלומר, סינרגיה) מנה-תגובה פרשנות לבחינות נתונים
- הכן מקרופאגים וחיידקים כמתואר בסעיף בפרוטוקול 1.
- רק לפני הדבקה או דגירת axenic, להוסיף antimicrobials עניין ניסיוני הסדרה, הכפלת סדרת דילול, במטרה פורש על הקצה הגבוה ריכוז כי מבטל לחלוטין צמיחה (כלומר, ריכוז המעכבות המינימאלי או MIC) ועל נמוך בסופו של ריכוז כי לא מראה פעילות ברורה.
- השתמש במערכת טיפול נוזל אוטומטית כדי להקל מנת תגובה אחת והתקנת בדיקות סינרגיה קומבינטורית דרך בנוסף ישירים, אוטומטי של דילולים מיקרוביאלית על פי הפרוטוקול של היצרן.
- שקול שימוש דילולים הכפלת-משנה, למשל,841 / 54841eq1.jpg "/> - לקפל סדרת דילול, ו assay משכפל מנת לשפר את דיוק ואת שחזור של נתונים.
- עבור זיהום מקרופאג, לדלל חיידקים זורח למקד של 2.5 x 10 6 CFU (יחידת המושבה להרכיב) / מ"ל במדיום בתרבית רקמה. הוסף 20 μl של תערובת לכל תרבות J774A.1 היטב, נפח assay הסופי 50 μl, ריכוז חיידקי הסופי 1 x 10 6 CFU / ml; לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ב -100% לחות יחסית.
- לבדיקת צמיחת axenic, לדלל חיידקים זורחים לריכוז סופי של 1 x 10 6 CFU / ml במדיום AYE, להוסיף 50 μl היטב בכל צלחת 384 גם לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ב -100% לחות יחסית.
- חישוב מדד ריכוזיות מעכב שבר עבור שילובים מיקרוביאלית מעכבות התפתחות חיידקים. עבור כל תרופה בשילוב (a, b,.. N) מביא מלא או> 99% עיכוב של g חיידקיםrowth, לחשב את ריכוז מעכבות שבר הפרט (FIC a, b, n...) כדלקמן: FIC a = הריכוז מתחם "a" מחולק ריכוז המעכב המינימאלי של "a" בפני עצמו. . שימוש באותה נוסחה, לחשב ב FIC, וכו 'ואז לחשב את מדד FIC קומבינטורית או
FIC = FIC a + b + FIC. . N .FIC לכל צירוף מעכב. - השתמש מדד קומבינטורית שחורג קליעה מ -1.0 להעריך סינרגיה. שקול וניתוק ≤0.5 כאינדיקציה שמרנית של אפקט סינרגיסטי ≥4, השפעה אנטגוניסט. 12
- מגרש isobolograms, isobolograms isocontour, ו / או isosurface isobolograms 6 ייצוגים גרפיים חלופי ליום תופעות קומבינטורית.
FIC = FIC a + b + FIC. . N .FIC לכל צירוף מעכב. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
assay צמיחה התאי microplate
איור 1 דיאגרמות הצעדים assay. השלבים האוטומטיים לראות יכולים להתבצע באופן ידני. עם זאת, התפוקה היא הקל מאוד באמצעות מערכות טיפול נוזליות.
