De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Abstract

Las medidas tradicionales de actividad antimicrobiana intracelular y la citotoxicidad de las células eucariotas se basan en ensayos de punto final. Dichos ensayos de punto final requieren varios pasos experimentales adicionales antes de lectura de salida, tales como la lisis celular, la determinación de unidades formadoras de colonias, o la adición del reactivo. Al realizar miles de ensayos, por ejemplo, durante el cribado de alto rendimiento, el esfuerzo aguas abajo requerida para este tipo de ensayos es considerable. Por lo tanto, para facilitar el descubrimiento antimicrobiano de alto rendimiento, hemos desarrollado un ensayo en tiempo real para identificar simultáneamente inhibidores de crecimiento bacteriano intracelular y evaluar la citotoxicidad de células eucariotas. En concreto, la detección de crecimiento bacteriano intracelular en tiempo real se ha habilitado mediante el marcado de las cepas bacterianas de cribado, ya sea con un operón lux bacteriana (1 ^st generación de ensayo) o reporteros de proteínas fluorescentes ^(2ª generación, ensayo ortogonal). A, célula membrana impermeable, tinte de unión a ácido nucleico no tóxicotambién se añadió durante la infección inicial de los macrófagos. Estos colorantes se excluyen de las células viables. Sin embargo, las células huésped no viables pierden integridad de la membrana que permite la entrada y etiquetado fluorescente de ADN nuclear (ácido desoxirribonucleico). En particular, el ADN de unión se asocia con un gran aumento en el rendimiento cuántico fluorescente que proporciona una lectura basada en la solución de la muerte de la célula huésped. Hemos utilizado este ensayo combinado para llevar a cabo una pantalla de alto rendimiento en formato de microplacas, y para evaluar el crecimiento intracelular y la citotoxicidad por microscopía. En particular, los agentes antimicrobianos pueden demostrar la sinergia en el que el efecto combinado de dos o más agentes antimicrobianos cuando se aplica juntos es mayor que cuando se aplica por separado. Las pruebas de sinergia in vitro frente a patógenos intracelulares es normalmente una tarea prodigiosa como permutaciones combinatorias de antibióticos en diferentes concentraciones deben ser evaluados. Sin embargo, encontramos que nuestro ensayo en tiempo real combinado con automatizado, dispensación tecnología digital permitted pruebas de sinergia fácil. El uso de estos enfoques, hemos sido capaces de examinar sistemáticamente la acción de un gran número de antimicrobianos solos y en combinación contra el patógeno intracelular, Legionella pneumophila.

Introduction

Los patógenos que crecen o residen temporalmente en compartimentos intracelulares son difíciles de erradicar terapéuticamente. Obligar o relativamente obligar a patógenos intracelulares tales como Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, y Mycobacterium spp. a menudo requieren ciclos de terapia antimicrobiana prolongada para la curación que puede variar de meses a incluso años. Además, los patógenos extracelulares pueden ocupar transitoriamente nichos intracelulares y de este modo escapar un despeje de cursos normales de terapia antimicrobiana y más tarde emerger para iniciar nuevas rondas de infección virulenta. Staphylococcus aureus ¹ y enterobacterias ^2,3 infecciones uropatogénicas son dos ejemplos cada vez más reconocidos. Por lo tanto, un objetivo fundamental el descubrimiento de fármacos es la identificación de nuevos agentes antimicrobianos que penetran en compartimentos intracelulares. El tratamiento óptimo para erradicar rápidamenteorganismos intracelulares y prevenir el desarrollo de resistencia a los antimicrobianos mediante la exposición sub-inhibidor es especialmente deseable.

Con este fin, hemos desarrollado una tecnología de selección de alto rendimiento para identificar agentes antimicrobianos intracelulares-penetrante de orientación el crecimiento intracelular del patógeno modelo, Legionella pneumophila. ⁴ observaciones clínicas anteriores indican que las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos estándar no predice con precisión in vivo la eficacia terapéutica contra este organismo. ⁵ En concreto, esto se debía a que las principales clases de antimicrobianos tales como beta-lactámicos y aminoglucósidos, aunque muy eficaz contra la Legionella axenically crecido, no tienen suficientemente penetran en los compartimentos intracelulares donde reside la Legionella. ^5,6 tarde, las pruebas sugiere que los ensayos de crecimiento intracelular técnicamente más complejas predijeron con eficacia la eficacia clínica. ⁷

Por lo tanto, hemos desarrollado la tecnología para la determinación en tiempo real de crecimiento bacteriano intracelular. ⁶ Esto se logró mediante el uso de una cepa bacteriana modificada a través de la integración de cualquiera de un bacteriana luciferasa operón ⁸ (ensayo de primera generación, que se describe anteriormente) ⁴ o fluorescente proteína ⁹ reporteros (segunda generación, de ensayo ortogonal, que se describe aquí) en el cromosoma bacteriano. De esta manera, luminiscente o señal fluorescente proporciona un sustituto, la lectura en tiempo real del número de bacterias.

