Abstract
細胞内の抗菌活性および真核細胞の細胞毒性の伝統的な対策は、エンドポイントアッセイに依存しています。このようなエンドポイントアッセイは、細胞溶解、コロニー形成単位の決意、または試薬の添加等の読み出しに先立って、いくつかの追加の実験工程を必要とします。アッセイの数千を行う場合、例えば、ハイスループットスクリーニング中に、アッセイのこれらのタイプのために必要な下流の労力が大きいです。したがって、ハイスループット抗菌発見を容易にするために、我々は、同時に細胞内の細菌増殖の阻害剤を同定し、真核細胞の細胞毒性を評価するためのリアルタイムアッセイを開発しました。具体的には、リアルタイム細胞内細菌増殖の検出は、細菌ルクスオペロン（ 第 1 世代アッセイ）または蛍光タンパク質レポーター（ 第 2 世代 、直交アッセイ）のいずれかで、細菌のスクリーニング株をマークすることで有効になっていました。非毒性、細胞膜非透過性、核酸結合色素また、マクロファージの初期感染時に追加されました。これらの色素は、生細胞から除外されます。しかし、非生存宿主細胞は、エントリと核DNA（デオキシリボ核酸）の蛍光標識を可能にする膜の完全性を失います。注目すべきことに、DNA結合は、宿主細胞死の溶液ベースの読み出しを提供する蛍光量子収率の大幅な増加と関連しています。我々は、マイクロプレート形式でハイスループットスクリーニングを実行するために、そして顕微鏡により細胞内増殖および細胞毒性を評価するために、この組み合わせアッセイを使用しています。注目すべきことに、抗菌剤は、一緒に適用二つ以上の抗菌剤の相乗効果は、別々に適用した場合よりも大きくなっている相乗効果を発揮することができます。異なる濃度の抗生物質の組み合わせの順列が評価されなければならないような細胞内病原体に対するin vitroでの相乗効果のためにテストすることは、通常、驚異的な作業です。しかし、私たちは、リアルタイムアッセイは自動化され、デジタルディスペンシング技術pで組み合わせることがわかりました容易な相乗効果のテストをermitted。これらのアプローチを使用して、我々は体系的に細胞内病原体、 レジオネラ・ニューモフィラに対してだけでは抗菌剤の多数のアクションと組み合わせてを調査することができました。
Introduction
細胞内区画に一時的に成長するか、存在する病原体が治療根絶することは困難です。義務または比較的ようなレジオネラ・ニューモフィラ 、Q熱リケッチア 、 ブルセラ属などの細胞内病原体を義務づけます。 、野兎病菌 、およびマイコバクテリウム属 。多くの場合、数ヶ月から数年もの範囲とすることができる治療法のための抗菌薬治療の長期のコースを必要とします。さらに、細胞外病原体は、一過性の細胞内ニッチを占め、このように抗菌薬治療の通常のコースによってクリアランスを逃れ、後に病原性感染症の新しいラウンドを開始するために出てくることがあります。 黄色ブドウ球菌 1及び尿路病原性腸内細菌2,3感染は2ますます認識の例です。したがって、基本的な薬物発見の目的は、細胞内コンパートメントに浸透新規な抗菌剤を同定することです。迅速に根絶するための最適な治療法細胞内の生物サブ抑制抗菌剤暴露による耐性の発生を防止するには、特に望ましいです。
この目的のために、我々は、モデル病原体、 レジオネラ・ニューモフィラの細胞内増殖を標的細胞内浸透抗菌剤を同定するためのハイスループットスクリーニング技術を開発しました。 4前臨床観察は、標準的な抗菌薬感受性試験は、正確にこの生物に対してインビボ治療効果が予測しなかったことを示しています。このようなβラクタムおよびアミノグリコシドなどの抗菌剤の主要なクラスは、無菌的に成長したレジオネラ菌に対して非常に有効であるが、十分にレジオネラ菌が存在する細胞内コンパートメント内に侵入しないため、 図5は、具体的には、これがありました。 5,6後で証拠は、技術的に、より複雑な細胞内増殖アッセイが効果的に臨床効果を予測することが示唆されました。 7
したがって、我々は、細胞内細菌増殖のリアルタイム決意する技術を開発しました。 6これは、4または蛍光タンパク質9レポーター（ここで説明した第二世代、直交アッセイは、）は、細菌染色体に細菌ルシフェラーゼオペロン8（前述した第1世代のアッセイ）のいずれかの統合により改変された細菌株の使用を通じて達成されました。このように、発光または蛍光シグナルは、細菌数のサロゲート、リアルタイムの読み出しを提供します。
しかし、これらの属性は、細胞内infectioの主要な交絡因子に対応していません宿主細胞上のnアッセイ、オフターゲット効果。具体的には、宿主細胞の死は、本質的に細胞内増殖を制限し、抗菌効果の偽陽性の同定をもたらします。スクリーニングライブラリのように多くの化合物は、毒性の真核細胞であり、このような偽陽性は、解決のためのフォローアップ、エンドポイントの細胞毒性アッセイを大量に必要と、真の抗菌剤を圧倒だろう。
これにより、同時に、真核生物細胞の生存および細胞内増殖を評価できることが非常に重要でした。注目すべきことに、非生存真核細胞の特性は、細胞膜の完全性の喪失です。細胞膜の透過性を試験するプローブは、したがって、細胞の生存率を評価するために使用されてもよいです。我々は、以前にアクセスし、死細胞の核DNAを染色する推定細胞膜非透過性、蛍光DNA結合色素の一連の能力を特徴とします。 4核DNAを結合すると、これらの染料はquantuの大幅な増加を表示しますバックグラウンド溶液蛍光にわたって増加したシグナルが得られメートル蛍光収率。このように、これらの色素は、真核細胞死の定量的な読み出しを提供しました。 4は注目すべきことに、我々はいくつかは、J774マクロファージとの長時間の同時インキュベーションの間に自分自身に非毒性であることがわかりました。初期感染の間に添加された場合、それらは、マイクロプレート蛍光光度計により測定又は顕微鏡で観察することができる真核細胞死のリアルタイム蛍光読み出しが得られました。