איור 2 מציג תוצאות נציג מתוך microplate 384 גם,-readout כפול, צמיחה תאיים בזמן אמת assay cytotoxicity תא אוקריוטים באמצעות זן הלגיונלה (Lp02) מסומן גם עם אופרון לוקס (איורים 2A, 2B) או חלבון פלואורסצנטי mNeptune2 ( כתב האיור 2C, 2D). תרכובות מלאות חיוביות ושליליות (DMSO, אנטיביוטיקה, saponin) נוספו לוחות דרך שימוש רובוט העברת סיכה כדי לדמות את ביצועים בסביבת הקרנת תפוקה גבוהה. הלגיונלה משמעותי (איורים 2A, 2C) ניתן להבחין בקלות בהשוואה תמוגה saponin ובקרות שטופלו באנטיביוטיקה ב 24 עד 72 שעות עבור חיידקים זורח 48 עד 72 שעות עבור חיידקים שכותרתו mNeptune2, בהתאמה. הלגיונלה בדרך כלל lyses תאי מארחים לאחר משכפל במשך 48 עד 72 שעות. זה יכול להיות מוערך ב דמויות 1B ו 1D, אשר מראה גדל קרינה של Sytox ירוק (נציג, impermeant, לצבוע חומצה מחייבת גרעין סמן מות תא מארח) לאורך זמן. Cytotoxicity מגיע בסופו של דבר הכמות המקסימלית שנצפתה דטרגנט (saponin), תמוגה התא המארח, בקרה חיובית. אורגניזמים שכותרתו mNeptune2 נוספו בכל בידוד פי ארבעה יותר מאשר חיידקי שכותרתו אופרון לוקס, והיווה סביר להרג תא מארח מהיר יותר מוקדם קשורים לעליית אותות קרינה בניסויי mNeptune2. כצפוי, טיפול מיקרוביאלית יעיל (levofloxacin או azithromycin) קודםented היא תמוגה תא הצמיחה מאכסנת. לעומת זאת, תרכובות ציטוטוקסיות שהגבילו צמיחה תאית דרך הרס של התא המארח (למשל, saponin) ניתן הייתה לזהות בקלות על ידי שילוב של הארה נמוכה או קרינת mNeptune2, ואת אות cytotoxicity קשור גבוהה. יתר על כן, תצפית של ירידה בשילוב בשני הארת קרינת mNeptune2 (התפתחות חיידקים), ו cytotoxicity בתנאי ביטחון סביר כי תרכובת הוא מעכב צמיחה תאית נכון (למשל, azithromycin ו levofloxacin שולטת חיובי) ולא חיובי כוזב וכתוצאה מהתערבות מזויפת עם אות כתב חיידקים.
טבלה 1 - 3 מראה Z נציג עבור שלושה עיתונאי חיידקים שונים (אופרון לוקס, mNeptune2, tdTomato) ויחסית קריאות הקרינה מתאימות לקבוצת ביקורת. א ת '> 0.5 מצביע על Statisticaמתאים assay lly חזק הגדרות תפוקה גבוהה; עם זאת, Z התחתונה 'עשויה להיות מתאימה תלוי מטרות ניסוי, כלומר, את היכולת להבחין פחות או יותר עדינות תופעות של מבחן תרכובות או הפרעות מהימנות. בהתבסס על תוצאות האיור 2, mNeptune2 לא היה רגיש עיתונאי כמו אופרון בלוציפראז חיידקים. לכן, כצפוי, הבדל חזק בין אות mNeptune2 בנגטיב (DMSO) וחיובי (levofloxacin, azithromycin, saponin) שולט צמיחה מעכבת לא נצפה עד יום 2 או 3 ימים לאחר התחלת הדגירה, בניגוד מוקדם, אות סבירה חזקה של לוקס חיידקי כתב אופרון ביום 1 לאחר הדבקה. לעומת זאת, tdTomato, כתב ניאון חיידקים חלופי, הראה Z לא טוב "במהלך קורס זיהומיות. מאפייני פלורסנט הכי מוצלחים נבעו בחלקו הסגת גבול של עירור הקרינה וזנב פליטה לתוך הטווח המשמש הודעה אופטימלית של tdTomato signal. הסגת גבול זה יכול להיות מוערך מן Z החיובית 'נמצאת saponin tdTomato לעומת השוואת levofloxacin (רומז הבדל משמעותי במספרי חיידקים תחת שני תנאים שבם חיידקים אין לשכפל). תוצאה זו יכולה להיות מוסברת על ידי תמוגה saponin גרימת אות קרינה חזקה, שזנב הוא זוהה כמו פליטת tdTomato, ולכן מוביל הבדל מזויף בין saponin והבקרות אנטיביוטיות. לכן, בעוד לוקס החיידקים וכתבי mNeptune2 בשילוב עם קרינה להופיע שמיש-readout הכפול, מבוסס-פתרון, מבחנים בזמן אמת, את tdTomato שילוב קרינה, לפחות בלי deconvolution אות מתמטי נוסף, לא.