Sin embargo, estos atributos no se refieren a un factor de confusión importante en INFECTIO intracelularn ensayos, fuera de objetivo efectos en las células huésped. En particular, la muerte de la célula huésped inherentemente limita el crecimiento intracelular y conduce a la identificación de falsos positivos del efecto antimicrobiano. Como muchos de los compuestos en las bibliotecas de cribado son células eucariotas tóxicos, tales falsos positivos abrumarían verdaderos agentes antimicrobianos, lo que exige un gran número de seguimiento, los ensayos de citotoxicidad punto final para la resolución.

Por lo tanto, era de gran interés para poder evaluar la viabilidad celular eucariota y el crecimiento intracelular de forma simultánea. En particular, una característica de las células eucariotas no viables es la pérdida de integridad de la membrana celular. Por lo tanto, las sondas que ponen a prueba la permeabilidad de la membrana de la célula se pueden usar para evaluar la viabilidad celular. Hemos caracterizado previamente la capacidad de una serie de células putativamente membrana no permeables, colorantes fluorescentes, unión al ADN para acceder y manchar el ADN nuclear de células muertas. ⁴ en el ADN nuclear de unión, estos tintes muestran un gran aumento en quantum rendimiento fluorescente resulta en una mayor señal a través de fluorescencia de la solución de fondo. Como tal, estos colorantes proporcionan una lectura cuantitativa de la muerte celular eucariota. ⁴ En particular, se encontró que varios eran ellos mismos no tóxico durante prolongado co-incubación con macrófagos J774. Cuando se añade durante la infección inicial, proporcionaron un tiempo real, la lectura fluorescente de la muerte celular eucariota que se puede medir por un fluorímetro de microplaca o observó microscópicamente.

Por lo tanto, mediante la combinación de uso de un reportero bacteriana y no tóxico, la membrana impermeable, colorantes de unión al ADN, que fueron capaces de desarrollar un método no destructivo, el ensayo simple, en tiempo real para medir tanto la carga bacteriana y la citotoxicidad de células eucariotas simultáneamente. Este ensayo ha permitido a la pantalla en 384 pocillos formato de placa de ~ 10.000 bioactivos conocidos incluyendo ~ 250 antimicrobianos y> 240.000 pequeñas moléculas con actividad funcionalmente no caracterizado por la capacidad de inhibir el crecimiento intracelular deLegionella pneumophila, mientras que al mismo tiempo la generación de datos de citotoxicidad de células eucariotas para cada compuesto. ⁶ Nuestro análisis de los antimicrobianos conocidos contra el crecimiento intracelular de Legionella fue la exploración más completa de este tipo hasta la fecha. ⁶

En base a la eficacia de nuestro formato de ensayo, también posteriormente explorado los efectos potencialmente sinérgicas de agentes antimicrobianos conocidos cuando se usan en combinación. Una de las pruebas de sinergia más comunes, el llamado ensayo de tablero de ajedrez, se realiza de manera estándar mediante la evaluación de los efectos combinatorios de diluciones en serie de dos veces de dos o más agentes antimicrobianos. ¹⁰ En estos ensayos, la sinergia se define por la observación de mayor efecto cuando dos o más agentes antimicrobianos se aplican conjuntamente que la suma de los efectos de cada aplicados por separado. Es de destacar que, hasta ahora, sólo se centra y pruebas de sinergia selectiva se llevó a cabo en contra intracelular de Legionella pneumophila

Para facilitar las pruebas de sinergia, hicimos uso de nuestro ensayo de citotoxicidad en tiempo real de crecimiento intracelular / eucariota en combinación con la tecnología digital de dispensación automatizada ^6. Esta automatización nos permitió prescindir de diluciones en serie de compuestos disueltos en DMSO o solución acuosa solo o en combinación en formato de 384 pocillos. ¹¹ Por otra parte, tales robusta tecnología de tratamiento de líquidos nos permitió realizar fácilmente una resolución más alta, la raíz cuadrada de dos niños (en lugar de la norma, de menor resolución, doblando) combinaciones de dilución para alcanzar mayores niveles de especificidad en nuestro bidimensional, la sinergia de tablero de ajedrez análisis. Esta resolución fue especialmente valiosa para abordar las preocupaciones en materia sinergia sobre la reproducibilidad cuando se utiliza una doble serie de dilución ^12. Por último, nuestro ensayo fue cuantitativa y también Therntes de gradaciones de inhibición medido. Como resultado, el ensayo capturó la totalidad de la información inhibitorio, expresable en isocontorno isobologramas en el que isocontours conectar concentraciones combinatorias con niveles similares de inhibición del crecimiento. ⁶ Esta estrategia trazado permitió la visualización de las curvas de dosis-respuesta combinatorias. Para ilustrar nuestra metodología, describimos nuestro protocolo para la realización de estos ensayos y mostrar los resultados representativos.

