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Immunology and Infection

उच्च throughput, वास्तविक समय, intracellular रोगाणुरोधी गतिविधि के दोहरे readout परीक्षण और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity

Published: November 16, 2016 doi: 10.3791/54841
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center

Abstract

intracellular रोगाणुरोधी गतिविधि और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity के पारंपरिक उपायों समापन बिंदु assays पर भरोसा करते हैं। इस तरह के समापन बिंदु assays कई अतिरिक्त प्रयोगात्मक readout करने से पहले ऐसी सेल, कॉलोनी बनाने इकाई दृढ़ संकल्प, या अभिकर्मक अतिरिक्त के रूप में कदम है, आवश्यकता होती है। जब assays के हजारों प्रदर्शन, उदाहरण के लिए, उच्च throughput स्क्रीनिंग के दौरान, नीचे की ओर assays के इन प्रकार के लिए आवश्यक प्रयास काफी है। इसलिए, उच्च throughput रोगाणुरोधी खोज की सुविधा के लिए, हम एक वास्तविक समय परख एक साथ intracellular बैक्टीरिया विकास के अवरोधकों की पहचान करने और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity आकलन करने के लिए विकसित की है। विशेष रूप से, वास्तविक समय intracellular बैक्टीरिया विकास का पता लगाने के लिए या तो एक जीवाणु लक्स ओपेरोन (1 सेंट पीढ़ी परख) या फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं (2 एन डी पीढ़ी, orthogonal परख) के साथ बैक्टीरियल स्क्रीनिंग उपभेदों अंकन रूप से सक्षम किया गया था। एक गैर विषैले, कोशिका झिल्ली-impermeant, न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाईयह भी मैक्रोफेज के आरंभिक संक्रमण के दौरान जोड़ा गया है। इन रंगों व्यवहार्य कोशिकाओं से बाहर रखा गया है। हालांकि, अलाभकारी मेजबान कोशिकाओं की झिल्ली अखंडता प्रवेश और परमाणु डीएनए के फ्लोरोसेंट लेबलिंग (deoxyribonucleic एसिड) की अनुमति देने खो देते हैं। विशेष रूप से, डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोसेंट क्वांटम उपज है कि मेजबान कोशिका मृत्यु का एक समाधान आधारित readout प्रदान करता है में एक बड़ी वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है। हम इस संयुक्त परख का इस्तेमाल किया है microplate प्रारूप में एक उच्च throughput स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए, और माइक्रोस्कोपी द्वारा intracellular विकास और cytotoxicity आकलन करने के लिए। विशेष रूप से, antimicrobials तालमेल जिसमें दो या अधिक antimicrobials के संयुक्त प्रभाव जब एक साथ लागू किया जब अलग से लागू की तुलना में अधिक है प्रदर्शन कर सकते हैं। Intracellular रोगजनकों के खिलाफ इन विट्रो तालमेल के लिए परीक्षण सामान्य रूप से एक विलक्षण कार्य के रूप में अलग अलग मात्रा में एंटीबायोटिक दवाओं के मिश्रित क्रमपरिवर्तन का आकलन किया जाना चाहिए। हालांकि, हमने पाया है कि हमारे वास्तविक समय परख स्वचालित, डिजिटल वितरण प्रौद्योगिकी पी के साथ संयुक्तसतही तालमेल परीक्षण ermitted। इन तरीकों का उपयोग करना, हम व्यवस्थित intracellular रोगज़नक़, लीजोनेला pneumophila के खिलाफ अकेले antimicrobials की एक बड़ी संख्या की कार्रवाई और संयोजन में सर्वेक्षण करने में सक्षम थे।

Introduction

रोगज़नक़ों कि बढ़ने या intracellular डिब्बों में अस्थाई रूप से निवास कर उपचारात्मक उन्मूलन के लिए मुश्किल हो जाता है। लाचार या अपेक्षाकृत ऐसी लीजोनेला pneumophila, Coxiella burnetii, ब्रूसिला एसपीपी के रूप में intracellular रोगजनकों लाचार। , Francisella tularensis, और माइकोबैक्टीरियम एसपीपी। अक्सर इलाज है कि महीने के लिए भी साल से लेकर कर सकते हैं के लिए लंबे समय तक रोगाणुरोधी चिकित्सा के पाठ्यक्रम की आवश्यकता। इसके अलावा, बाह्य रोगजनकों क्षणिक intracellular आलों पर कब्जा कर सकते हैं और इस तरह से रोगाणुरोधी चिकित्सा के सामान्य पाठ्यक्रम से क्लीयरेंस बचने के लिए और बाद में उग्र संक्रमण के नए दौर शुरू करने के लिए उभरेगा। स्ताफ्य्लोकोच्चुस 1 और uropathogenic Enterobacteriaceae 2,3 के संक्रमण तेजी से मान्यता प्राप्त दो उदाहरण हैं। इसलिए, एक मौलिक दवाओं की खोज के लक्ष्य उपन्यास antimicrobials कि intracellular डिब्बों में घुसना की पहचान है। इष्टतम चिकित्सा जल्दी से उन्मूलन करने के लिएintracellular जीवों और उप निरोधात्मक रोगाणुरोधी प्रतिरोध के माध्यम से जोखिम के विकास को रोकने के लिए विशेष रूप से वांछनीय है।

यह अंत करने के लिए, हम मॉडल रोगज़नक़, लीजोनेला pneumophila के intracellular वृद्धि का लक्ष्य रखा intracellular-व्याप्ति antimicrobials पहचान करने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीनिंग तकनीक विकसित की है। 4 पिछला नैदानिक टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि मानक रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण सही इस जीव के खिलाफ विवो चिकित्सीय प्रभावकारिता में भविष्यवाणी नहीं था। 5 विशेष रूप से, इस वजह से इस तरह के β लाक्टाम्स और aminoglycosides रूप antimicrobials के प्रमुख वर्गों, हालांकि axenically उगाया लीजोनेला के खिलाफ अत्यधिक प्रभावी, पर्याप्त intracellular डिब्बों जहां लीजोनेला रहता में घुसना नहीं है। 5,6 बाद में सबूत सुझाव दिया है कि तकनीकी रूप से और अधिक जटिल intracellular विकास assays प्रभावी रूप से नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी की। 7

इसलिए, हम intracellular बैक्टीरिया विकास की वास्तविक समय निर्धारण के लिए प्रौद्योगिकी विकसित की है। 6 यह जीवाणु गुणसूत्र में 9 संवाददाताओं (दूसरी पीढ़ी, orthogonal परख, यहाँ वर्णित) या तो एक जीवाणु luciferase operon 8 के एकीकरण के माध्यम से संशोधित एक जीवाणु तनाव के उपयोग के माध्यम से पूरा किया गया (पहली पीढ़ी परख पहले से वर्णित,) 4 या फ्लोरोसेंट प्रोटीन। इस तरह, luminescent या फ्लोरोसेंट संकेत एक सरोगेट, वास्तविक समय बैक्टीरियल नंबर के readout प्रदान करता है।