איור 3 מראה שפורסם בעבר דוגמאות של עקומות מנה-תגובה של antimicrobials הידוע באמצעות אופרון לוקס, אורגניזמים שכותרתו כתב. יש לציין 6, הלגיונלה עושה לא לגדול במדיום בתרבית רקמה. לכן, שכפול של חיידקי מבחני זיהום מקרופאג מייצג צמיחה תאית בלבד. עם זאת, הלגיונלה יגדל axenically בתוך נתרן מיוחד, נמוך, אסים נוזליים (N - (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic חומצה) בינוני תמצית שמרים. 20 כאן השפעות על צמיחה תאית axenic הושוו. באמצעות מערכות צמיחה דו אלה, צפינו כי antimicrobials קוטב כגון β-lactams (meropenem, ceftriaxone) ו אמינוגליקוזידים (מידע לא מוצג) הם מעכבי עניים של צמיחה תאית, בניגוד האפקטים החזקים שלהם על צמיחת axenic. יש להניח יעילות עניי מבחני זיהום מקרופאג מבוססות על חוסר יכולת לגשת הנישה בשכפול הדנ"א הלגיונלה התאית. לעומת זאת, antimicrobials תא-penetrant איקריוטיים כגון quinolones (levofloxacin) ו azithromycin, הפגין תופעות חזקות משני חיידקים תאיים axenic.
together.within-page = "1"> בנוסף, השימוש של עקומות מנה-תגובה מותר assay כפול ההודעה הן עיכוב חיידקים cytotoxicity איקריוטיים שייקבע באותו ניסוי. באופן ספציפי, 50 IC (ריכוז 50% עיכוב התפתחות חיידקים) ו CC 50 (ריכוז שגורם 50% מוות של תאים איקריוטיים) ניתן לקבוע, סלקטיביות, CC 50 / IC 50, מחושב. כל שלושה הצעדים הם קריטריונים חשובים להתקדמות מתחמת במאמצים לגילוי תרופות. איור 4 מראה דוגמא של עקומות כפולות, מנה-תגובה כזו בתגובת דוקסיציקלין האנטיביוטיקה, נתונים המתקבלים מאותה בארות הקרנה לאורך זמן. באיור 4 א, ביום 1 של זיהום, על שכפול חיידקים פי מאה ניכר אפס בארות בדיקת האנטיביוטיקה לעומת הרמות הגבוהות ביותר של עיכוב שנצפו עם אנטיביוטיקה. היה רעיל לתא אוקריוטים נלווים מינימאלי למעט ב doxycy גבוהה מאודריכוזים קליין (≥10 מיקרוגרם / מ"ל). ביום 2 (איור 4B), אות לוקס חיידקים הייתה כ -10 לקפל יותר מאשר יום 1 עם cytotoxicity שכפול הקשורים חיידקים משמעותיים נצפה בריכוזים מיקרוביאלית נמוכים. כצפוי, מוות התא המארח הנגרמת שכפול חיידקים עוקב מקרוב עם מספרים בקטריאלי (אות לוקס) לאורך עקומת מנה-תגובה מיקרוביאלית. בריכוזים מיקרוביאלית גבוהים cytotoxicity מצטמצם בסיס, עד ריכוזים גבוהים מאוד, שבו דוקסיציקלין שוב מופיע רעיל כפי שנצפה ביום 1. ההסטה לכאורה של המנה-תגובת ההארה כלפי ריכוזי מיקרוביאלית מעט גבוהים לעומת מדידות cytotoxicity קרינה המבוססת היא קצת מוגזמת כאשר זוממים הארה cytotoxicity במאזני יומן ולינארית, בהתאמה, כפי שמוצג. IC 50 התפתחות חיידקים היה מ"ל כ 100 ng / תוך CC 50 היה כ 10 מיקרוגרם / מ"ל, 50 שתואר לעיל לטיפול דוקסיציקלין של השושלת לויקוציטים, שורת תאים HL-60. 21 לכן, סלקטיביות הכולל נקבע בניסוי כפול-readout זה היה כ -100.