Protocol

El crecimiento intracelular 1. Tiempo Real y la célula eucariótica Ensayo de citotoxicidad

1. Preparación de células huésped (células J774A.1)
   1. Células como los macrófagos-Cultura J774A.1 Mus musculus en suspensión en RPMI 1640 con suero de ternera suplementado con hierro 9%. Inicialmente pasaje en matraces de cultivo tisular. Después las células se han vuelto confluente en un 75 cm matraz de cultivo de ² tejido en 15 ml de medio, dividido por raspado y la dilución a 65 ml con el mismo tipo de medio, de los cuales 15 ml se devuelve al matraz de cultivo de tejidos y 50 ml se transfiere a un matraz de 250 ml agitador bacteriano.
   2. Para ampliación, la cultura en suspensión en 250 ml y / o 1.000 frascos llenos de bacterias ml de una quinta parte del volumen con medio de cultivo de tejidos. Airear ajustando la velocidad de rotación en aproximadamente 120 revoluciones por minuto. Para un crecimiento constante, se incuba a exactamente 5% de _CO2 y 37 ° C.
   3. Las células se cosechan cuando alcanzan densidad en el intervalo de 2,5 x 10 ⁶ células/ ml a 5 x 10 ⁶ células / ml. Garantizar porcentaje de células muertas (lo más fácilmente posible ensayó por tinción con azul tripán) no exceda del 25%, ya que las células muertas se incrementará el ruido de fondo en los ensayos de citotoxicidad.
   4. Placa de blanco, cultivo de tejidos tratados, de 384 pocillos microplacas a 5 x 10 ⁴ células J774A.1 en 30 l de medio de cultivo de tejidos por pocillo. Incubar las microplacas durante la noche para conseguir el 90% de confluencia en el día de experimento.
2. Preparación luminiscente o fluorescente Legionella pneumophila
   1. Pasaje L. pneumophila (LP02 :: :: lux flaA ⁸⁾ bacterias en un medio apropiado, es decir, tamponada extracto de levadura carbón (BYCE) medio. Si se utiliza una cepa auxotrófico timidina, suplemento de medio con 100 g de timidina / ml. Preparar parches de bacterias para los experimentos de propagación de organismos densamente en una nueva placa BCYE e incubando un día (si de una anterior pasaje placa) o de dos a tres días (si desde el almacén congelado) para obtener confluentecrecimiento.
      1. Preparar placas BCYE disolviendo 10 g de extracto de levadura, 10 g de N - (2-acetamido) -2-aminoetanosulfónico, 0,35 g K ₂ HPO _4, y 1 g de potasio monobásico α-cetoglutarato en 950 ml de agua desionizada. Ajustar a pH 6,9 con hidróxido de potasio (≥2.5 ml de solución molar 11,9).
      2. Añadir 15 g de agar y 2 g de carbón activado; y llevar a 1 l de volumen final. Añadir una barra de agitación magnética y autoclave. medio Enfriar a 55 ° C y añadir soluciones de filtro esterilizado que contienen 0,4 g de hierro 0,42 g de amonio (III) citrato de L-cisteína y se disolvió en agua desionizada. Utilice placa de agitación imán para mezclar antes de verter las placas de Petri.
      3. Para el ensayo de crecimiento de L. pneumophila en medio de cultivo axénicos, preparar caldo de extracto de levadura-ACES (AYE) mediante la combinación de todos los reactivos químicos utilizados para BYCE excepto el carbón vegetal y el agar. Filtro de esterilizar y utilizar inmediatamente o congelar para experimentos posteriores.
   2. Volver a suspender los organismos de la same medio de cultivo tisular utilizado para las células J774A.1 con 100 mg / ml de suplementos de timidina, según proceda.
3. La infección de los macrófagos
   1. Añadir los compuestos de ensayo de interés (compuestos de detección, y controles positivos y negativos para la inhibición del crecimiento bacteriano y la lisis de células eucariotas). Preferiblemente, se disuelven soluciones madre en ≥500x en DMSO (dimetil sulfóxido) o una solución acuosa para permitir la dilución suficiente de vehículo.
      1. Aunque las soluciones madre se pueden almacenar congeladas, evitar los ciclos de congelación-descongelación para compuestos lábiles y antimicrobianos.
   2. Diluir bacterias luminiscentes para apuntar de 2,5 x 10 ⁶ CFU (unidad formadora de colonias) / m y bacterias marcado con indicador fluorescente para 1,0 x 10 ⁷ UFC / ml en medio de cultivo de tejido y añadir no tóxico, la membrana impermeable a ácido nucleico apropiada colorante de unión a 2.5x concentración de ensayo final.
   3. Añadir 20 l de mezcla a cada cultura J774A.1 así, el volumen de ensayo final50 l, concentración bacteriana final de 1 x 10 ⁶ UFC / ml (reportero lux operón) o 4 x 10 10 ⁶ UFC / ml (proteína fluorescente reportero).
   4. Incubar a 37 ° C durante 1-3 días en 5% de _CO2 a 100% de humedad relativa para evitar efectos de borde de evaporación.
4. ensayo de lectura
   1. Leer el crecimiento bacteriano y la toxicidad de células eucariotas en un luminómetro de microplacas y fluorímetro según sea apropiado para la prensa que se utiliza.
      1. Para evitar efectos de borde de la temperatura asociada, equilibre térmicamente microplacas antes de la lectura de luminiscencia por la colocación en una sola capa sobre un banco de laboratorio con tapa entreabierta durante aproximadamente 20 min (o en una cabina de seguridad biológica con tapas de aproximadamente 10 min).
   2. Microplacas volver a la incubadora, si se desea lectura en tiempo real en momentos posteriores.