हालांकि, इन विशेषताओं intracellular infectio में एक प्रमुख confounder का पता नहींn assays, मेजबान कोशिकाओं पर बंद लक्ष्य प्रभाव। विशेष रूप से, मेजबान सेल की मौत स्वाभाविक intracellular विकास को सीमित करता है और रोगाणुरोधी प्रभाव की झूठी सकारात्मक पहचान के लिए होता है। स्क्रीनिंग के पुस्तकालयों के रूप में कई यौगिकों यूकेरियोटिक सेल विषाक्त, इस तरह की झूठी सकारात्मक सच antimicrobials डूब जाएगा, अनुवर्ती, समाधान के लिए समापन बिंदु cytotoxicity assays की एक बड़ी संख्या की जरूरत महसूस कर रहे हैं।

इस प्रकार, यह बहुत रुचि के साथ ही साथ यूकेरियोटिक सेल व्यवहार्यता और intracellular विकास का आकलन करने में सक्षम हो। विशेष रूप से, अलाभकारी कोशिकाओं की एक विशेषता कोशिका झिल्ली अखंडता का नुकसान हुआ है। जांच जो कोशिका झिल्ली की पारगम्यता परीक्षण इसलिए सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम पहले से पहुँच सकते हैं और मृत कोशिकाओं के परमाणु डीएनए दाग कथित कोशिका झिल्ली-impermeant, फ्लोरोसेंट, डीएनए बाध्यकारी रंगों की एक श्रृंखला की क्षमता होती है। 4 परमाणु डीएनए बाध्यकारी पर, इन रंगों quantu में एक बड़ी वृद्धि प्रदर्शितएम फ्लोरोसेंट उपज पृष्ठभूमि समाधान प्रतिदीप्ति से अधिक बढ़ संकेत हो जाती है। जैसे, इन रंगों यूकेरियोटिक कोशिका मृत्यु का एक मात्रात्मक readout प्रदान की है। 4 विशेष रूप से, हमने पाया कि कई J774 मैक्रोफेज के साथ लंबे समय तक सह ऊष्मायन के दौरान गैर विषैले स्वयं थे। जब आरंभिक संक्रमण के दौरान कहा, वे एक वास्तविक समय, यूकेरियोटिक कोशिका मृत्यु के फ्लोरोसेंट readout कि एक microplate fluorimeter से मापा जा सकता है या मनाया microscopically प्रदान की है।

इसलिए, एक जीवाणु पत्रकार और गैर विषैले, झिल्ली impermeant के उपयोग के संयोजन से, डीएनए बाध्यकारी रंजक, हम एक सरल, गैर विनाशकारी, वास्तविक समय दोनों बैक्टीरियल लोड और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity एक साथ मापने के लिए परख विकसित करने में सक्षम थे। इस परख हमें 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में के intracellular विकास को बाधित करने की क्षमता के लिए जाना जाता है ~ 10,000 bioactives 250 antimicrobials और कार्यात्मक uncharacterized गतिविधि के साथ> 240,000 छोटे अणुओं स्क्रीन करने सहित ~ अनुमति दी गई हैलीजोनेला pneumophila, जबकि एक ही समय में प्रत्येक परिसर के लिए यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity डेटा पैदा होता है। 6 लीजोनेला के intracellular वृद्धि के खिलाफ जाना जाता antimicrobials के हमारे विश्लेषण तिथि करने के लिए इस प्रकार का सबसे व्यापक अन्वेषण था। 6

हमारे परख प्रारूप की दक्षता के आधार पर, हम भी बाद में जाना जाता antimicrobials के संभावित synergistic प्रभाव जब संयोजन में इस्तेमाल का पता लगाया। सबसे आम तालमेल परीक्षणों में से एक है, तथाकथित बिसात परख, standardly दो या अधिक antimicrobials की दो गुना धारावाहिक dilutions का मिश्रित प्रभाव का आकलन करने के द्वारा किया जाता है। 10 इन assays में तालमेल अधिक से अधिक प्रभाव के अवलोकन से परिभाषित किया गया जब दो या अधिक antimicrobials प्रत्येक के प्रभाव को अलग से लागू की राशि से एक साथ लागू कर रहे है। ध्यान से, पहले, केवल केंद्रित है और चयनात्मक तालमेल परीक्षण intracellular लीजोनेला pneumophila के खिलाफ प्रदर्शन किया गया था

तालमेल के परीक्षण की सुविधा के लिए, हम स्वचालित डिजिटल वितरण प्रौद्योगिकी 6 के साथ संयोजन में हमारी वास्तविक समय intracellular विकास / यूकेरियोटिक cytotoxicity परख का इस्तेमाल किया। यह स्वचालन DMSO या जलीय समाधान अकेले या 384 अच्छी तरह प्रारूप में संयोजन में में भंग यौगिकों के धारावाहिक dilutions बांटना करने के लिए हमें की अनुमति दी। 11 इसके अलावा, इस तरह के मजबूत तरल से निपटने प्रौद्योगिकी हमें की अनुमति दी आसानी से उच्च संकल्प प्रदर्शन करने के लिए, वर्ग-जड़-ऑफ-दो (बल्कि मानक की तुलना में, कम संकल्प, दोहरीकरण) कमजोर पड़ने संयोजन हमारे दो आयामी में विशिष्टता के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए, बिसात तालमेल विश्लेषण। यह संकल्प reproducibility के बारे में तालमेल क्षेत्र में चिंताओं के समाधान में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला 12 का उपयोग कर रहा था। अन्त में, हमारे परख मात्रात्मक और भी वहाँ थाefore निषेध की ग्रेडेशन मापा। नतीजतन, परख निरोधात्मक जानकारी की सम्पूर्णता, isocontour isobolograms में व्यक्त जिसमें isocontours विकास निषेध के समान स्तर के साथ मिश्रित सांद्रता कनेक्ट कब्जा कर लिया। 6 यह साजिश रचने रणनीति की अनुमति दी मिश्रित खुराक प्रतिक्रिया घटता के दृश्य। हमारे कार्यप्रणाली का उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, हम इन assays के प्रदर्शन के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन है और प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं।

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Protocol

1. रीयल टाइम Intracellular विकास और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity परख