従って、細菌のレポーターおよび非毒性、膜非透過性、DNA結合色素の使用を組み合わせることにより、我々は、同時に細菌負荷および真核細胞毒性の両方を測定するための簡単な、非破壊、リアルタイムアッセイを開発することができました。このアッセイは、私たちは〜250抗菌剤との細胞内増殖を阻害する能力のために機能的に特徴付けられていない活性を有する>24万小分子を含む384ウェルプレートフォーマット〜万知られている生物活性物質にスクリーニングすることができましたレジオネラ・ニューモフィラ 、同時に、各化合物の真核細胞の細胞毒性データを生成します。 6 レジオネラ菌の細胞内増殖に対する既知の抗菌剤の我々の分析は、これまでのこのタイプの最も包括的な探査ました。 6
組み合わせて使用する我々のアッセイフォーマットの効率に基づいて、我々はまた、続いて既知の抗菌剤の潜在的な相乗効果を調査しました。最も一般的な相乗作用試験の一つ、いわゆるチェッカーボードアッセイは、標準的に二つ以上の抗菌剤の二倍連続希釈の組み合わせ効果を評価することによって行われます。二つ以上の抗菌剤を別々に適用各々の効果の和よりも一緒に適用されたときに、これらのアッセイでは、図10に示すように 、相乗効果は、より大きな効果を観察することにより定義されます。注目すべきは、これまで、唯一の集中と選択の相乗試験は、細胞内のレジオネラ・ニューモに対して行いました
相乗効果のテストを容易にするために、我々は、自動化されたデジタルディスペンシング技術6との組み合わせで、当社のリアルタイム細胞内増殖/真核生物の細胞毒性アッセイを利用しました。この自動化は、384ウェル形式でDMSO単独の水溶液で、または組み合わせ中に溶解した化合物の連続希釈液を分配するために、私たちを可能にしました。 11はまた、このような強固な液体処理技術は、簡単に、より高い解像度を実行するために私達を許可し、平方根-の-2（むしろ標準よりも、低い解像度、倍増）我々の2つの次元で特異性の高いレベルを達成するために希釈組み合わせを、チェッカーボード相乗効果分析。この解像度が2倍希釈系列12を使用した場合の再現性についてのシナジーフィールドの懸念に対処する上で特に有用でした。最後に、私たちのアッセイは、定量的ともTHERましたEFORE阻害の階調を測定しました。その結果、アッセイは、成長阻害の同様のレベルでのコンビナトリアル濃度を接続アイソコンターする等高線アイソボログラムで発現抑制情報の全体を、捕獲しました。 6このプロット戦略は組み合わせ用量反応曲線の可視化を可能にしました。我々の方法論を例示するために、我々は、これらのアッセイを実施するための我々のプロトコルを記述し、代表的な結果を示します。
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Protocol
1.リアルタイム細胞内増殖および真核細胞毒性アッセイ
- 準備宿主細胞（J774A.1細胞）
- 9％の鉄補充ウシ血清を含むRPMI 1640中で懸濁液中文化J774A.1 ハツカネズミマクロファージ様細胞。最初は組織培養フラスコ内の通路。細胞は培地15 ml中に75cm 2の組織培養フラスコ中でコンフルエントになった後、15mlを組織培養フラスコに戻し、50mlを転写された媒体の同じタイプ、65 mlに掻き希釈によって分割250ミリリットルの細菌振とうフラスコに。
- 250ミリリットルおよび/または組織培養培地との五分の一のボリュームに満たさ千ミリリットル細菌のフラスコ内で懸濁液中のスケールアップ、文化のため。毎分約120回転で回転速度を設定することにより、通気。一貫性のある成長のために、正確に5％CO 2、37℃でインキュベートします。
- 彼らは範囲内の密度に達する収穫細胞2.5×10 6個の細胞/ 5×10 6細胞/ mlで。死細胞は、細胞傷害性アッセイにおけるバックグラウンドノイズを増加させるように（最も容易にトリパンブルー染色によってアッセイ）死細胞の割合は、25％を超えないことを確認してください。
- 白色の組織培養処理したプレートで、384ウェルマイクロプレートウェルあたり30μlの組織培養培地中で5×10 4 J774A.1細胞において。実験の日に90％コンフルエンスを達成するためにマイクロプレートを一晩インキュベートします。
- 準備発光または蛍光レジオネラ・ニューモフィラ
- 通路L.ニューモフィラ （LP02 :: flaA ::ルクス8）適当な培地、 すなわち 、バッファリング木炭酵母エキス（BCYE）培地上の細菌。チミジン栄養要求株を使用している場合は、100μg/ mlのチミジンで培地を補います。 （凍結ストックからの場合）コンフルエントを得るために、（前の板通路から場合）新しいBCYEプレート上に厚く生物を広げ、1日をインキュベートすることにより、実験のために、細菌のパッチを準備するか、2〜3日成長。
- （2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸、0.35グラムのK 2 HPO 4、および950ミリリットルの脱イオン水に1グラムの一塩基性カリウムαケトグルタル酸- 10グラムの酵母エキス、10gのNを溶解させることによりBCYEプレートを準備します。水酸化カリウム（11.9モル溶液の≥2.5ml）でpHを6.9に調整します。
- 15グラム寒天および2グラムの活性炭を追加します。そして1 L最終容量にもたらします。磁気攪拌棒、オートクレーブを追加します。クール55℃に培地および0.4グラムのL-システインを含有する濾過滅菌溶液を追加し、脱イオン水に溶解した0.42グラムのアンモニウム鉄（III）、クエン酸。ペトリ皿を注ぐ前に混合するために、磁石撹拌プレートを使用してください。
- 無菌成長培地でのL.ニューモフィラの成長の試験のために、木炭や寒天を除いBCYEに使用されるすべての化学試薬を組み合わせることにより、ACES -酵母エキスブロス（AYE）を準備します。フィルタは、滅菌し、直ちに使用し、以降の実験のために凍結します。
- SAで再懸濁生物必要に応じて100μg/ mlのチミジン補充とJ774A.1細胞に使用私組織培養培地。