Análisis 2. Datos

1. Normalizar los datos a con positivo y negativocontroles para calcular el porcentaje de inhibición o plegable para el crecimiento bacteriano intracelular y el porcentaje de citotoxicidad para las células eucariotas.
2. Para evaluar la robustez del ensayo, calcular la separación estadística entre los controles positivos y negativos tanto para la inhibición del crecimiento bacteriano y la citotoxicidad utilizando Z-factor "análisis donde Z (Z) '= 1-3 (σ _p + σ _n) / | mu _p + mu _n |. En esta ecuación, σ _p y σ _n son las desviaciones estándar para los pocillos de control positivos y negativos, respectivamente; μ _p y mu _n son los valores medios de los pocillos de control positivos y negativos, respectivamente.
   1. Para los ensayos de selección de alto rendimiento, el cálculo de las puntuaciones z estándar (o otra alternativa, las medidas estadísticas cuantitativos) para evaluar los efectos de los compuestos de ensayo de interés. Alternativamente, el cálculo de un simple pliegue de reducción o reducción veces log como potencialmente fisiológicamente más relevante medida de la magnitud del efecto para las bacterias geométricamente replicantes.

3. multi-dimensional (es decir, Synergy) dosis-respuesta Interpretación individual y pruebas y Datos

1. Preparar los macrófagos y las bacterias como se describe en el apartado 1 del protocolo.
2. Justo antes de la infección o la incubación axénicos, añadir antimicrobianos de interés experimental en una serie, duplicando serie de dilución, con el objetivo de spanning en el extremo superior una concentración que elimina completamente el crecimiento (es decir, la concentración inhibitoria mínima o MIC) y en la baja poner fin a una concentración que no muestra actividad obvia.
3. Utilizar un sistema de manipulación de líquidos automatizado para facilitar sola dosis-respuesta y la configuración de las pruebas de sinergia combinatoria a través de la adición directa y automatizada de diluciones antimicrobiana de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Considerar el uso de diluciones sub-duplicar, por ejemplo,841 / 54841eq1.jpg "/> - doblar serie de dilución, y el ensayo se replica para aumentar la precisión y la reproducibilidad de los datos.
5. Para la infección de macrófagos, diluir las bacterias luminiscentes a diana de 2,5 x 10 ⁶ CFU (unidad formadora de colonias) / ml en medio de cultivo tisular. Añadir 20 l de mezcla a cada cultura J774A.1 así, el volumen de ensayo final de 50 l, concentración bacteriana final de 1 x 10 ⁶ UFC / ml; y se incuba a 37 ° C en 5% de _CO2 a 100% de humedad relativa.
   1. Para el ensayo de crecimiento axénicos, diluir las bacterias luminiscentes a la concentración final de 1 x 10 ⁶ UFC / ml en medio de AYE, añadir 50 l a cada pocillo de una placa de 384 pocillos y se incuba a 37 ° C en 5% de CO ₂ a 100% de humedad relativa.
6. Calcular el índice de concentración de inhibidor fraccional para las combinaciones antimicrobianas que inhiben el crecimiento bacteriano. Para cada fármaco en la combinación (a, b,.. N) que resulta en la inhibición completa o> 99% de g bacterianarecimiento, calcular la concentración inhibitoria fraccional individuo (FIC _{a, b, n...)} como sigue: FIC _a = la concentración de compuesto "a" dividido por la concentración de inhibidor mínima de "a" por sí mismo. _. Utilizando la misma fórmula, el cálculo de FIC _b, etc A continuación, calcular el índice FIC o combinatoria FIC FIC = _a + _b + FIC. . .FIC _N para cada combinación inhibidora.
   1. Utilice el índice combinatorio que se desvía más lejos de 1,0 para evaluar la sinergia. Considere un punto de corte de ≤0.5 como indicación conservadora de un efecto sinérgico y ≥4, un efecto antagonista. ¹²
   2. Parcela isobologramas, isocontorno isobologramas, y / o isosuperficie isobologramas ⁶ representaciones gráficas como alternativas de efectos combinatorios.

Representative Results

ensayo de crecimiento intracelular de microplacas

Figura 1 Diagrama de las etapas del ensayo. Los pasos automatizados que se muestran se pueden realizar manualmente. Sin embargo, el rendimiento se facilita en gran medida el uso de sistemas de manejo de líquidos.