  1. तैयारी मेजबान कोशिकाओं (J774A.1 प्रकोष्ठों)
    1. संस्कृति J774A.1 मस मस्कुलस बृहतभक्षककोशिका की तरह 9% लोहे के पूरक बछड़ा सीरम के साथ RPMI 1640 में निलंबन में कोशिकाओं। प्रारंभ में टिशू कल्चर बोतल में पारित होने के। बाद कोशिकाओं माध्यम के 15 मिलीलीटर में एक 75 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में मिला हुआ हो गए हैं, मध्यम के एक ही प्रकार, जिनमें से 15 मिलीलीटर टिशू कल्चर फ्लास्क में लौट रहा है और 50 मिलीलीटर स्थानांतरित कर रहा है के साथ 65 मिलीलीटर के लिए स्क्रैप और कमजोर पड़ने से विभाजित एक 250 मिलीलीटर बैक्टीरियल प्रकार के बरतन फ्लास्क।
    2. 250 मिलीलीटर और / या 1000 मिलीलीटर बैक्टीरियल टिशू कल्चर माध्यम के साथ पांचवें मात्रा से भरा बोतल में बड़े पैमाने अप, निलंबन में संस्कृति के लिए। प्रति मिनट लगभग 120 क्रांतियों में रोटेशन की गति की स्थापना करके Aerate। लगातार विकास के लिए, वास्तव में 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. हार्वेस्ट कोशिकाओं जब वे सीमा में घनत्व तक पहुँचने 2.5 x 10 6 कोशिकाओं/ 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल मिलीलीटर। मृत सेल प्रतिशत (सबसे आसानी से trypan नीले रंग धुंधला द्वारा यत्न) सुनिश्चित करें 25% से अधिक नहीं है, के रूप में मृत कोशिकाओं cytotoxicity assays में पृष्ठभूमि शोर में वृद्धि होगी।
    4. सफेद में प्लेट, टिशू कल्चर का इलाज, 384 अच्छी तरह से microplates अच्छी तरह से प्रति 30 μl टिशू कल्चर माध्यम में 5 एक्स 10 4 J774A.1 कोशिकाओं पर। microplates प्रयोग के दिन पर 90% संगम को प्राप्त करने के लिए रातोंरात सेते हैं।
  2. Luminescent या फ्लोरोसेंट लीजोनेला pneumophila तैयारी
    1. पैसेज एल pneumophila (Lp02 :: :: flaA लक्स 8) उचित माध्यम पर बैक्टीरिया, यानी, बफर का कोयला खमीर निकालने (BCYE) मध्यम। एक thymidine auxotrophic तनाव का उपयोग करते हैं, तो 100 माइक्रोग्राम / एमएल thymidine के साथ मध्यम पूरक। एक नए BCYE प्लेट पर घनी जीवों फैल रहा है और (जमे हुए स्टॉक से अगर) (पिछले प्लेट पारित होने से यदि) एक दिन incubating या दो से तीन दिन मिला हुआ द्वारा प्राप्त करने के लिए प्रयोगों के लिए बैक्टीरिया के धब्बे तैयारविकास।
      1. 10 ग्राम खमीर निकालने, 10 ग्राम एन भंग द्वारा BCYE प्लेटों की तैयारी - (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic एसिड, 0.35 छ कश्मीर 2 HPO 4, और विआयनीकृत पानी 950 मिलीलीटर में 1 ग्राम अकेले आधार पोटेशियम α-ketoglutarate। पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (11.9 दाढ़ समाधान के ≥2.5 एमएल) के साथ 6.9 पीएच को समायोजित करें।
      2. 15 ग्राम अगर और 2 जी सक्रिय लकड़ी का कोयला जोड़ें; और 1 एल अंतिम मात्रा लाने के लिए। एक चुंबकीय हलचल बार और आटोक्लेव जोड़ें। 55 डिग्री सेल्सियस के लिए कूल मध्यम और जोड़ने फिल्टर निष्फल युक्त 0.4 जी एल सिस्टीन और 0.42 ग्राम अमोनियम लोहा (तृतीय) साइट्रेट विआयनीकृत पानी में भंग समाधान। पेट्री प्लेटों डालने का कार्य करने से पहले मिश्रण करने के लिए चुंबक हलचल प्लेट का प्रयोग करें।
      3. Axenic मध्यम विकास में एल pneumophila विकास के परीक्षण के लिए, लकड़ी का कोयला के अलावा BCYE के लिए इस्तेमाल सभी रासायनिक अभिकर्मकों के संयोजन से इक्के-खमीर निकालने शोरबा (ऐ) तैयार करने और अगर। फ़िल्टर बाँझ और तुरंत उपयोग करें, या बाद में प्रयोगों के लिए फ्रीज।
    2. SA में Resuspend जीवोंमेरे ऊतक संस्कृति के माध्यम से उचित रूप में 100 माइक्रोग्राम / एमएल thymidine पूरकता के साथ J774A.1 कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया।
  3. macrophage संक्रमण
    1. ब्याज की कसौटी पर यौगिकों (स्क्रीनिंग यौगिकों, और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण बैक्टीरिया विकास निषेध और यूकेरियोटिक सेल के लिए) जोड़ें। अधिमानतः, वाहन के लिए पर्याप्त कमजोर पड़ने अनुमति देने के लिए DMSO (डाइमिथाइल sulfoxide) या एक जलीय घोल में ≥500x पर स्टॉक समाधान भंग।
      1. हालांकि शेयर समाधान जमे हुए संग्रहित किया जा सकता है, अस्थिर यौगिकों और antimicrobials के लिए फ्रीज पिघलना चक्र से बचें।
    2. 2.5 x 10 6 CFU (कॉलोनी बनाने इकाई) / मी और फ्लोरोसेंट संवाददाता लेबल बैक्टीरिया 1.0 10 x 7 CFU / टिशू कल्चर माध्यम में मिलीलीटर की लक्ष्य और उचित गैर विषैले, झिल्ली impermeant, न्यूक्लिक एसिड जोड़ने की luminescent बैक्टीरिया पतला 2.5x अंतिम परख एकाग्रता में डाई बाध्यकारी।
    3. अच्छी तरह से प्रत्येक J774A.1 संस्कृति के मिश्रण के 20 μl जोड़ें, अंतिम परख मात्रा50 μl, अंतिम बैक्टीरियल एकाग्रता 1 एक्स 10 6 CFU / एमएल (लक्स ओपेरोन संवाददाता) या 4 x 10 10 6 CFU / एमएल (फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाता)।
    4. बाष्पीकरणीय बढ़त प्रभाव को रोकने के लिए सापेक्ष आर्द्रता 5% में 1-3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते सीओ 2 100% पर।
  4. परख पढ़ा गया
    1. बैक्टीरिया विकास और एक microplate luminometer और पत्रकारों के लिए उचित रूप fluorimeter पर यूकेरियोटिक सेल विषाक्तता पढ़ें इस्तेमाल किया जा रहा है।
      1. तापमान जुड़े बढ़त प्रभाव से बचने के लिए, thermally microplates luminescence पढ़ने से पहले प्लेसमेंट के द्वारा एक परत में एक प्रयोगशाला बेंच पर पलकों के साथ लगभग 20 मिनट के लिए अधखुला (या लगभग 10 मिनट के लिए पलकों के साथ एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट बंद में) संतुलित करना।
    2. लौटें microplates अगर बाद में समय बिंदुओं पर वास्तविक समय readout वांछित है इनक्यूबेटर करने के लिए।

2. डेटा विश्लेषण

  1. सकारात्मक और नकारात्मक चुनाव के लिए डेटा मानकtrols intracellular बैक्टीरिया विकास और कोशिकाओं के लिए प्रतिशत cytotoxicity के लिए प्रतिशत या गुना-निषेध गणना करने के लिए।
  2. Μ पी एन μ | 3 (σ पी + σ एन) / - परख मजबूती का आकलन करने के लिए, Z कारक (जेड ') विश्लेषण जहां जेड' = 1 का उपयोग करते हुए दोनों बैक्टीरिया विकास के अवरोध और cytotoxicity के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के बीच सांख्यिकीय जुदाई की गणना |। इस समीकरण, σ पी में और σ n सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं, क्रमशः के लिए मानक विचलन कर रहे हैं; μ पी और μ n सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए मतलब मूल्यों, क्रमशः रहे हैं।
    1. उच्च throughput स्क्रीनिंग assays के लिए, ब्याज की कसौटी पर यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए मानक जेड स्कोर (या अन्य वैकल्पिक, मात्रात्मक सांख्यिकीय माप) की गणना। वैकल्पिक रूप से, एक सरल गुना कमी की गणना या लॉग गुना एक संभावित physiologically अधिक प्रासंगिक के रूप में कमी ज्यामितीय नकल बैक्टीरिया के लिए प्रभाव परिमाण के उपाय।