- 通路L.ニューモフィラ （LP02 :: flaA ::ルクス8）適当な培地、 すなわち 、バッファリング木炭酵母エキス（BCYE）培地上の細菌。チミジン栄養要求株を使用している場合は、100μg/ mlのチミジンで培地を補います。 （凍結ストックからの場合）コンフルエントを得るために、（前の板通路から場合）新しいBCYEプレート上に厚く生物を広げ、1日をインキュベートすることにより、実験のために、細菌のパッチを準備するか、2〜3日成長。
- マクロファージ感染
- （細菌の成長阻害および真核細胞溶解のためのスクリーニング化合物、ならびに陽性および陰性対照）関心のある試験化合物を加えます。好ましくは、車両の十分な希釈を可能にするために、DMSO（ジメチルスルホキシド）、または水溶液中≥500xで原液を溶解します。
- ストック溶液を冷凍保存することができますが、不安定な化合物および抗菌剤のための凍結融解サイクルを避けます。
- 組織培養培地中に2.5×10 6 CFU（コロニー形成単位）/ mおよび蛍光レポーターで標識された細菌1.0×10 7 CFU / mlでの標的とし、適切な非毒性、膜非透過性、核酸-を追加するために、発光細菌を希釈2.5×最終アッセイ濃度で色素を結合。
- 各J774A.1培養ウェルに混合物の20μl加え、最終アッセイ容量50μlの、最終細菌濃度1×10 6 CFU / mlの（ルクスオペロンレポーター）または4×10 10 6 CFU / mlの（蛍光タンパク質レポーター）。
- 蒸発エッジ効果を防止するために、100％の相対湿度で5％CO 2で1〜3日間37℃でインキュベートします。
- （細菌の成長阻害および真核細胞溶解のためのスクリーニング化合物、ならびに陽性および陰性対照）関心のある試験化合物を加えます。好ましくは、車両の十分な希釈を可能にするために、DMSO（ジメチルスルホキシド）、または水溶液中≥500xで原液を溶解します。
- アッセイ読み出し
- 使用されている記者に応じてマイクロプレートルミノメーターや蛍光光度計での細菌の増殖と真核生物の細胞毒性を読みます。
- 温度関連のエッジ効果を回避するために、熱的には約20分（または約10分間蓋をオフにした状態で生物学的安全キャビネット内）のための半開き蓋つきの実験台上の単一の層に配置することによって、従来の発光読書にマイクロ平衡化。
- 後の時点でのリアルタイム読み出しが所望される場合インキュベーターにマイクロ戻ります。
- 使用されている記者に応じてマイクロプレートルミノメーターや蛍光光度計での細菌の増殖と真核生物の細胞毒性を読みます。
2.データ解析
- 正と負の詐欺にデータを正規化しますントロールは、真核細胞のための細胞内細菌の増殖と細胞毒性パーセントのためのパーセントまたは倍-阻害を計算します。
- 、アッセイの堅牢性を評価= 1 Z-因子（Z '）Z分析'を用いて、細菌の増殖阻害および細胞毒性の両方に陽性と陰性対照の間に統計的な分離を計算するには- 3（σP +σn）は / |μ のp +μをn個 |。この式において、σp値とσnは、それぞれ、正および負の対照ウェルのための標準偏差です。 μpとμnが 、それぞれ、陽性および陰性対照ウェルの平均値です。
- ハイスループットスクリーニングアッセイのために、目的の試験化合物の効果を評価するための標準的なZスコア（または他の代替的な、定量的な統計的尺度）を算出します。また、潜在的に生理的により関連性のような簡単な折りたたみ式の減少またはログ倍の減少を計算します幾何学的に細菌を複製するための効果の大きさの尺度。
3.シングルおよびマルチ次元（ すなわち 、シナジー）用量反応試験およびデータ解釈
- プロトコルセクション1で説明したように、マクロファージや細菌を準備します。
- 直前に感染または無菌のインキュベーションに、（ すなわち、最小発育阻止濃度またはMIC）とローにハイエンドにスパニングを目標に、希釈系列を倍増、シリアルに完全に成長を排除濃度を実験的興味のある抗菌剤を追加明らかな活性を示さない濃度を終了します。
- 単一用量反応し、製造業者のプロトコルに従って抗菌希釈液を直接、自動化された添加により、セットアップをテストし、組み合わせの相乗効果を容易にするために、自動液体処理システムを使用してください。
- 例えば、サブ倍加希釈物の使用を考慮し、841 / 54841eq1.jpg "/> - 倍希釈系列、および分析は、データの正確さと再現性を高めるために複製します。
- マクロファージ感染、組織培養培地中2.5×10 6 CFU（コロニー形成単位）/ mlに標的化するために、発光細菌を希釈します。各ウェルJ774A.1文化、最終アッセイ容量を50μl、最終細菌濃度1×10 6 CFU / mlに混合物の20μlのを追加します。 100％の相対湿度で5％CO 2中、37℃でインキュベートします。
- 無菌の増殖試験のために、AYE培地中1×10 6 CFU / mlの最終濃度になるように、発光細菌を希釈し、384ウェルプレートの各ウェルに50μlを添加し、5％CO 2中で37℃でインキュベート 相対湿度100％。
- 細菌の増殖を抑制する抗菌組み合わせについて、分別阻害剤濃度指数を計算します。細菌グラムの完全または> 99％阻害をもたらす組み合わせで各薬物（A、B、···N）の場合rowth、（FIC、Bを、nは。。。）個々の端数阻害濃度を計算し、次のように：FIC =化合物の濃度"」の最小限の阻害剤濃度で割っを" "それ自体で。 。そして、コンビナトリアルFIC指数を計算したりなど 、FIC bを計算し、同じ数式を使用して
FICは、FICのA + FIC Bは+を=。 。 .FIC nは、それぞれの阻害の組み合わせのために。 - 相乗効果を評価するために1.0から遠くに外れコンビナトリアルインデックスを使用してください。保守的な相乗効果の指標と≥4、アンタゴニスト作用として≤0.5のカットオフを考えてみましょう。 12
- プロットは、アイソボログラム等高線アイソボログラム、および/または等値面は、組み合わせの効果の6などの代替グラフィカルな表現をアイソボログラム。