La Figura 2 muestra los resultados representativos de una microplaca de 384 pocillos, de doble lectura, el crecimiento intracelular en tiempo real y ensayo de citotoxicidad de células eucariotas utilizando una cepa de Legionella (LP02) marcado ya sea con un operón lux (figuras 2A, 2B) o proteína fluorescente mNeptune2 ( Figura 2C, 2D) reportero. compuestos de control positivo y negativo (DMSO, antibióticos, saponina) se añadieron a las placas a través del uso de un robot de transferencia de pin para simular el rendimiento en un entorno cribado de alto rendimiento. Legionella significativa (Figuras 2A, 2C) puede distinguirse fácilmente en comparación con saponina lisis y los controles tratados con antibióticos temperatura de 24 a 72 horas para las bacterias luminiscentes y 48 a 72 horas para las bacterias marcadas con mNeptune2, respectivamente. Legionella normalmente lisa las células huésped después de la replicación durante 48 a 72 horas. Esto se puede apreciar en las figuras 1B y 1D, que muestran un aumento de la fluorescencia de SYTOX Green (un representante, impermeable, de unión a ácido tinte y marcador de la muerte de la célula huésped nucleico) con el tiempo. Citotoxicidad eventualmente alcanza la cantidad máxima observada en el detergente (saponina), la lisis de la célula huésped, control positivo. se añadieron organismos marcados con mNeptune2 en un inóculo de cuatro veces más alta que las bacterias del operón lux marcado, probablemente representa más muerte celular rápida anfitrión y anteriores asociados aumento de la señal de fluorescencia en experimentos mNeptune2. Como era de esperar, el tratamiento antimicrobiano eficaz (levofloxacino o azitromicina) preventeder tanto el crecimiento como huésped bacteriano lisis celular. A la inversa, los compuestos citotóxicos que limitaban el crecimiento intracelular a través de la destrucción de la célula huésped (por ejemplo, saponina) podrían ser fácilmente identificados por una combinación de baja luminiscencia o fluorescencia mNeptune2, y señal alta citotoxicidad asociada. Por otra parte, la observación de la disminución combinada en la luminiscencia y fluorescencia mNeptune2 (crecimiento bacteriano), y la citotoxicidad una confianza razonable en que un compuesto es un verdadero inhibidor del crecimiento intracelular (por ejemplo, azitromicina y levofloxacino controles positivos) en lugar de un falso positivo resultante de la interferencia espuria con la señal del informador bacteriano.

Tabla 1 - 3 muestra representativa Z 'durante tres reporteros bacterianas diferentes (operón lux, mNeptune2, tdTomato) y los correspondientes lecturas de fluorescencia respecto a los controles. Un Z '> 0,5 indica una statisticaLLY robusta apropiada para la configuración de ensayo de alto rendimiento; sin embargo, inferior Z 'pueden ser adecuados en función de los objetivos experimentales, es decir, la capacidad de distinguir de forma fiable los efectos más o menos sutiles de compuestos de ensayo o perturbaciones. Basado en los resultados de la Figura 2, mNeptune2 no era un reportero tan sensible como el operón de la luciferasa bacteriana. Por lo tanto, como se esperaba, una diferencia robusta entre la señal mNeptune2 en negativo (DMSO) y positivo (levofloxacina, azitromicina, saponina) controles inhibidor del crecimiento no se observó hasta el día 2 o el día 3 de incubación, a diferencia de principios, señal razonablemente robusto de lux bacterias indicadoras operón en el día 1 después de la infección. Por el contrario, tdTomato, un indicador fluorescente bacteriana alternativa, mostró Z subóptima 'durante todo el curso infecciosa. características fluorescentes subóptimos como resultado, en parte, de la usurpación de la excitación de fluorescencia y la cola de emisión en el rango utilizado para la lectura óptima de tdTomato signal. Esta invasión se puede apreciar a partir de la Z positivo encontrado en la tdTomato saponina frente comparación levofloxacino (lo que implica una diferencia significativa en el número de bacterias en dos condiciones donde las bacterias no deben replicar). Este resultado puede explicarse por la lisis de saponina causando una señal de fluorescencia fuerte, cuya cola se detecta como emisión tdTomato, y por lo tanto conduce a una diferencia espuria entre la saponina y los controles a los antibióticos. Por lo tanto, mientras que el lux bacteriano y reporteros mNeptune2 en combinación con fluorescencia aparecen utilizable para de doble lectura,, ensayos en tiempo real basada en la solución, la tdTomato y la combinación de fluorescencia, por lo menos sin más deconvolución matemática de la señal, no lo hace.

La Figura 3 muestra publicó anteriormente ejemplos de curvas de dosis-respuesta de antimicrobianos conocidos usando operón lux, organismos marcado con indicador. ⁶ En particular, Legionella haceno crecer en medio de cultivo tisular. Por lo tanto, la replicación de las bacterias en ensayos de infección de macrófagos representa únicamente el crecimiento intracelular. Sin embargo, Legionella crecerá axenically en un bajo contenido de sodio especializado,, ACES - líquidos medio de extracto de levadura (N (2-acetamido) -2-aminoetanosulfónico). Se compararon ²⁰ Aquí efectos sobre el crecimiento intracelular y axénicos. El uso de estos dos sistemas de crecimiento, se observó que los antimicrobianos polares tales como betalactámicos (meropenem, ceftriaxona) y aminoglucósidos (datos no mostrados) son inhibidores pobres de crecimiento intracelular, en contraste con sus potentes efectos sobre el crecimiento axénicos. Presumiblemente pobre eficacia en ensayos de infección de macrófagos se basa en la incapacidad de acceder al nicho replicativo intracelular Legionella. En contraste, los antimicrobianos de células penetrante eucariotas tales como las quinolonas (levofloxacino) y azitromicina, demostraron potentes efectos sobre ambas bacterias intracelulares y axénicos.