3. एकल और बहु-आयामी (यानी, सिनर्जी) खुराक-प्रतिक्रिया परीक्षण और डाटा इंटरप्रिटेशन

  1. प्रोटोकॉल धारा 1 में वर्णित के रूप में मैक्रोफेज और बैक्टीरिया तैयार करें।
  2. बस संक्रमण या axenic ऊष्मायन से पहले, एक एकाग्रता है कि पूरी तरह से विकास समाप्त उच्च अंत पर एक धारावाहिक में प्रयोगात्मक ब्याज की antimicrobials जोड़ने के लिए, कमजोर पड़ने श्रृंखला दोहरीकरण, फैले के लक्ष्य के साथ (यानी, कम से कम निरोधात्मक एकाग्रता या एमआईसी) और कम पर एक एकाग्रता है कि कोई स्पष्ट गतिविधि से पता चलता खत्म होता है।
  3. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार रोगाणुरोधी dilutions की प्रत्यक्ष, स्वचालित अलावा के माध्यम से एकल खुराक-प्रतिक्रिया और मिश्रित तालमेल परीक्षण सेटअप की सुविधा के लिए एक स्वचालित तरल हैंडलिंग प्रणाली का प्रयोग करें।
  4. उदाहरण के लिए, उप दोहरीकरण dilutions के उपयोग पर विचार करें,841 / 54841eq1.jpg "/> - कमजोर पड़ने श्रृंखला गुना, और परख सटीकता और डेटा के reproducibility बढ़ाने के लिए दोहराता है।
  5. बृहतभक्षककोशिका संक्रमण के लिए, luminescent बैक्टीरिया टिशू कल्चर माध्यम में 2.5 x 10 6 CFU (कॉलोनी बनाने इकाई) / एमएल के लक्ष्य को पतला। प्रत्येक J774A.1 संस्कृति में अच्छी तरह से, अंतिम परख मात्रा 50 μl, अंतिम बैक्टीरियल एकाग्रता 1 एक्स 10 6 CFU / एमएल करने के मिश्रण के 20 μl जोड़ें; और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% में 100% सापेक्ष आर्द्रता में सीओ 2 सेते हैं।
    1. Axenic विकास के परीक्षण के लिए, 1 एक्स 10 6 CFU / ऐ माध्यम में मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए luminescent बैक्टीरिया पतला 384 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 μl जोड़ें और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 100% सापेक्ष आर्द्रता पर।
  6. रोगाणुरोधी संयोजन है कि बैक्टीरिया विकास को बाधित करने के लिए आंशिक अवरोध एकाग्रता सूचकांक की गणना। संयोजन में प्रत्येक दवा (ए, बी,।। एन) कि बैक्टीरियल जी का पूरा या> 99% निषेध में परिणाम के लिए'ए' अपने आप में एक एफआईसी = यौगिक की एकाग्रता 'ए' के कम से कम अवरोध एकाग्रता से विभाजित: rowth, व्यक्तिगत आंशिक निरोधात्मक एकाग्रता (एफआईसी ए, बी, एन।।।) की गणना इस प्रकार है। । एक ही फार्मूला का प्रयोग, गणना एफआईसी बी, आदि तो फिर मिश्रित एफआईसी सूचकांक की गणना या 2 समीकरण एफआईसी = एफआईसी ए + बी + एफआईसी। । प्रत्येक निरोधात्मक संयोजन के लिए .FIC एन।
    1. मिश्रित सूचकांक कि 1.0 से दूर भटक तालमेल का आकलन करने के लिए प्रयोग करें। एक synergistic प्रभाव की एक रूढ़िवादी संकेत और ≥4, एक विरोधी के प्रभाव के रूप में ≤0.5 की कटऑफ पर विचार करें। 12
    2. प्लॉट isobolograms, isocontour isobolograms, और / या isosurface 6 मिश्रित प्रभाव के रूप में वैकल्पिक चित्रमय अभ्यावेदन isobolograms।

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Representative Results

Microplate intracellular विकास परख

चित्रा 1 परख कदम चित्र। दिखाए स्वचालित कदम मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है। हालांकि, throughput बहुत तरल से निपटने सिस्टम का उपयोग कर मदद की है।

चित्रा 2 एक 384 अच्छी तरह से microplate, दोहरे readout, वास्तविक समय intracellular विकास और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity परख एक लीजोनेला तनाव (Lp02) या तो एक लक्स ओपेरोन (आंकड़े 2A, 2 बी) या mNeptune2 फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ चिह्नित (का उपयोग करने से प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है चित्रा -2 सी, 2 डी) संवाददाता। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण यौगिकों (DMSO, एंटीबायोटिक दवाओं, सैपोनिन) प्लेटों के लिए एक पिन हस्तांतरण रोबोट के उपयोग के माध्यम से जोड़ा गया था एक उच्च throughput स्क्रीनिंग की स्थापना में प्रदर्शन अनुकरण। उल्लेखनीय लीजोनेला (आंकड़े 2A, 2 सी) mNeptune2 लेबल बैक्टीरिया के लिए luminescent बैक्टीरिया के लिए 24 से 72 घंटा और 48 से 72 घंटा पर सैपोनिन सेल और एंटीबायोटिक का इलाज नियंत्रण करने के लिए की तुलना में आसानी से प्रतिष्ठित क्रमश: हो सकता है। लीजोनेला आम तौर पर 48 से 72 घंटे के लिए नकल करने के बाद मेजबान कोशिकाओं lyses। यह आंकड़े 1 बी और 1 डी, जो समय के साथ Sytox ग्रीन (एक प्रतिनिधि, impermeant, न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाई और मेजबान कोशिका मृत्यु का मार्कर) की वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति शो में सराहना की जा सकती है। Cytotoxicity अंततः डिटर्जेंट (सैपोनिन) में मनाया अधिक से अधिक राशि, मेजबान सेल, सकारात्मक नियंत्रण पहुंचता है। mNeptune2 लेबल जीवों लक्स ओपेरोन लेबल बैक्टीरिया की तुलना में चार गुना अधिक है inoculum में जोड़ा गया था, संभावना और अधिक तेजी से मेजबान सेल की हत्या के लिए जिम्मेदार है और पहले जुड़े mNeptune2 प्रयोगों में प्रतिदीप्ति संकेत में वृद्धि। जैसी कि उम्मीद थी, प्रभावी रोगाणुरोधी उपचार (लिवोफ़्लॉक्सासिन या azithromycin) आखिरीदोनों बैक्टीरिया विकास और मेजबान सेल ented। इसके विपरीत, साइटोटोक्सिक यौगिकों कि मेजबान सेल के विनाश के माध्यम से intracellular विकास सीमित (जैसे, सैपोनिन) आसानी से कम luminescence या mNeptune2 प्रतिदीप्ति, और उच्च cytotoxicity जुड़े संकेत का एक संयोजन से पहचाना जा सकता है। इसके अलावा, दोनों luminescence और mNeptune2 प्रतिदीप्ति (बैक्टीरिया विकास) में संयुक्त कमी, और cytotoxicity के अवलोकन उचित विश्वास है कि एक यौगिक एक सच्चे intracellular विकास अवरोध करनेवाला है प्रदान की है (जैसे, azithromycin और लिवोफ़्लॉक्सासिन सकारात्मक नियंत्रण) के बजाय एक झूठी सकारात्मक के साथ नकली हस्तक्षेप से उत्पन्न से बैक्टीरियल संवाददाता संकेत।