FICは、FICのA + FIC Bは+を=。 。 .FIC nは、それぞれの阻害の組み合わせのために。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
マイクロプレートの細胞内増殖アッセイ
図1は、アッセイ工程をダイアグラム。示さ自動化の手順を手動で実行することができます。しかし、スループットが大幅に液体ハンドリングシステムを使用して促進されます。
図2は、384ウェルマイクロプレート、デュアル読み出し、リアルタイム細胞内増殖および（LP02）はどちらかルクスオペロン（ 図2A、2B）またはmNeptune2蛍光タンパク質でマークされたレジオネラ株を（使用して、真核細胞の細胞毒性アッセイからの代表的な結果を示しています図2C、2D）レポーター。正および負の対照化合物（DMSO、抗生物質、サポニン）はハイスループットスクリーニングの設定のパフォーマンスをシミュレートするために、ピン搬送ロボットの使用を介してプレートに加えました。重要なレジオネラ 図2A、2C） は、それぞれ、mNeptune2標識細菌のための発光細菌のための24〜72時間と48〜72時間でサポニン溶解および抗生物質処理対照と比較して容易に区別することができます。 レジオネラ菌は、典型的には 48〜72時間後に複製し、宿主細胞を溶解します。これは、時間の経過SYTOXグリーン（宿主細胞死の代表的な、非透過性、核酸結合色素およびマーカー）の増加した蛍光を示しており、 図1Bおよび1Dに理解することができます。細胞傷害性は、最終的には界面活性剤（サポニン）で観察された最大量、宿主細胞溶解、陽性対照に達します。 mNeptune2標識生物は、おそらくより迅速な宿主細胞の死滅を占め、ルクスオペロン標識細菌よりも4倍高い接種物に添加し、それ以前のmNeptune2実験における蛍光シグナルの上昇を関連していました。 、有効な抗菌治療（レボフロキサシンまたはアジスロマイシン）PREVを期待されるように両方の細菌の増殖と宿主細胞溶解をented。逆に、宿主細胞（ 例えば 、サポニン）の破壊を介して細胞内増殖を制限し、細胞傷害性化合物は、容易に低発光又はmNeptune2蛍光、および高い細胞毒性に関連した信号の組み合わせによって同定することができます。さらに、発光とmNeptune2蛍光の両方で組み合わせ減少、観察（細菌の増殖）、および細胞毒性は、化合物が、真の細胞内増殖抑制剤（ 例えば 、アジスロマイシンおよびレボフロキサシンポジティブコントロール）よりもむしろスプリアス干渉による偽陽性であることが合理的な確信を提供細菌のレポーターシグナル。
表1から3 には、コントロールと比較して3異なる細菌のレポーター（ルクスオペロン、mNeptune2、tdTomato）とそれに対応する蛍光読み取りのための代表Z 'を示しています。 Z '> 0.5はSTATISTICAを示しています高スループット設定のLLY堅牢なアッセイに適切な。しかしながら、より低いZ 'は、実験の目的、 すなわち 、確実に試験化合物または摂動の多かれ少なかれ微妙な効果を区別する能力によって適切であり得ます。 図2の結果に基づいて、mNeptune2は細菌ルシフェラーゼオペロンとしてレポーターとして小文字を区別しませんでした。したがって、期待どおりに、堅牢な負でmNeptune2信号との差（DMSO）および正（レボフロキサシン、アジスロマイシン、サポニン）成長抑制剤のコントロールは対照的に、インキュベーションの2日目または3日目まで観察されなかったへの早期、ルクスの合理的に強いシグナル感染後1日目のオペロンレポーター細菌。これとは対照的に、tdTomato、代替細菌の蛍光レポーターは、感染過程を通して「次善のZを示しました。次善の蛍光特性はtdTomato秒の最適な読み出しのために使用される範囲内に蛍光励起および発光尾の侵略から一部をもたらしましたignal。この侵食は、レボフロキサシンの比較（細菌が複製べきではない二つの条件の下で細菌数に有意な差を意味している）対tdTomatoサポニンで見つかった正のZ 'から理解することができます。この結果は、尾tdTomato放出として検出され、したがって、サポニンと抗生物質の対照との間のスプリアスの差につながる強い蛍光シグナルを引き起こすサポニン溶解によって説明することができます。デュアル読み出し、ソリューションベースのリアルタイム分析のために使用可能な表示された蛍光との組み合わせで細菌ルクスとmNeptune2記者つつ、tdTomatoと蛍光の組み合わせは、少なくともさらに数学的な信号のデコンボリューションすることなく、しません。
図3は、ルクスオペロン、レポーター標識生物を用いて、既知の抗菌剤の用量反応曲線の以前に公表された例を示しています。 6特に、 レジオネラはありません組織培養培地で生育しません。したがって、マクロファージ感染アッセイにおける細菌の複製は、単に細胞内増殖を表します。しかし、 レジオネラは、特殊な、低ナトリウムで無菌的に成長し、液体ACES（N - （2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸）酵母エキス培地。細胞内および無菌成長にここでは20の効果を比較しました。これら2つの成長システムを使用して、我々は、βラクタム（メロペネム、セフトリアキソン）、およびアミノグリコシド（データは示していない）のような極性の抗菌剤は、無菌の成長に対するそれらの強力な効果とは対照的に、細胞内増殖の乏しい阻害剤であることを観察しました。おそらくマクロファージ感染アッセイに乏しい有効性は、細胞内レジオネラ複製ニッチにアクセスできないことに基づいています。これとは対照的に、このようなキノロン（レボフロキサシン）およびアジスロマイシンなどの真核細胞浸透性抗菌剤は、細胞内および無菌細菌の両方に強力な効果を実証しました。