50 (concentración de 50% de inhibición del crecimiento bacteriano) y CC ₅₀ (concentración que induce 50% de muerte celular eucariota) se puede determinar, y la selectividad, CC ₅₀ / IC _50, calculado. Las tres medidas son criterios importantes para la progresión del compuesto en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos. La Figura 4 muestra un ejemplo de tales curvas, doble dosis-respuesta en respuesta a la antibiótico doxiciclina, los datos obtenidos a partir de los mismos pozos de detección en el tiempo. En la Figura 4A, en el día 1 de la infección, de una replicación bacteriana de cien veces es evidente en los pocillos de ensayo de antibióticos cero en comparación con los más altos niveles de inhibición observados con antibiótico. No hubo toxicidad asociada célula eucariota mínima, excepto a muy alta doxycyconcentraciones Cline (≥10 g / ml). En el día 2 (Figura 4B), la señal de lux bacteriano fue de aproximadamente 10 veces mayor que 1 día con una significativa citotoxicidad de replicación asociado bacteriana observada a bajas concentraciones antimicrobianas. Como era de esperar, bacteriana muerte de la célula huésped la replicación inducida sigue muy de cerca con el número de bacterias (señal lux) a lo largo de la curva de dosis-respuesta antimicrobiana. A concentraciones más altas antimicrobianos citotoxicidad se reduce a la línea de base, hasta concentraciones muy altas, en los que la doxiciclina de nuevo aparece tóxico como se observa en el día 1. El desplazamiento aparente de la luminiscencia de dosis-respuesta hacia concentraciones antimicrobianas ligeramente mayor en comparación con las mediciones de citotoxicidad basado en fluorescencia es algo exagerado al trazar la luminiscencia y la citotoxicidad en escalas logarítmicas y lineales, respectivamente, como se muestra. IC ₅₀ para el crecimiento bacteriano fue de aproximadamente 100 ng / ml, mientras que CC ₅₀ fue de aproximadamente 10 mg / ml, 50 descrito previamente para el tratamiento de doxiciclina del linaje de leucocitos, HL-60 línea celular. ²¹ Por lo tanto, la selectividad global determinada en este experimento de doble lectura fue de aproximadamente 100.

La Figura 5 muestra publicó anteriormente isocontorno isobologramas asociados con pruebas de sinergia de dos dimensiones en el que se probaron combinaciones pareadas de antimicrobianos para efecto mejorado contra intracelular L. pneumophila. ⁶ Aunque isobologramas estándar conectan las concentraciones más bajas combinatorias de antibióticos que inhiben completamente el crecimiento, optamos, en base a los datos cuantitativos disponibles inhibitorios, para conectar los puntos con niveles similares de inhibición utilizando isocontours. El derecho más isocontorno en estos diagramas se corresponde con la línea isobolograma estándar. isobologramas cóncavas generalmente indican sinergia, mientras convexa isobologramas generallY indica la indiferencia o antagonismo. Ejemplos de sinergia (paneles AC) y la indiferencia se muestran (DF), en este caso correspondientes a valores de índice FIC de <0,5 y ≥1, respectivamente. ⁶

Es de destacar que las combinaciones de pares de azitromicina, minociclina y rifampicina demostraron sinergia. Por lo tanto, estos agentes fueron probados juntos en combinación de tres vías, como se muestra en la Figura 6 ^6. Aquí, una superficie se ha elaborado para conectar las concentraciones más bajas combinatorias de los tres antimicrobianos que llevaron a> 99% de inhibición de crecimiento intracelular bacteriano. La superficie de forma cóncava observado, por sí mismo sugestivo de sinergia tridimensional, correspondió a un índice FIC baja (0,325) indicativa del efecto de sinergia sustancial.

Tabla 1: Z 'para lux operón-informeer, la comparación de controles positivos y negativos Legionella Infección. Z 'corresponden a los puntos de datos mostrados en la Figura 2A, 2B. Esta tabla ha sido modificado a partir de Chiaraviglio y Kirby 2014. ⁴ luminiscencia positiva Z '> 0,25 se destacan con caracteres de color amarillo sobre un fondo negro.

Tabla 2: Z 'para mNeptune2-reporter, infección por Legionella - comparación de controles positivos y negativos. Z 'corresponden a los puntos de datos mostrados en la Figura 2C, 2D. Positivo mNeptune2 fluorescencia Z '> 0,25 se resalten con caracteres rojos.

Tabla 3: Z 'para tdTomato-reportero, infección por Legionella - comparación de controles positivos y negativos. Positivo tdTomato fluorescencia Z '> 0,25 se resalten con caracteres rojos. Falso positivo Z '> 0,25 en relación con superposición de SYTOX Verde y emisión tdTomato se resalten con caracteres verdes.

Figura 1: Representación gráfica de la preparación de las pruebas de doble reportero. (A) resiembra de las células J774A.1 cultivadas en suspensión en placas de 384 pocillos. (B) La adición de compuestos de interés para microplacas. (C) la infección simultánea y adición de colorantes de unión a ácidos nucleicos; incubación; y lectura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura Ure.