टेबल 1 - 3 तीन अलग-अलग जीवाणु पत्रकारों के लिए प्रतिनिधि जेड '(लक्स ओपेरोन, mNeptune2, tdTomato) और इसी प्रतिदीप्ति रीडिंग नियंत्रण करने के लिए रिश्तेदार से पता चलता है। एक Z '> 0.5 एक STATISTICA इंगित करता हैउच्च throughput सेटिंग्स के लिए lly मजबूत परख उचित; हालांकि, कम जेड 'प्रयोगात्मक लक्ष्यों, यानी, मज़बूती से परीक्षण यौगिकों या perturbations के कम या ज्यादा सूक्ष्म प्रभाव भेद करने की क्षमता पर निर्भर करता है उपयुक्त हो सकता है। चित्रा 2 से परिणाम के आधार पर, mNeptune2 बैक्टीरियल luciferase operon के रूप में के रूप में संवेदनशील एक पत्रकार नहीं था। इसलिए, उम्मीद के रूप में, नकारात्मक में mNeptune2 संकेत के बीच एक मजबूत अंतर (DMSO) और सकारात्मक (लिवोफ़्लॉक्सासिन, azithromycin, सैपोनिन) विकास अवरोध नियंत्रण विपरीत, जब तक दिन 2 या दिन ऊष्मायन के 3 मनाया नहीं किया गया था करने के लिए जल्दी, लक्स का यथोचित मजबूत संकेत संक्रमण के बाद दिन 1 पर operon संवाददाता बैक्टीरिया। इसके विपरीत, tdTomato, एक वैकल्पिक बैक्टीरियल फ्लोरोसेंट संवाददाता, संक्रामक पाठ्यक्रम में सबऑप्टिमल जेड 'दिखाया। सबऑप्टिमल फ्लोरोसेंट प्रतिदीप्ति विशेषताओं उत्तेजना और रेंज में उत्सर्जन पूंछ tdTomato रों का इष्टतम readout के लिए इस्तेमाल के अतिक्रमण से हिस्से में हुईignal। (दो शर्तों के तहत बैक्टीरियल संख्या में एक महत्वपूर्ण अंतर है जिसका अर्थ है, जहां बैक्टीरिया को दोहराने नहीं होना चाहिए) यह अतिक्रमण सकारात्मक जेड 'tdTomato सैपोनिन लिवोफ़्लॉक्सासिन तुलना बनाम में पाया से सराहना की जा सकती है। यह परिणाम सैपोनिन सेल एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत, जिनकी पूंछ tdTomato उत्सर्जन रूप में पाया जाता है, और इसलिए सैपोनिन और एंटीबायोटिक नियंत्रण के बीच एक नकली अंतर करने के लिए प्रमुख कारण से समझाया जा सकता है। इसलिए, जबकि जीवाणु लक्स और प्रतिदीप्ति के साथ संयोजन में mNeptune2 संवाददाताओं दोहरे readout, समाधान आधारित, वास्तविक समय assays, tdTomato और प्रतिदीप्ति संयोजन के लिए प्रयोग करने योग्य, कम से कम आगे गणितीय संकेत deconvolution के बिना दिखाई देते हैं, नहीं करता है।

चित्रा 3 पहले प्रकाशित लक्स ओपेरोन, संवाददाता लेबल जीवों का उपयोग कर जाना जाता antimicrobials की खुराक प्रतिक्रिया घटता का उदाहरण दिखाता है। 6 विशेष रूप से, लीजोनेला करता हैटिशू कल्चर माध्यम में विकसित नहीं। इसलिए, बृहतभक्षककोशिका संक्रमण assays में बैक्टीरिया की प्रतिकृति पूरी तरह intracellular विकास का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, लीजोनेला एक विशेष, कम सोडियम में axenically हो जाना, तरल इक्के जाएगा (एन - (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic एसिड) खमीर निकालने माध्यम। Intracellular और axenic विकास पर 20 यहाँ प्रभाव की तुलना में थे। इन दोनों के विकास सिस्टम का उपयोग करना, हम ने कहा कि इस तरह के β लाक्टाम्स (meropenem, Ceftriaxone) और aminoglycosides (नहीं दिखाया डेटा) के रूप में ध्रुवीय antimicrobials intracellular विकास के गरीब अवरोधकों axenic विकास पर अपने शक्तिशाली प्रभाव के विपरीत, कर रहे हैं। मुमकिन है बृहतभक्षककोशिका संक्रमण assays में गरीब प्रभावकारिता intracellular लीजोनेला replicative आला का उपयोग करने में असमर्थता पर आधारित है। इसके विपरीत, इस तरह के क़ुइनोलोनेस (लिवोफ़्लॉक्सासिन) और azithromycin के रूप में यूकेरियोटिक सेल व्याप्ति antimicrobials, दोनों intracellular और axenic बैक्टीरिया पर शक्तिशाली प्रभाव का प्रदर्शन किया।

50 और सीसी 50 (एकाग्रता है कि 50% यूकेरियोटिक कोशिका मृत्यु लाती) निर्धारित किया जा सकता है, और चयनात्मकता, सीसी 50 / आईसी 50, गणना (50% बैक्टीरिया विकास के निषेध के लिए एकाग्रता)। तीनों उपायों दवाओं की खोज के प्रयासों में यौगिक प्रगति के लिए महत्वपूर्ण मानदंड हैं। चित्रा 4 एंटीबायोटिक डॉक्सीसाइक्लिन के जवाब में इस तरह के दोहरे, खुराक प्रतिक्रिया घटता का एक उदाहरण से पता चलता है, समय के साथ ही स्क्रीनिंग कुओं से प्राप्त आंकड़ों। चित्रा -4 ए में, संक्रमण के दिन 1 पर, के बारे में एक सौ गुना बैक्टीरियल प्रतिकृति शून्य एंटीबायोटिक परीक्षण कुओं में स्पष्ट एंटीबायोटिक के साथ मनाया निषेध के उच्चतम स्तर के साथ तुलना में है। बहुत उच्च doxycy पर छोड़कर कम से कम संबद्ध यूकेरियोटिक सेल विषाक्तता थाक्लाइन सांद्रता (≥10 माइक्रोग्राम / एमएल)। दिन 2 (चित्रा 4 बी) पर, बैक्टीरियल लक्स संकेत लगभग महत्वपूर्ण बैक्टीरियल प्रतिकृति जुड़े cytotoxicity कम रोगाणुरोधी सांद्रता में मनाया के साथ 1 दिन से अधिक से अधिक 10 गुना था। जैसी कि उम्मीद थी, बैक्टीरियल प्रतिकृति प्रेरित मेजबान कोशिका मृत्यु बैक्टीरियल संख्या (लक्स संकेत) रोगाणुरोधी खुराक प्रतिक्रिया वक्र भर के साथ मिलकर पटरियों। उच्च सांद्रता में रोगाणुरोधी cytotoxicity आधारभूत के लिए कम है, बहुत ही उच्च सांद्रता, के रूप में 1 दिन पर मनाया जहां डॉक्सीसाइक्लिन फिर से विषाक्त प्रकट होता है जब तक प्रतिदीप्ति आधारित cytotoxicity माप की तुलना में थोड़ा अधिक रोगाणुरोधी सांद्रता की ओर luminescence खुराक-प्रतिक्रिया का स्पष्ट स्थानांतरण कुछ अतिरंजित है क्रमश: के रूप में दिखाया जब लॉग इन करें और रैखिक तराजू, पर luminescence और cytotoxicity साजिश रचने। बैक्टीरिया विकास के लिए आईसी 50 लगभग 100 एनजी / एमएल था, जबकि सीसी 50 लगभग 10 माइक्रोग्राम / एमएल था, 50 के साथ लगातार ल्युकोसैट वंश के डॉक्सीसाइक्लिन उपचार, एच एल -60 सेल लाइन के लिए पहले से वर्णन किया। 21 इसलिए, कुल मिलाकर इस दोहरे readout प्रयोग में निर्धारित चयनात्मकता लगभग 100 थी।