איור 5 מראה שפורסם בעבר isobolograms isocontour הקשורים בדיקות סינרגיה דו ממדים שבו שילובי pairwise של antimicrobials נבדקו עבור אפקט משופר נגד pneumophila ל תאיים. 6 למרות isobolograms תקן להתחבר הריכוזים קומבינטורית הנמוכים ביותר של אנטיביוטיקת מעכבות צמיחה לחלוטין, בחרנו, על סמך נתונים מעכבים כמותי הזמין, להתחבר נקודות עם רמות דומות של עיכוב באמצעות isocontours. הזכות ביותר isocontour בדיאגרמות אלו מקבילה לקו isobologram סטנדרטי. isobolograms קעור מצביעים סינרגיה כלל, בעוד generall isobolograms קמורy מצביע אדיש או עוינות. דוגמאות של סינרגיה (לוחות AC) ואדישות מוצגות (DF), במקרה זה מתאים לערכי מדד FIC של <0.5 ו ≥1, בהתאמה. 6
ראוי לציין, שילובים pairwise של azithromycin, minocycline, ו ריפמפיצין הפגינו סינרגיה. לכן, סוכנים אלה נבדקו יחד בשילוב המשולש כפי שמוצגים באיור 6 6. הנה, משטח נמשך לחבר את ריכוזי קומבינטורית הנמוכים ביותר מבין השלושה antimicrobials שהוביל> 99% עיכוב הצמיחה תאית חיידקים. המשטח הקעור בצורה ציין, בעצמה רמיזות של סינרגיה תלת ממדים, תואם אינדקס FIC נמוך (0.325) מעיד על השפעת סינרגיה משמעותית.
טבלה 1: ת 'עבור דיווח אופרון לוקסאה, ההשוואה מדלקת הלגיונלה של בקרות חיוביות ושליליות. Z 'מתאים נקודות נתונים שניתן לראות בתרשים 2A, 2B. טבלה זו יש הבדל בין צ'יארבאליו וקירבי 2014. 4 Z הארה החיובי "> 0.25 מודגשים עם דמויות צהובות על רקע שחור.
טבלה 2: Z 'עבור mNeptune2-עיתונאי, זיהום הלגיונלה - השוואה של בקרות חיוביות ושליליות. Z 'מתאים נקודות נתונים המוצגות באיור 2C, 2D. Z קרינה החיובי mNeptune2 '> 0.25 מודגשים עם דמויות אדומות.
טבלה 3: Z 'עבור tdTomato-עיתונאי, זיהום הלגיונלה - השוואה של בקרות חיוביות ושליליות. Z קרינת tdTomato החיובי "> 0.25 מודגשים עם דמויות אדומות. Z החיובי הכוזב '> 0.25 הקשורים חפיפה של Sytox גרין ופליטת tdTomato מודגש עם תווים ירוקים.
איור 1: ייצוג בתמונות של התקנת assay כפול כתב. (א) replating של תאי J774A.1 גדלי השעיה לתוך מנות 384 גם. (ב) תוספת של תרכובות של עניין microplates. (ג) זיהום בנוסף סימולטני של צבעי קושרי חומצות גרעין; דְגִירָה; ו readout. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של תאנה זו יור.
איור 2: Dual, readout בזמן אמת של התפתחות חיידקים תאיים cytotoxicity איקריוטיים בפורמט תפוקה גבוהה. מקבילי הארה (א) ו פלואורסצנטי (ב ') אותות במהלך הדבקה תאית של תאי J774A.1 עם pneumophila הלגיונלה להביע אופרון לוקס. מקביל חלבון פלואורסצנטי (C) ניאון אותות (ד) במהלך הדבקה תאית של תאי J774A.1 עם mNeptune2 להביע pneumophila הלגיונלה. ארבעה טיפולים מוצגים: שליטת DMSO שלילית ( 
); שליטה cytotoxicity חיובית, saponin ( 
); ובקרות עיכוב התפתחות חיידקים, azithromycin חיוביות (tion 4 "src =" / files / ftp_upload / 54,841 / 54841eq4.jpg "/>) ו levofloxacin ( 
). נקודות הנתונים מייצגים סטייה ממוצעת ורמת 96 משכפל ביצע בשני עותקים, 384 גם הצלחות. הערה, ברי שגיאת סטיית התקן עבור נקודות נתונים מסוימות היו מזערית ולכן החבוי סימני נקודת נתונים. לוחות A ו- B שונו מן צ'יארבאליו וקירבי 2014. 4 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: דוגמאות מייצגות של חד ממדית, מבחני מנת תגובה. תאי J774A.1 נדבקו אופרון להביע לוקס, pneumophila ל ומטופל עם סדרת דילול כפולה של antimicrobials המצוין (labeled כמו 'תאי'). במקביל, אופרון להביע לוקס, הלגיונלה דולל לאותו ריכוז סופי במדיום תמצית שמרי אסים (AYE) ומטופלים עם סדרת דילול זהה, כפולה (שכותרתו 'axenic'). הארה הוקראה ימים שלאחר חיידקי חיסון זממה לעומת ריכוז מיקרוביאלית. לוח א 'כולל antimicrobials נפוץ לטיפול בזיהום הלגיונלה. לוח ב 'משווה פעילות של אנטיביוטיקה macrolide שונים. לוח C כוללת מספר סוגים שונים של antimicrobials עם משתנה לעתים מנוגדים תאי עצמת axenic. נקודות נתונים מייצגות את הממוצעים וסטיות התקן של שלוש בארות נפרדות לכל מצב. נתון זה יש הבדל בין צ'יארבאליו וקירבי 2015. 6 אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה.