50（50％の細菌増殖阻害の濃度）及びCC 50（50％の真核細胞死を誘導する濃度）を決定することができ、選択性、CC 50 / IC 50を計算しました。すべての3つの対策は、創薬の取り組みにおける化合物の進行のための重要な基準です。 図4は 、抗生物質のドキシサイクリンに応答して時間をかけて同じスクリーニングウェルから得られたデータを、このような二重の、用量反応曲線の例を示す図です。 図4（a）では、感染の1日目に、約百倍の細菌の複製は、抗生物質で観察された阻害の最高レベルと比較して、ゼロ抗生物質試験ウェルで明白です。非常に高いdoxycyを除いて、最小限の関連する真核生物の細胞毒性がありましたクライン濃度（≥10/ mlの）。 2日目（ 図4B）、細菌ルクス信号は約低抗菌濃度で観察重要な細菌の複製に関連する細胞傷害性で一日1より大きい10倍高かったです。予想されたように、細菌の複製によって誘導される宿主細胞の死は、抗菌用量反応曲線全体細菌数（ルクス信号）と密接に追跡します。高い抗菌濃度では細胞毒性は、蛍光ベースの細胞毒性の測定値に比べやや高い抗菌濃度に向かって発光用量反応の見かけのシフトはやや誇張されている1日目に観察されるように、ドキシサイクリンが再び有毒表示されます非常に高い濃度まで、ベースラインに低減されます示すように、それぞれ、ログおよびリニアスケールで発光し、細胞毒性をプロットするとき。 CC 50は、約10μgの/ mlであった一方で、細菌の増殖のためのIC 50は 、約100 ng / mlでした50と整合は、白血球系統のドキシサイクリン処理、HL-60細胞株について前述しました。 21したがって 、このデュアル読み出し実験で決定された全体的な選択性は約100でした。
図5は、抗菌剤の対の組み合わせは、細胞内のL.ニューモに対する増強された効果に関して試験された2次元の相乗試験に関連した以前に公開された等高線アイソボログラムを示しています。 6標準アイソボログラムが完全に成長を阻害する抗生物質の最低コンビナトリアル濃度を接続しているが、我々はアイソコンターを使用して阻害の同様のレベルでポイントを接続するために、利用可能な定量的な阻害データに基づいて、選択しました。これらの図中で最も右側の等高線は、標準的なアイソボログラムラインに対応しています。凹状のアイソボログラムは、一般的に、相乗効果を示す凸アイソボログラムgenerallながら、yは無関心または拮抗作用を示します。相乗効果（パネルAC）および無関心の例には、それぞれ<0.5≥1のFIC指数値に対応する、この場合には、（DF）を示しています。 6
注目すべきは、アジスロマイシン、ミノサイクリン、およびリファンピシンの対の組み合わせは相乗効果を実証しました。 図6,6に示すように、したがって、これらの薬剤には、三元の組み合わせで一緒に試験しました。ここでは、表面は、細菌の細胞内増殖を> 99％阻害を3つのLEDの抗菌剤の最低の組み合わせ濃度を接続するために採取しました。観察された凹形状の表面は、それ自体で3次元相乗効果を示唆し、実質的な相乗効果を示す低FIC指数（0.325）に対応しました。
表1：Z 'ルクスオペロン、レポートのえー、 陽性および陰性対照の レジオネラ infection-比較。 Z 'は、 図2A、2Bに示したデータ点に対応します。このテーブルはChiaraviglioとカービー2014年4正の発光Z '> 0.25から変更されているが、黒地に黄色の文字で強調表示されます。
表2：mNeptune2レポーター、 レジオネラ 感染 のZ ' -正および負の対照との比較。 Z 'は、 図2C、図2Dに示されたデータ点に対応します。正mNeptune2蛍光Z '> 0.25は、赤い文字で強調表示されます。
表3：Z 'tdTomat用O-レポーター、 レジオネラ感染 症-陽性および陰性対照との比較。正tdTomato蛍光Z '> 0.25は、赤い文字で強調表示されます。 SYTOX緑とtdTomato放射のオーバーラップに関連する偽陽性Z '> 0.25は、緑色の文字で強調表示されます。
図1： デュアルレポーターアッセイのセットアップの絵図。 （A）384ウェル皿に懸濁液中で増殖させたJ774A.1細胞の再プレーティング。 （B）マイクロプレートへの関心の化合物を添加します。 （C）の同時感染と核酸結合色素を添加します。インキュベーション;読み出し。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 URE。
図2：デュアル、ハイスループット形式での細胞内細菌の増殖および真核細胞毒性のリアルタイム読み出し。ルクスオペロン発現レジオネラ・ニューモフィラとJ774A.1細胞の細胞内感染の間に発光（A）と蛍光（B）の信号を対応します。 mNeptune2発現レジオネラ・ニューモフィラとJ774A.1細胞の細胞内感染の間に蛍光タンパク質（C）および蛍光（D）の信号を対応します。 4つの処理が示されている：負のDMSOコントロールを（ 
）;ポジティブ細胞毒性コントロール、サポニン（ 
）;そして陽性細菌の増殖阻害コントロール、アジスロマイシン（ション4 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>）およびレボフロキサシン（ 
）。データポイントは重複し、384ウェルプレートで行っ96反復の平均値と標準偏差を表します。いくつかのデータポイントの標準偏差のエラーバーは、最小限のため、データポイントの記号の中に隠された、注意してください。パネルAおよびBはChiaraviglioとカービー2014年4から変更されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 一次元、用量反応アッセイの代表的な例。 J774A.1細胞はルクスオペロン発現、L.ニューモに感染させ、指示された抗菌剤の2倍希釈系列で処理した（ラ「細胞内」）としてbeled。並行して、ルクスオペロン発現は、 レジオネラ菌は、エース酵母エキス培地（AYE）で同じ最終濃度に希釈し、（「無菌」とラベルされた）同一の2倍希釈系列で処理しました。発光は、2日後に細菌接種を読み、抗菌濃度に対してプロットしました。 パネルAは、一般的に レジオネラ感染症を治療するために使用される抗菌剤を含みます。 パネルBは、別のマクロライド系抗生物質の活性を比較します。 パネルCは、様々な、時には細胞内や無菌効力を対照的なと抗菌剤のいくつかの異なるクラスが含まれています。データポイントは、条件ごとに3つの別個の試験ウェルの平均値と標準偏差を表します。この図は、Chiaraviglioとカービー2015年6から変更されている拡大表示するにはここをクリックしてください。この図のバージョン。