Figura 2: Dual, la lectura en tiempo real de crecimiento bacteriano intracelular y la citotoxicidad eucariota en formato de alto rendimiento. Señales correspondientes fluorescente (B) de luminiscencia (A) y durante la infección intracelular de células J774A.1 con lux operon-expresión de Legionella pneumophila. Señales correspondientes fluorescente (D) proteína fluorescente (C) y durante la infección intracelular de células J774A.1 con mNeptune2-expresión de Legionella pneumophila. Se muestran cuatro tratamientos: testigo DMSO negativo ( ); control de citotoxicidad positivo, saponina ( ); y bacterianas controles positivos de inhibición del crecimiento, la azitromicina (to 4 "src =" / files / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) y levofloxacina ( ). Los puntos representan la media y la desviación estándar de 96 repeticiones realizadas en placas por duplicado, de 384 pocillos. Nota, las barras de error la desviación estándar para algunos puntos de datos fueron mínimas y por lo tanto oculta dentro de los símbolos de puntos de datos. Los paneles A y B se han modificado a partir de Chiaraviglio y Kirby 2014. ⁴ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Los ejemplos representativos de los ensayos de una dimensión, de dosis-respuesta. Células J774A.1 se infectaron con operón que expresan, lux L. pneumophila y se trataron con una serie de diluciones de dos veces de antimicrobianos indicados (labeled como 'intracelular'). En paralelo, lux operon que expresan, Legionella se diluyeron a la misma concentración final en medio de extracto de levadura ases (AYE) y se trató con una, serie de diluciones de dos veces idéntico (etiquetado como "axénicos '). La luminiscencia se leyó dos días después de la inoculación bacteriana y se representó frente a la concentración antimicrobiana. Grupo A incluye a los antimicrobianos comúnmente utilizados para tratar la infección por Legionella. El panel B compara la actividad de los diferentes antibióticos macrólidos. Panel C incluye varias clases diferentes de agentes antimicrobianos con diferentes y, a veces en contraste intracelular y potencia axénicos. Los puntos de datos representan los promedios y las desviaciones estándar de tres pozos de prueba separados por condición. Esta cifra se ha modificado desde Chiaraviglio y Kirby 2015. ⁶ Haga clic aquí para ver una más grandeversión de esta figura.

Figura 4: Ejemplo de una de doble lectura, experimento de dosis-respuesta para la determinación de IC _50, CC ₅₀ y la selectividad. Efectos de la doxiciclina en el crecimiento celular y la citotoxicidad J774A.1 intracelular se determinaron los días 1 y 2 de la infección posterior. Los puntos de datos representan los promedios y las desviaciones estándar de tres pozos de prueba separados por condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Ejemplo de ensayos de sinergia de dos dimensiones. dil serie combinatorialuciones de pares de antimicrobianos se ensayaron para determinar la sinergia contra el crecimiento intracelular de Legionella en los macrófagos J774A.1. Isocontours líneas conectan puntos de porcentaje de inhibición similar. El isobolograma más a la derecha se conecta combinaciones con una inhibición completa del crecimiento intracelular (> 99% de reducción de la luminiscencia en comparación con los controles no tratados) y corresponde a la trama isobolograma estándar. El sombreado indica que el porcentaje de inhibición como delineado por la clave de un código de colores en cada gráfica. Isocontours de izquierda a derecha corresponden a 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 y 1% de crecimiento respecto a los controles no tratados. Esta cifra se ha modificado desde Chiaraviglio y Kirby 2015. ⁶ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ejemplo de un ensayo de sinergia de tres dimensiones. Las concentraciones más bajas combinatorias de azitromicina, la minociclina y rifampicina que dieron lugar a la inhibición del crecimiento> 99% se conectan para formar un gráfico de superficie isobolograma. Esta cifra se ha modificado desde Chiaraviglio y Kirby 2015. ⁶ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Describimos ensayos en tiempo real para la detección simultánea del crecimiento bacteriano intracelular y la citotoxicidad de la célula huésped. Hay varios pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para robusto rendimiento del ensayo, debe haber suficiente separación espectral entre lecturas bacterianas y de citotoxicidad. Tal separación es intrínseco para las combinaciones de los reporteros operón luciferasa y tintes fluorescentes de unión al ADN. Sin embargo, basándonos en nuestra experiencia (Tabla 1-3, Figura 2), el uso de la doble, la lectura fluorescente requiere señales fluorescentes superpuestas no (por ejemplo, el uso de un reportero de la proteína fluorescente roja lejana y colorante de ácidos nucleicos verde) para obtener robusta, datos basados ​​en soluciones. Por otra parte, a partir de la experiencia previa, potencialmente relacionadas con la óptica del lector disponibles o propiedades de fluorescencia solución, sólo manchas de ADN con emisión verde o naranja dieron datos utilizables de citotoxicidad, es decir, Z 'mayores de> 0,5, una medida indicativa de strong rendimiento del ensayo. ⁴ Por lo tanto, los ensayos, de doble lectura basados en soluciones son algo limitados en términos de lo que los reporteros pueden ser utilizados.