चित्रा 5 पहले दो आयामी तालमेल परीक्षण जिसमें antimicrobials जोड़ो में संयोजनों intracellular एल pneumophila के खिलाफ बेहतर प्रभाव के लिए परीक्षण किया गया साथ जुड़े isocontour isobolograms प्रकाशित दिखाता है। 6 हालांकि मानक isobolograms एंटीबायोटिक है कि पूरी तरह से, हम चुना है, विकास को बाधित उपलब्ध मात्रात्मक निरोधात्मक डेटा के आधार पर, isocontours का उपयोग कर निषेध के समान स्तर के साथ अंक कनेक्ट करने के निम्नतम मिश्रित सांद्रता कनेक्ट। इन रेखाचित्रों में सही सबसे isocontour मानक isobologram लाइन से मेल खाती है। नतोदर isobolograms आम तौर पर तालमेल से संकेत मिलता है, जबकि उत्तल isobolograms generallY उदासीनता या विरोध का संकेत मिलता है। तालमेल (पैनल एसी) और उदासीनता के उदाहरण में दिखाया जाता है (डीएफ) इस मामले <0.5 और ≥1 क्रमश: एफआईसी सूचकांक मूल्यों के लिए इसी में। 6

ध्यान से, azithromycin, माइनोसाइक्लिन, और रिफैम्पिसिन जोड़ो में संयोजनों तालमेल का प्रदर्शन किया। इसलिए, इन एजेंटों के रूप में चित्रा 6 6 में दिखाया गया तीन तरह संयोजन में एक साथ परीक्षण किया गया। इधर, एक सतह तीन antimicrobials कि> बैक्टीरियल intracellular विकास के 99% निषेध करने के लिए नेतृत्व की सबसे कम मिश्रित सांद्रता कनेक्ट करने के लिए तैयार किया गया था। मनाया अवतल सतह के आकार, स्वयं के द्वारा तीन आयामी तालमेल का विचारोत्तेजक, एक कम एफआईसी सूचकांक (0.325) पर्याप्त तालमेल प्रभाव का संकेत करने के लिए पत्राचार किया।


लक्स ओपेरोन-रिपोर्ट के लिए जेड ': तालिका 1एर, लीजोनेला infection- सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की तुलना। जेड 'चित्रा 2A, 2 बी में दिखाया गया डेटा बिंदुओं के अनुरूप हैं। इस तालिका में चीराविग्लिओ और किर्बी 2014. 4 सकारात्मक luminescence जेड '> 0.25 से संशोधित किया गया है एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर पीले पात्रों के साथ डाला जाता है।


तालिका 2: mNeptune2-रिपोर्टर, लीजोनेला संक्रमण के लिए जेड '- सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की तुलना। जेड 'चित्रा -2, 2 डी में दिखाया गया डेटा बिंदुओं के अनुरूप हैं। सकारात्मक mNeptune2 प्रतिदीप्ति जेड '> 0.25 लाल अक्षरों के साथ डाला जाता है।


TdTomat के लिए जेड ': 3 टेबलओ-रिपोर्टर, लीजोनेला संक्रमण - सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की तुलना। सकारात्मक tdTomato प्रतिदीप्ति जेड '> 0.25 लाल अक्षरों के साथ डाला जाता है। झूठी सकारात्मक जेड '> 0.25 Sytox ग्रीन और tdTomato उत्सर्जन के ओवरलैप करने के लिए संबंधित हरी पात्रों के साथ डाला जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: दोहरे संवाददाता परख सेटअप की सचित्र प्रतिनिधित्व। (ए) 384 अच्छी तरह से बर्तन में निलंबन में विकसित कोशिकाओं के J774A.1 replating। (बी) microplates के लिए ब्याज की यौगिकों के अलावा। (सी) एक साथ संक्रमण और न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी रंगों के अलावा; ऊष्मायन; और readout। इस अंजीर का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें Ure।

चित्र 2
चित्रा 2: दोहरी, intracellular बैक्टीरिया विकास और उच्च throughput प्रारूप में यूकेरियोटिक cytotoxicity की वास्तविक समय readout। लक्स ओपेरोन व्यक्त लीजोनेला pneumophila साथ J774A.1 कोशिकाओं के intracellular संक्रमण के दौरान luminescence (ए) और फ्लोरोसेंट (बी) के संकेतों इसी। MNeptune2 व्यक्त लीजोनेला pneumophila साथ J774A.1 कोशिकाओं के intracellular संक्रमण के दौरान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सी) और फ्लोरोसेंट (डी) संकेतों इसी। चार उपचार दिखाए गए हैं: नकारात्मक DMSO नियंत्रण ( 3 समीकरण ); सकारात्मक cytotoxicity नियंत्रण, सैपोनिन ( 5 समीकरण ); और सकारात्मक बैक्टीरिया विकास निषेध नियंत्रण, azithromycin (tion 4 "src =" / files / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) और लिवोफ़्लॉक्सासिन ( 5 समीकरण )। डेटा अंक 96 डुप्लिकेट, 384 अच्छी तरह प्लेटें में प्रदर्शन प्रतिकृति का मतलब है और मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। ध्यान दें, कुछ डेटा बिंदुओं के लिए मानक विचलन त्रुटि सलाखों न्यूनतम और इसलिए डेटा बिंदु प्रतीकों के भीतर छिपे हुए थे। पैनलों ए और बी चीराविग्लिओ और किर्बी 2014. 4 से संशोधित किया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक आयामी, खुराक प्रतिक्रिया assays के प्रतिनिधि उदाहरण। J774A.1 कोशिकाओं लक्स ओपेरोन व्यक्त, एल pneumophila से संक्रमित और संकेत दिया antimicrobials के एक दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ इलाज किया गया (La'Intracellular') के रूप में Beled। समानांतर में, लक्स ओपेरोन व्यक्त, लीजोनेला इक्के खमीर निकालने मध्यम (ऐ) में ही अंतिम एकाग्रता के लिए पतला और एक समान, दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला ( 'axenic' के रूप में लेबल) के साथ इलाज किया गया। Luminescence दो दिनों के बाद जीवाणु टीका पढ़ सकते हैं और रोगाणुरोधी एकाग्रता बनाम साजिश रची गई थी। पैनल antimicrobials सामान्यतः लीजोनेला संक्रमण के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है शामिल हैं। पैनल बी विभिन्न macrolide एंटीबायोटिक दवाओं की गतिविधि है। पैनल सी अलग-अलग है और कभी कभी intracellular और axenic शक्ति विषम के साथ antimicrobials के कई अलग अलग वर्गों में शामिल हैं। डेटा अंक औसत और शर्त के अनुसार तीन अलग-अलग परीक्षण कुओं का मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा चीराविग्लिओ और किर्बी 2015 के 6 से संशोधित किया गया है एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का संस्करण।