図4：IC 50、CC 50 および選択性を 決定するためのデュアル読み出し、用量反応実験の例 。細胞内増殖およびJ774A.1細胞の細胞毒性に対するドキシサイクリンの効果は、第1および2日、感染後に決定しました。データポイントは、条件ごとに3つの別個の試験ウェルの平均値と標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：2 次元の相乗効果アッセイの例 。コンビナトリアルシリアル希抗菌剤のペアのutionsはJ774A.1マクロファージにおけるレジオネラの細胞内増殖に対する相乗効果について試験しました。アイソコンターラインは、同様の阻害パーセントのポイントを接続します。右端のアイソボログラムは、完全な細胞内増殖阻害（>未処理の対照と比較して99％の発光の減少）との組み合わせを接続し、標準的なアイソボログラムプロットに対応しています。各グラフの色分けされたキーで線引きとしてシェーディングが阻害パーセントを示しています。左から右へのアイソコンターは、100に対応する90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、及び未処理の対照と1％の成長相対。この図は、Chiaraviglioとカービー2015年6から変更されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々は、細胞内の細菌の増殖および宿主細胞の細胞毒性の同時検出のためのリアルタイムアッセイを記載します。プロトコルにおけるいくつかの重要なステップがあります。まず、堅牢なアッセイ性能のために、細菌や細胞毒性の読み出しとの間に十分なスペクトル分離が存在しなければなりません。このような分離は、ルシフェラーゼオペロンの記者や蛍光DNA結合色素の組み合わせのために固有のものです。しかし、私たちの経験（ 表1-3、 図2）、二重の使用に基づいて、蛍光読み出しは非重複蛍光シグナル（ 例えば 、遠赤色蛍光タンパク質レポーターと緑の核酸染色の使用は）堅牢取得するときに必要な、溶液ベースのデータ。また、潜在的に利用可能なリーダーの光学系または溶液の蛍光特性に関連する先行経験から、緑またはオレンジの発光を有する唯一のDNA染色はよりすなわち 、Z '大きく、使用可能な細胞毒性データを与えた> 0.5、STRONを示す指標グラムの分析性能。 4したがって 、溶液ベース、デュアル読み出しアッセイは幾分レポーターを使用することができるかという点で制約されます。
もう一つの重要なステップは、マクロファージへの細菌感染の割合です。細菌感染は、宿主細胞の死を誘導します。そのため、高すぎる接種物は、初期の宿主細胞死、細菌の複製の比較的低レベル、および検討中の抗菌剤の直接的な細胞傷害作用の潜在的な難読化につながる可能性があります。適切な感染率は、経験的に決定することができ、研究中の特定の細菌株の病原性に依存してもよいです。約1の低比：1は良い出発点です。例えば、図2に示すような実験及び表1 -いくつかの感染比で行わ3は将来のアッセイにおける使用のための条件の評価及び最適化を可能にします。注目すべきは、特にレジオネラ 、NATでひずみ背景の使用についてively低い宿主細胞の細胞毒性（フラジェリン変異体）8が得られた高アッセイ堅牢性に大きく貢献しています。また、他の細胞内へのデュアル読み出し技術の翻訳は、病原体 - 宿主系はまた、感染のプロトコルへの追加の調整が必要になる場合があります。 レジオネラ菌は、私たちは一人で細胞内増殖に増加したレポーターシグナルを属性することができ、組織培養培地中で増殖しません。しかし、多くの細胞内病原体（ 例えば 、 ブルセラ）は、両方の細胞内および組織培養培地中で様々な程度に成長することができます。したがって、このような初期感染後の宿主細胞のゲンタマイシン処理および洗浄のような付加的な工程は、細胞外の複製を減少させ、細胞内複製能力の選択的な検査を可能にするために必要であり得ます。 22
ハイスループットスクリーニングと相乗作用試験における使用のためのアッセイのスケールアップが課題の独自のセットに関連付けられています。ほとんどの特定LYは、我々は必要なJ774A.1細胞の多数が最高の細菌ではなく、従来の組織培養フラスコ（ 図1参照 ）で培養することができることを見出しました。しかし、文化の無菌性を維持するために、これらのフラスコ用のスポンジフォームまたは他のフィルタキャップは、標準的な細菌のフラスコのキャップに好適で発見されました。標準的な組織培養インキュベーターの中に小さなオービタルシェーカープラットフォームの配置は、手持ちの機器とスケールアップの文化を実行するために私達を許可しました。最後に、自動分与システム（ 図1A、B）の使用が大いにアッセイのセットアップと組み合わせ希釈系列の試験を容易にしました。
特に、細菌の複製の適切な検出が十分に関心の細菌株にルクスオペロンまたは蛍光タンパク質のいずれかを発現する能力に依存しています。この目的のために、我々はFAを可能にしなければならない強力な構成的プロモーターによって駆動される蛍光とルクスオペロンレポータートランスポゾンのセットを作成しました細菌の多様なタイプ（カンとカービー、データは示されていない）のマーキングCILE。あるいは、その細胞内複製、宿主細胞のための細胞傷害性を証明するために、病原体は、単独で、リアルタイムの細胞毒性の測定は、細胞内複製の代用として使用することができます。しかしながら、この場合には、細胞傷害性および不活性な化合物は、単一のアッセイで確実に区別することができません。