Otro paso crítico es la proporción de infectar bacterias a los macrófagos. La infección bacteriana induce la muerte de la célula huésped. Por lo tanto, demasiado alto un inóculo puede conducir a la muerte prematura de la célula huésped, los niveles relativamente bajos de replicación bacteriano, y el potencial de ofuscación de los efectos citotóxicos directos de antimicrobianos en estudio. La relación de infectar apropiada puede ser determinada empíricamente y puede depender de la virulencia de la cepa bacteriana particular bajo estudio. Una baja proporción de aproximadamente 1: 1 es un buen punto de partida. Los experimentos tales como los mostrados en la Figura 2 y en las Tablas 1-3 se realiza con varias relaciones de infección permitirán la evaluación y optimización de las condiciones para el uso en ensayos futuros. Es de destacar, por Legionella en particular, el uso de una cepa de antecedentes con NATvamente menor citotoxicidad de la célula huésped (un mutante flagelina) ⁸ contribuyó significativamente a la solidez de alto ensayo obtenido. Por otra parte, la traducción de la técnica de doble lectura a otra intracelular, sistemas patógeno-hospedador puede también requerir ajustes adicionales al protocolo de infección. Legionella no crece en un medio de cultivo de tejidos, lo que nos permite atribuir una mayor señal del informador para el crecimiento intracelular solo. Sin embargo, muchos patógenos intracelulares (por ejemplo, Brucella) pueden crecer en distintos grados tanto intracelularmente y en medio de cultivo de tejidos. Por lo tanto, pueden ser necesarias medidas adicionales, tales como el tratamiento de gentamicina y el lavado de las células huésped después de la infección inicial para reducir la replicación extracelular y permitir el examen selectivo de la capacidad de replicación intracelular. ²²

Ensayo de ampliación para su uso en el cribado y la sinergia de pruebas de alto rendimiento está asociado con su propio conjunto de desafíos. Lo más particular,Ly, se encontró que el gran número de células necesarias J774A.1 mejor podrían ser cultivadas en frascos de cultivo de tejidos de bacterias en lugar de tradicionales (véase la Figura 1). Sin embargo, para mantener la esterilidad de cultivo, se encontraron preferibles a las tapas matraz bacterianas estándar de esponja de espuma u otras tapas de filtro para estos matraces. La colocación de una pequeña plataforma de agitación dentro de una incubadora de cultivo de tejidos estándar nos permitió realizar cultivos ampliación con el equipo en la mano. Por último, el uso de sistemas automatizados de dispensación (Figuras 1A, B) facilitado en gran medida la configuración de ensayo y prueba de series de dilución combinatoria.

En particular, la detección adecuada de la replicación bacteriana se basa en la capacidad de expresar suficientemente ya sea un operón lux o proteína fluorescente en la cepa bacteriana de interés. Con este fin, hemos creado un conjunto de transposones reportero fluorescentes y operón lux conducidos por un promotor constitutivo fuerte que debe permitir famarcado de los diversos tipos de bacterias cile (Kang y Kirby, datos no mostrados). Alternativamente, para los patógenos cuya replicación intracelular prueba citotóxica para la célula huésped, las mediciones de citotoxicidad en tiempo real por sí solos pueden ser usados ​​como un sustituto para la replicación intracelular. Sin embargo, en este caso, compuestos citotóxicos e inactivos no pueden distinguirse fiablemente en un único ensayo.

La disponibilidad de tiempo real de lectura fuera proporciona una ventaja particular para los ensayos de selección de alto rendimiento. En concreto, la evitación de la evaluación del criterio de valoración del crecimiento bacteriano (formadoras de colonias unidad de determinación) ⁷ y la citotoxicidad (adición de reactivo de la viabilidad celular a la terminación del ensayo) ^23,24 elimina varios pasos experimentales y de trabajo asociado. Por otra parte, la evolución temporal fácilmente pueden seguirse en los mismos pocillos de ensayo con un aumento mínimo de esfuerzo experimental. Es importante destacar que la disponibilidad de dos tipos distintos de los reporteros de replicación bacterianos (bacteriasl operón y la proteína fluorescente lux) tiene especial importancia para el desarrollo de alto rendimiento de ensayo de cribado. En concreto, la lectura antimicrobiana de falsos positivos como resultado de la interferencia espuria con el operón lux o salida de indicador fluorescente puede abordarse mediante la utilización de dos reporteros de forma secuencial en los ensayos complementarios ortogonales en el cribado primario y secundario, respectivamente ^25. En particular, se encontró que el operón lux bacteriano fue el reportero más sensible del crecimiento bacteriano con una más o menos 20 veces a 100 veces menor límite de detección de nuestros reporteros de proteínas fluorescentes. Sin embargo, la producción lux es probable sujetos a más falsos positivos basados ​​en los varios productos de los genes y los pasos necesarios para la producción de luz. ²⁶ Más específicamente, en contraste con la prensa eucariotas solo gen de luciferasa, el operón lux bacteriana es un grupo de cinco gen que codifica tanto una enzima luciferasa de dos componentes y los genes para la síntesis endógena de sustrato de luciferasa. Seríapor lo tanto, tiene sentido utilizar el reportero operador lux en una pantalla principal para asegurar la suficiente sensibilidad, y los reporteros de la proteína fluorescente en ensayos secundarios para asegurar la especificidad.

En conjunto, la metodología descrita proporciona en tiempo real, las alternativas no destructivos hasta el punto final ensayos para la medición de la replicación bacteriana y la citotoxicidad eucariota y, por tanto, representa un simple metodológica y método versátil para la evaluación de los efectos antimicrobianos de los patógenos intracelulares.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.