चित्रा 4
चित्रा 4: आईसी 50, सीसी 50 और चयनात्मकता का निर्धारण करने के लिए एक दोहरे readout, खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग का उदाहरण है। intracellular विकास और J774A.1 सेल cytotoxicity पर डॉक्सीसाइक्लिन का प्रभाव दिन 1 और 2 के बाद संक्रमण पर निर्धारित किया गया है। डेटा अंक औसत और शर्त के अनुसार तीन अलग-अलग परीक्षण कुओं का मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: दो आयामी तालमेल assays का उदाहरण है। मिश्रित सीरियल Dilantimicrobials के जोड़े के संस्थानों J774A.1 मैक्रोफेज में लीजोनेला के intracellular वृद्धि के खिलाफ तालमेल के लिए परीक्षण किया गया। Isocontours लाइनों समान प्रतिशत निषेध के अंक कनेक्ट। दाएँ isobologram पूरा intracellular विकास निषेध (> 99% luminescence कमी अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में) के साथ संयोजन जोड़ता है और मानक isobologram साजिश से मेल खाती है। के रूप में प्रत्येक ग्राफ में कलर-कोडेड कुंजी द्वारा चित्रित शेडिंग प्रतिशत निषेध इंगित करता है। बाएं से दाएं Isocontours अनुरूप करने के लिए 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, और 1% की वृद्धि अनुपचारित नियंत्रण के सापेक्ष। यह आंकड़ा चीराविग्लिओ और किर्बी 2015 के 6 से संशोधित किया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
एक तीन आयामी तालमेल परख का उदाहरण है। कि> 99% की वृद्धि निषेध के परिणामस्वरूप azithromycin, माइनोसाइक्लिन और रिफैम्पिसिन की सबसे कम मिश्रित सांद्रता एक isobologram सतह साजिश फार्म से जुड़े थे। यह आंकड़ा चीराविग्लिओ और किर्बी 2015 के 6 से संशोधित किया गया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम intracellular बैक्टीरिया विकास और मेजबान सेल cytotoxicity के एक साथ पता लगाने के लिए वास्तविक समय assays का वर्णन है। वहाँ प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, मजबूत परख प्रदर्शन के लिए, वहाँ बैक्टीरियल और cytotoxicity readouts के बीच पर्याप्त वर्णक्रम अलग-अलग होने चाहिए। इस तरह की जुदाई luciferase operon पत्रकारों और फ्लोरोसेंट डीएनए बाध्यकारी रंगों के संयोजन के लिए स्वाभाविक है। हालांकि, हमारे अनुभव (तालिका 1-3, चित्रा 2), दोहरी के उपयोग पर आधारित, फ्लोरोसेंट readout गैर अतिव्यापी फ्लोरोसेंट संकेतों (जैसे, एक दूर लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर और हरे रंग न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग) मजबूत प्राप्त करने के लिए की आवश्यकता है, समाधान आधारित डेटा। इसके अलावा, पूर्व के अनुभव से, संभावित उपलब्ध पाठक प्रकाशिकी या समाधान प्रतिदीप्ति गुण से संबंधित है, हरे या नारंगी उत्सर्जन के साथ ही डीएनए दाग> 0.5, एक उपाय मजबूत सामान्य प्रबंधन परिप्रेक्ष्य का संकेत से प्रयोग करने योग्य cytotoxicity डेटा, यानी, जेड 'अधिक से अधिक दियाजी परख प्रदर्शन। 4 इसलिए, समाधान आधारित, दोहरे readout assays कुछ हद तक क्या संवाददाताओं से इस्तेमाल किया जा सकता करने के मामले में विवश कर रहे हैं।

एक और महत्वपूर्ण कदम मैक्रोफेज करने के लिए बैक्टीरिया से संक्रमण का अनुपात है। बैक्टीरियल संक्रमण मेजबान कोशिका मृत्यु लाती है। इसलिए, उच्च भी एक inoculum जल्दी मेजबान कोशिका मृत्यु, बैक्टीरियल प्रतिकृति की अपेक्षाकृत कम स्तर, और अध्ययन के तहत antimicrobials के प्रत्यक्ष साइटोटोक्सिक प्रभाव के संभावित घबराहट पैदा हो सकती है। उचित संक्रमित अनुपात अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है और अध्ययन के तहत विशेष रूप से बैक्टीरियल तनाव की डाह पर निर्भर हो सकता है। लगभग 1 के एक कम अनुपात: 1 एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। इस तरह के और 1 चित्रा 2 में दिखाया गया है उन तालिकाओं के रूप में प्रयोग - 3 कई संक्रमण अनुपात के साथ प्रदर्शन मूल्यांकन और भविष्य assays में उपयोग के लिए शर्तों का अनुकूलन की अनुमति देगा। ध्यान से, विशेष रूप से लीजोनेला, नेट के साथ एक तनाव की पृष्ठभूमि के उपयोग के लिएively कम मेजबान सेल cytotoxicity (एक flagellin उत्परिवर्ती) 8 प्राप्त उच्च परख मजबूती के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया। इसके अलावा, अन्य intracellular को दोहरे readout तकनीक का अनुवाद, रोगज़नक़ मेजबान सिस्टम भी संक्रमण प्रोटोकॉल के लिए अतिरिक्त समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। लीजोनेला टिशू कल्चर माध्यम में नहीं उगते, हमें अकेला intracellular विकास के लिए बढ़ा संवाददाता संकेत विशेषता के लिए अनुमति देता है। हालांकि, कई intracellular रोगजनकों (जैसे, ब्रूसिला) बदलती विस्तार करने के लिए दोनों intracellularly और टिशू कल्चर माध्यम में विकसित कर सकते हैं। इसलिए, इस तरह जेंटामाइसिन उपचार और मेजबान कोशिकाओं की धुलाई आरंभिक संक्रमण के बाद के रूप में अतिरिक्त कदम बाह्य प्रतिकृति को कम करने और intracellular प्रतिकृति क्षमता के चुनिंदा परीक्षा अनुमति देने के लिए आवश्यक हो सकता है। 22

परख उच्च throughput स्क्रीनिंग और तालमेल के परीक्षण में इस्तेमाल के लिए बड़े पैमाने अप चुनौतियों का अपना सेट के साथ जुड़ा हुआ है। सबसे खासLy, हमने पाया कि J774A.1 जरूरत कोशिकाओं की बड़ी संख्या सबसे अच्छा जीवाणु के बजाय पारंपरिक टिशू कल्चर बोतल (चित्रा 1 देखें) में संवर्धित किया जा सकता है। हालांकि, संस्कृति बाँझपन बनाए रखने के लिए, स्पंज फोम या इन बोतल के लिए अन्य फिल्टर टोपियां मानक बैक्टीरियल कुप्पी टोपियां के लिए बेहतर पाए गए। एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर एक छोटा सा कक्षीय प्रकार के बरतन मंच की नियुक्ति हाथ पर उपकरणों के साथ बड़े पैमाने अप संस्कृति प्रदर्शन करने के लिए हमें की अनुमति दी। अन्त में, स्वचालित वितरण प्रणाली के उपयोग (आंकड़े 1 ए, बी) बहुत परख सेटअप और मिश्रित कमजोर पड़ने श्रृंखला के परीक्षण में मदद की।