איור 4: דוגמה של ניסוי כפול ההודעה, מנה-תגובה לקביעת 50 IC, CC 50 סלקטיביות. אפקטים של דוקסיציקלין על cytotoxicity תא צמיחת J774A.1 התאי נקבעו על 1 ימים ו -2 לאחר פגיעה. נקודות נתונים מייצגות את הממוצעים וסטיות התקן של שלוש בארות נפרדות לכל מצב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: דוגמה של מבחני סינרגיה דו מימדי. דיל סדר קומבינטוריתutions זוגות antimicrobials נבדק לסינרגיה מפני צמיחה תאית של הלגיונלה מקרופאגים J774A.1. קווי Isocontours להתחבר נקודות של עיכוב אחוז דומה. Isobologram ימני מתחבר שילובים עם עיכוב צמיחה תאי מלא (> הפחתת הארה 99% בהשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה) ומתאים לעלילת isobologram הסטנדרטית. הצללת מסמלת עיכוב אחוז כפי שמסומן המפתח בצבעים בכל גרף. Isocontours משמאל לימין מתאים 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, ו -1% ביחס לצמיחה לבקרות מטופל. נתון זה יש הבדל בין צ'יארבאליו וקירבי 2015. 6 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים מבחנים בזמן אמת עבור זיהוי סימולטני של התפתחות חיידקים תאית cytotoxicity תא מארח. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור ביצועים assay חזקים, חייבת להיעשות הפרדה ספקטרלי מספיק בין readouts חיידקים cytotoxicity. הפרדה כזו היא חלק מובנה עבור שילובים של כתבים אופרון בלוציפראז וצבעים-DNA מחייבת ניאון. עם זאת, על סמך הניסיון שלנו (לוח 1-3, איור 2), השימוש כפול, הודעת פלורסנט דורשת אותות ניאון שאינם חופפים (למשל, שימוש עיתונאי חלבון מרחיקות אדום ניאון ואת כתם חומצות גרעין ירוק) כדי להשיג חזק, נתונים מבוססי פתרון. יתר על כן, מהניסיון קודם, הקשורים באופן פוטנציאלי לאופטיקה קורא זמינה או שהעדפות קרינת פתרון, רק כתמי DNA עם פליטה ירוקה או כתום נתנו נתוני cytotoxicity שמישים, כלומר, Z 'גדולים מ> 0.5, מדד מעיד stronביצועי assay גרם. 4 לכן, פתרון מבוסס, מבחני כפול הודעה מוגבלים במקצת מבחינת מה שעיתונאים יכולים לשמש.