リアルタイム読み出しうちの利用可能性は、ハイスループットスクリーニングアッセイのための特定の利点を提供します。具体的には、細菌の増殖（コロニー形成単位の決意）7のエンドポイント評価の回避および細胞毒性（アッセイの終了時に細胞生存率試薬の添加）23,24は、いくつかの実験手順および関連労働を排除します。また、時間のコースは、簡単に実験的な努力で、最小限の増加に伴って、同じアッセイウェルに追跡することができます。重要なことは、細菌の複製レポーターの2つの異なるタイプの利用可能性は、（細菌Lルクスオペロン及び蛍光タンパク質）は、高スループットスクリーニングアッセイの開発のために特定の意味を有します。具体的には、ルクスオペロンまたは蛍光レポーター出力とスプリアス干渉による偽陽性抗菌読み出しはそれぞれ25、一次および二次スクリーニングにおいて相補直交アッセイで順次両方のレポーターを使用することによって対処することができます。注目すべきことに、我々は、細菌ルクスオペロンは、当社の蛍光タンパク質レポーターよりも100倍低い検出限界にほぼ20倍と細菌増殖のより敏感なレポーターであることを見出しました。しかし、ルクスの出力には、いくつかの遺伝子産物と光出力のために必要な手順に基づいて、より多くの偽陽性の可能性が高い対象となります。 図26は、具体的には、真核生物の単一遺伝子ルシフェラーゼレポーターとは対照的に、細菌ルクスオペロンは、ルシフェラーゼ基質の内因性合成のための2つの成分のルシフェラーゼ酵素および遺伝子の両方をコードする5個の遺伝子のクラスターです。それだろう特異性を確保するために、二次アッセイに十分な感度を確保するために、一次スクリーニングでルクス演算子レポーターを使用することが意味をなす、および蛍光タンパク質レポーター。
まとめると、記載された方法は、細菌の複製および真核細胞毒性を測定するためのアッセイをエンドポイントにリアルタイムで、非破壊的選択肢を提供し、したがって、細胞内病原体に対する抗菌効果を評価するための方法論、シンプルで汎用性の高い方法を表しています。
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Acknowledgments
この原稿で報告された研究では、コンテンツはもっぱら著者の責任であるJEKする賞の数R01AI099122下アレルギーや国立衛生研究所の国立感染症研究所によってサポートされていましたし、必ずしも国立研究所の公式見解を示すものではありません。健康。私たちは、ICCB-ロングウッドスクリーニング施設および/または国立スクリーニング研究室からのジェニファー・スミス、デヴィッド・ローベル、蘇チェンマイ、ダグ洪水、ショーン・ジョンストン、ジェニファーNale、スチュワートルドニツキ、ポール・ヤン、リチャード・シウ、そしてレイチェルウォーデンに感謝したいと思いますニューイングランド地域の生物兵器防衛エクセレンスのセンターと（U54AI057159でサポートされている）新興感染症のハイスループットスクリーニングアッセイの開発と性能での支援のため。また、原稿上で役に立つコメントのためにケネス・P.スミスに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J774A.1 cells | American Type Culture Collection | TIB-67 | Host cell |
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Yeast extract, ultrafiltered | Becton-Dickinson/Difco | 210929 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors |
| Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt | Sigma-Aldrich | K2000 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Potassium phosphate, dibasic | Thermo Fisher Scientific | P288-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7755 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Ammonium iron(III) citrate | Sigma-Aldrich | F5879 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately |
| Potassium hydroxide solution, concentrated | Thermo Fisher Scientific | SP236-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Deonized water | N/A | N/A | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Thymidine (tissue culture grade) | Sigma-Aldrich | T1895 | For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640 |
| RPMI 1640, standard formulation | Corning via Thermo Fisher Scientific | 10-040-CV | For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine |
| RPMI 1640 lacking phenol red | Corning via Thermo Fisher Scientific | 17-105-CV | For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use |