विशेष रूप से, बैक्टीरियल प्रतिकृति की पर्याप्त क्षमता का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से ब्याज की बैक्टीरियल तनाव में या तो एक लक्स ओपेरोन या फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए पर निर्भर करता है। यह अंत करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट और लक्स ओपेरोन रिपोर्टर एक मजबूत विधान प्रमोटर कि एफए अनुमति चाहिए द्वारा संचालित transposons का एक सेट बनाया हैCile बैक्टीरिया के विविध प्रकार के अंकन (कांग और किर्बी, डेटा नहीं दिखाया गया है)। वैकल्पिक रूप से, रोगजनकों जिसका intracellular प्रतिकृति मेजबान सेल के लिए साइटोटोक्सिक साबित होता है के लिए, वास्तविक समय cytotoxicity अकेला माप intracellular नकल के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इस मामले में, साइटोटोक्सिक और निष्क्रिय यौगिकों एक भी परख में मज़बूती से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

वास्तविक समय readout बाहर की उपलब्धता उच्च throughput स्क्रीनिंग assays के लिए विशेष रूप से लाभ प्रदान करता है। विशेष रूप से, बैक्टीरिया विकास (कॉलोनी बनाने इकाई निर्धारण) 7 और cytotoxicity (परख की समाप्ति पर सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक के अलावा) 23,24 कई प्रयोगात्मक कदम और संबद्ध श्रम समाप्त की समापन बिंदु आकलन से बचाव। इसके अलावा, समय पाठ्यक्रम आसानी से प्रायोगिक प्रयास में कम से कम वृद्धि के साथ ही परख कुओं में पीछा किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, बैक्टीरियल प्रतिकृति संवाददाताओं के दो विशिष्ट प्रकार की उपलब्धता (बैक्टीरियाएल लक्स ओपेरोन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन) उच्च throughput स्क्रीनिंग परख के विकास के लिए विशेष महत्व है। विशेष रूप से, झूठी सकारात्मक रोगाणुरोधी readout लक्स ओपेरोन या फ्लोरोसेंट संवाददाता उत्पादन के साथ नकली हस्तक्षेप से उत्पन्न क्रमिक रूप से प्राथमिक और माध्यमिक स्क्रीनिंग में पूरक orthogonal assays के क्रमश: 25 में दोनों पत्रकारों के उपयोग के माध्यम से संबोधित किया जा सकता है। विशेष रूप से, हमने पाया है कि बैक्टीरियल लक्स ओपेरोन के लिए एक लगभग 20 गुना के साथ बैक्टीरिया विकास के प्रति अधिक संवेदनशील रिपोर्टर था 100 गुना हमारे फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं से कम सीमा का पता लगाने। हालांकि, लक्स उत्पादन अधिक झूठे कई जीन उत्पादों और प्रकाश उत्पादन के लिए आवश्यक कदम के आधार पर सकारात्मक होने की संभावना अधीन है। 26 अधिक विशेष रूप से, यूकेरियोटिक एकल जीन luciferase संवाददाताओं के विपरीत, बैक्टीरियल लक्स ओपेरोन एक पांच जीन क्लस्टर कि luciferase सब्सट्रेट के अंतर्जात संश्लेषण के लिए दोनों एक दो घटक luciferase एंजाइम और जीनों को कूटबद्ध है। यह होगाभावना इसलिए बनाने के एक प्राथमिक स्क्रीन में लक्स ऑपरेटर रिपोर्टर का उपयोग करने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता सुनिश्चित करने के लिए, और माध्यमिक assays में फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए।

साथ में ले ली, कार्यप्रणाली वर्णित वास्तविक समय, गैर विनाशकारी बैक्टीरियल प्रतिकृति और यूकेरियोटिक cytotoxicity को मापने के लिए assays के समापन बिंदु के लिए विकल्प प्रदान करता है और इसलिए एक पद्धति सरल और intracellular रोगजनकों पर रोगाणुरोधी प्रभाव का आकलन करने के लिए बहुमुखी विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

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Acknowledgments

अनुसंधान इस पांडुलिपि में सूचना के तहत पुरस्कार नंबर R01AI099122 एलर्जी और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया JEK करने के लिए सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता स्वास्थ्य। हम ICCB-लांगवुड स्क्रीनिंग सुविधा और / या के लिए राष्ट्रीय जांच प्रयोगशाला से जेनिफर स्मिथ, डेविड Wrobel, र चियांग, डौग बाढ़, शॉन जॉनसन, जेनिफर Nale, स्टीवर्ट Rudnicki, पॉल यान, रिचर्ड सिउ, और राहेल वार्डन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं न्यू इंग्लैंड क्षेत्रीय उत्कृष्टता के केंद्र में Biodefense और विकास और उच्च throughput स्क्रीनिंग assays के प्रदर्शन में उनकी सहायता के लिए संक्रामक रोग (U54AI057159 द्वारा समर्थित) उभर रहा है। हम यह भी पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए केनेथ पी स्मिथ को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
J774A.1 cells American Type Culture Collection TIB-67 Host cell
ACES Sigma-Aldrich A9758  For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered Becton-Dickinson/Difco 210929 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt Sigma-Aldrich K2000 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic Thermo Fisher Scientific P288-500 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine Sigma-Aldrich C-7755 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate Sigma-Aldrich F5879 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated Thermo Fisher Scientific SP236-500 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water N/A N/A For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade) Sigma-Aldrich T1895 For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation Corning via Thermo Fisher Scientific 10-040-CV For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red Corning via Thermo Fisher Scientific 17-105-CV For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) HyClone via Thermo Fisher Scientific SH30034.02 For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum Gemini Bioproducts 100-510 For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154 For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO Thermo Fisher Scientific S7020 For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific 13-255-26 For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker BellCo Glass 7744-01010 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-2038-04 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml) BellCo Glass 7744-16250 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-2038-07 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml) BellCo Glass 7744-16100 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-1490-038 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump Thermo Fisher Scientific 5840300 For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold Thermo Fisher Scientific 24072670 Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture Corning 3570 For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) Sigma-Aldrich D2650 For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin Sigma-Aldrich PHR1088 Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark) Sigma-Aldrich S-4521 Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor Thermo Fisher Scientific Finnpipette For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot Epson/ICCB-L (Custom equipment) For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system Hewlett-Packard via Tecan D300 For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system Hewlett-Packard via Tecan T8+ For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera Nikon Ti For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6 Adobe Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10 Wolfam For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.

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References

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संक्रमण अंक 117 तालमेल उच्च throughput स्क्रीनिंग वास्तविक समय, Intracellular विकास रोगाणुरोधी एंटीबायोटिक कम से कम निरोधात्मक एकाग्रता खुराक प्रतिक्रिया cytotoxicity isobologram
उच्च throughput, वास्तविक समय, intracellular रोगाणुरोधी गतिविधि के दोहरे readout परीक्षण और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity
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Chiaraviglio, L., Kang, Y. S., Kirby, J. E. High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (117), e54841, doi:10.3791/54841 (2016).

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