עוד צעד קריטי הוא היחס בין הדבקה לחיידקים מקרופאגים. זיהום חיידקי גורם למוות התא המארח. לכן, מופרזת הבידוד עלול להוביל למוות התא המארח מוקדם, רמות נמוכות יחסית של שכפול חיידקים, ואת ערפול פוטנציאל של השפעות ציטוטוקסיות ישירה של antimicrobials הנחקרת. יחס המדביק המתאים ניתן לקבוע באופן אמפירי יכול להיות תלוי ארסי של זן חיידקים המסוים נחקר. יחס נמוך של כ 1: 1 הוא נקודת התחלה טובה. ניסויים כמו אלה שמוצגים באיור 2 ובלוחות 1 - 3 בצעו עם יחסי זיהום מספר ייאפשרו הערכה ואופטימיזציה של תנאים לשימוש מבחני עתיד. מן ראוי לציין כי עבור הלגיונלה בפרט, שימוש רקע מתח עם NATively cytotoxicity תא מארח הנמוך (מוטצית flagellin) 8 תרם משמעותי לחוסנו assay הגבוה שהושג. יתר על כן, תרגום של הטכניקה הכפולה הודעה כדי תאיים אחרים, הפתוגן-מארח מערכות עשויות גם לדרוש התאמות נוספות פרוטוקול הזיהום. הלגיונלה אינו גדל במדיום בתרבית רקמה, מה שמאפשר לנו לייחס אות כתב עלתה ל צמיחה תאית לבד. עם זאת, רבים פתוגנים תאיים (למשל, Brucella) יכול לגדול ובמידות משתנות הן intracellularly ואת במדיום בתרבית רקמה. לכן, צעדים נוספים כגון טיפול גנטמיצין ושטיפה של תאי מארחים לאחר הדבקה ראשונית עשויים להיות נחוצים כדי להפחית שכפול תאים ולאפשר שבחירה סלקטיבית של קיבולת שכפול תאיים. 22
מדרוג כלפי מעלה Assay לשימוש בדיקות סינון וסינרגיה תפוקה גבוהה קשורה עם סט של אתגרים משלו. רוב מסויםly, מצאו כי המספר הגדול של תאי J774A.1 צורך טוב ביותר יכול להיות מתורבת ב חיידקים ולא צלוחיות בתרבית רקמה מסורתיות (ראה איור 1). עם זאת, כדי לשמור על סטריליות תרבות, קצף ספוג או כמוסות מסנן אחרות עבור צלוחיות אלה נמצאו עדיף כמוסות בקבוק חיידקים סטנדרטיות. המיקום של פלטפורמה שייקר מסלולית קטן בתוך חממה בתרבית רקמה התקן המותר לנו לבצע תרבות מדרוג כלפי מעלה עם ציוד על היד. לבסוף, שימוש במערכות מחלק אוטומטי (איורים 1 א ', ב') הקל מאוד התקנת assay ובדיקה של סדרת דילול קומבינטורית.
יש לציין, זיהוי נאה של שכפול חיידקים מסתמך על היכולת לבטא מספיק אחת מעמד אופרון לוקס או חלבון פלואורסצנטי זן החיידקים של עניין. לשם כך, יצרנו קבוצה של transposons כתב ניאון ולוקס אופרון מונע על ידי אמרגן מכונן חזק כי צריך לאפשר faCile סימון של סוגים שונים של חיידקים (קאנג קירבי, מידע לא מוצג). לחלופין, עבור פתוגנים אשר שכפול תאיים מוכיח ציטוטוקסיות עבור התא המארח, מדידות cytotoxicity בזמן אמת לבדו יכול לשמש כתחליף שכפול תאיים. עם זאת, במקרה זה, תרכובות ציטוטוקסיות פעילות לא ניתן להבחין באופן מהימן ב assay אחד.
הזמינות של readout בזמן אמת מתוך מספק יתרון חשוב במיוחד מבחני תפוקה גבוהה ההקרנה. באופן ספציפי, הימנעות הערכת נקודת סיום של התפתחות חיידקים (קביעת יחידת מושבה להרכיב) 7 ו cytotoxicity (תוספת של מגיב כדאיויות תא בסיום הטיפול של assay) 23,24 מבטלת כמה צעדים ניסיוניים עבודה קשורה. יתר על כן, קורסי זמן יכולים להיות אחריו בקלות באותה בארות assay עם גידול מזערי במאמץ הניסיון. חשוב לציין, הזמין של שני סוגים שונים של כתבים שכפולים חיידקים (חיידקיםl לוקס אופרון ו חלבון פלואורסצנטי) יש משמעות מיוחדת לפיתוח assay תפוקה גבוהה ההקרנה. באופן ספציפי, הודעה מיקרוביאלית חיובית כוזבת וכתוצאה מהתערבות מזויפת עם אופרון לוקס או פלט כתב ניאון ניתן לטפל באמצעות שימוש בשני לכתבים ברצף מבחני מאונך השלים הקרנה ראשית ומשנית, בהתאמה 25. יש לציין, מצאנו כי אופרון לוקס החיידקים היה הכתב רגיש יותר של התפתחות חיידקים עם בערך פי 20 עד פי 100 גבולות גילוי נמוכים יותר כתבי החלבון פלואורסצנטי שלנו. עם זאת, פלט לוקס כפוף סביר חיוביים שגויים יותר מבוסס על מוצרים גן כמה צעדים הנדרשים תפוקת אור. 26 ליתר דיוק, בניגוד לכתבים בלוציפראז הגן יחידים איקריוטיים, אופרון לוקס החיידקים הוא מקבץ של חמישה גנים מקודדים הוא אנזים בלוציפראז דו רכיבים וגנים לסינתזה אנדוגני של מצע בלוציפראז. זה היההגיוני ולכן להשתמש הכתב מפעיל לוקס בתוך מסך ראשי כדי להבטיח רגישות מספקת, וכתבי חלבון פלואורסצנטי מבחני משנה לדאוג סגוליים.