| L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) | HyClone via Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration |
| Iron-supplemented calf serum | Gemini Bioproducts | 100-510 | For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density |
| SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S7020 | For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration. |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-255-26 | For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead) |
| Orbital shaker | BellCo Glass | 7744-01010 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately) |
| Shaker flasks (250 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-04 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (250 ml) | BellCo Glass | 7744-16250 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker flasks (1,000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-07 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (1,000 ml) | BellCo Glass | 7744-16100 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-1490-038 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps |
| MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes |
| Combi standard bore manifold | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl |
| White 384 well dishes treated for tissue culture | Corning | 3570 | For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully |
| DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving positive control and test compounds |
| Azithromycin | Sigma-Aldrich | PHR1088 | Antibiotic positive control |
| Saponin (from Quillaja bark) | Sigma-Aldrich | S-4521 | Cytoxicity positive control |
| Multichannel pipettor | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette | For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing |
| Epson pin transfer robot | Epson/ICCB-L | (Custom equipment) | For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays |
| D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | D300 | For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl |
| T8+ cartridges for D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | T8+ | For dispensing test compounds |
| Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera | Nikon | Ti | For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution |
| Glass-bottom tissue culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope. These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms. |
| Photoshop CS6 | Adobe | Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images. | |
| Mathematica 10 | Wolfam | For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms. |
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