יחדיו, המתודולוגיה המתוארת מספקת חלופות בזמן אמת, שאינן הרסניות נקודות קצה מבחנים למדידה שכפולות חיידקי cytotoxicity איקריוטיים ולכן מייצג פשוט מתודולוגי ושיטת צדדי להערכת השפעות מיקרוביאלית על פתוגנים תאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר דיווח בכתב היד הזה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר פרסי R01AI099122 כדי JEK התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי בְּרִיאוּת. ברצוננו להודות ג'ניפר סמית, הדוד וורובל, סו צ'יאנג, דאג מבול, שון ג'ונסטון, ג'ניפר רציונל, סטיוארט רודניצקי, פול יאן, ריצ'רד סיו, ורחל וורדן ממתקן הקרנת ICCB-Longwood ו / או מעבדת ההקרנה הארצית המרכזים האזוריים של ניו אינגלנד מצוינת להגנה מפני טרור ביולוגי ומתפתחים מחלות זיהומיות (נתמכות על ידי U54AI057159) על עזרת פיתוח וביצוע מבחני תפוקה גבוהה הקרנה. כמו כן, אנו רוצים להודות קנת פ סמית על הערות מועילות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J774A.1 cells | American Type Culture Collection | TIB-67 | Host cell |
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Yeast extract, ultrafiltered | Becton-Dickinson/Difco | 210929 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors |
| Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt | Sigma-Aldrich | K2000 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Potassium phosphate, dibasic | Thermo Fisher Scientific | P288-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7755 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Ammonium iron(III) citrate | Sigma-Aldrich | F5879 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately |
| Potassium hydroxide solution, concentrated | Thermo Fisher Scientific | SP236-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Deonized water | N/A | N/A | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Thymidine (tissue culture grade) | Sigma-Aldrich | T1895 | For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640 |
| RPMI 1640, standard formulation | Corning via Thermo Fisher Scientific | 10-040-CV | For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine |
| RPMI 1640 lacking phenol red | Corning via Thermo Fisher Scientific | 17-105-CV | For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use |
| L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) | HyClone via Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration |
| Iron-supplemented calf serum | Gemini Bioproducts | 100-510 | For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density |
| SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S7020 | For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration. |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-255-26 | For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead) |
| Orbital shaker | BellCo Glass | 7744-01010 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately) |
| Shaker flasks (250 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-04 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (250 ml) | BellCo Glass | 7744-16250 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker flasks (1,000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-07 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (1,000 ml) | BellCo Glass | 7744-16100 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-1490-038 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps |
| MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes |
| Combi standard bore manifold | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl |
| White 384 well dishes treated for tissue culture | Corning | 3570 | For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully |
| DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving positive control and test compounds |
| Azithromycin | Sigma-Aldrich | PHR1088 | Antibiotic positive control |
| Saponin (from Quillaja bark) | Sigma-Aldrich | S-4521 | Cytoxicity positive control |
| Multichannel pipettor | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette | For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing |
| Epson pin transfer robot | Epson/ICCB-L | (Custom equipment) | For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays |
| D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | D300 | For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl |
| T8+ cartridges for D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | T8+ | For dispensing test compounds |
| Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera | Nikon | Ti | For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution |
| Glass-bottom tissue culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope. These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms. |
| Photoshop CS6 | Adobe | Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images. | |
| Mathematica 10 | Wolfam | For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms. |
References
- Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
- Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
- Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones? Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
- Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
- Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
- Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).
- Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
- Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
- Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
- Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
- Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457 (2014).
- Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
- Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).
