Summary
ここでは、HBVのライフサイクルの初期段階をモニターするために新たに開発されたB型肝炎ウイルス（HBV）レポーター系を記載します。 インビトロ系簡略化これは、高スループットの戦略を用いて、抗HBV薬のスクリーニングに役立ちます。
Introduction
B型肝炎ウイルス（HBV）による慢性感染は、慢性肝疾患1の主要な危険因子です。現在の治療戦略は、HBV polで機能および/または感染した個体における免疫反応を活性化するだけでなく、間接的にインターフェロン刺激遺伝子機能2を介して、HBVの増殖を抑制するI型インターフェロンの投与を阻害するヌクレオチド類似体に基づいているが、これらの治療は、HBVを排除することはできませんDNA完全に3。さらに、抗POL剤に対して耐性であるHBVSの出現が懸念4です。直接ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、またはC型肝炎ウイルス（HCV）のライフサイクルの異なる段階を標的と組み合わせた抗ウイルス剤の投与は、正常抑制またはウイルス（ES）を根絶することが示されました。この考え、Hの異なるステージに直接作用する抗HBV剤の開発に類似BVのライフサイクルは、将来のHBV療法を確立するために重要です。
一般的に、標的ウイルスの単純なインビトロ培養系の確立は、抗ウイルス剤の開発を容易にします。しかしながら、抗HBV剤をスクリーニングするためのin vitro培養系の開発に少なくとも二つの障壁があります。第一は、HBV感染/増殖のための便利なインビトロ細胞培養系の欠如です。株化細胞内で増殖しているようなHIVおよびHCVなどの他のウイルス、とは異なり、原因狭い宿主範囲を含む実験的な制約のため、in vitroで HBVを育成することは困難です。このようなHBV感染、5,6に対して感受性であるヒト肝癌細胞株HepaRG、などの特定の細胞培養系の使用は、 図7は、これらの問題を克服するために開発されました。また、ウロキナーゼ-TYから分離されたPXB細胞、PEプラスミノーゲンアクチベーター、トランスジェニック/一次ヒト肝細胞（PHH）を接種したSCIDマウスに、HBV感染および複製8に感受性であることが示されました。しかし、HepaRGにおけるHBV複製のレベルは、HBV感染/複製レベルの一貫性がなく、再現性のない結果が発生する可能性があり、培養後の細胞分化状態に依存しています。 PXBは、一般に、HBV感染実験に使用されているが、その利用可能性によって制限されます。テトラサイクリン誘導HBV発現細胞株、HepAD38は、また広くHBVの複製を研究するために使用されてきたが、このシステムは、転写後ではなく、HBV感染9の入口段階で評価することができます。最近、HBVのための機能的受容体としてタウロコール酸ナトリウムのcotransportingポリペプチドの同定（NTCP）は、変数HBV培養システム10の開発を可能にしました。実際、このようなHuh7細胞などの非感受性の肝細胞におけるNTCP発現とHepG2細胞は、HBV感染10を可能にし 、従って、HBV感受性の細胞株の選択は、実験的制限の多くを解決する、拡張されました。第二の問題は、HBV感染および複製を評価するための単純なアッセイ系の欠如です。 HBV感染の評価は、通常、HBV DNA、RNAおよびタンパク質を分析することによって行われます。しかし、これらのウイルスマーカーの定量化は、多くの場合、費用がかかり、必ずしも簡単ではない時間がかかります。したがって、単純なアッセイ系の開発は、このようなレポーター遺伝子を使用するなど、HBVアッセイ系に関連する問題を克服する可能性があります。
しかしながら、HBVキャプシドにパッケージングすることができるゲノムサイズが制限されるため、 - 3.7未満kbの11 -レポーター遺伝子の大きさはできるだけ短くあるべきです。また、ウイルスの複製に必須であるゲノム全体に散在複数のシスエレメントの存在が、中に利用可能な位置を制限しますゲノムへのレポーター遺伝子のsertion。いくつかの報告は、HBVゲノム11、12、13に、HIV-1 Tatの、緑色蛍光タンパク質、およびDsRedを含む、外来遺伝子を挿入することを試みてきました。しかしながら、これらの組換えHBVSはHBV感染/複製をスクリーニングするための、またはHBV感染/複製に影響する因子のハイスループットスクリーニングのために有用ではありません。これは主に、組換えウイルスの低い生産性と非効率的なウイルス産生によって引き起こされるレポーター遺伝子の発現の低減強度です。
これらの問題を克服するために、我々は、ウイルス産生の高収率でレポーターHBVを構築しました。このウイルスは、エントリからの転写に、HBVの複製サイクルの初期段階を監視するのに非常に敏感です。それは小さい（171アミノ酸）であるため、これを達成するために、NanoLuc（NL）をマーカー遺伝子として選択した蛍光レポーターを操作クラス= "外部参照"> 14。また、NLは約ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼよりも明るく150倍、および発光反応が偽ヒット率が高スループットスクリーニングのために低くなることを示唆し、ATP非依存です。組換えHBVの生産効率は約1/5、親HBVの、および以前のHBV組換えウイルスについて報告されたレベルに似ています。それは、抗HBV剤のマススクリーニングのために使用することができるように、しかし、NLの輝度は、ウイルス生産性の問題を克服します。
初代肝細胞を用いて抗HBV剤のスクリーニングは、HepaRG、HepAD38とNTCP形質導入した肝細胞は、従来の方法（複数可）による抗HBV剤のスクリーニングに有用であるかもしれません。しかしながら、ここで説明するシステムは、簡単な取り扱い、高感度、およびスクリーニングのための低コストのような種々の利点を有します。これらの利点は、治療目的のために新たなHBV剤を開発し、同定するためのハイスループットアッセイに適しています。
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Protocol
レポータータンパク質をコードする組換えHBVの1.生産
- HepG2細胞の調製
- 細胞培養培地を準備し（10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、及び100 U / mlの非必須アミノ酸）。
- 培養液10mlのトランスフェクションの前日で10 cmのコラーゲンコートディッシュでプレート4×10 6 HepG2細胞。加湿5％CO 2インキュベーター中37℃でHepG2細胞をインキュベートします。
注：約4×10 6個のHepG2細胞を培養培地10ml中10cmのコラーゲンコートディッシュに播種されている場合、それらは次の日に70〜90％コンフルエントとなります。
- トランスフェクション
- トランスフェクションを使用してpUC1.2HBV / NL 15のpUC1.2HBVデルタイプシロン15および5μg5μgのでトランスフェHepG2細胞製造元の指示に従って試薬。
- 翌日、培地を除去し、新鮮な培養培地10mlを追加します。
- 一週間は、トランスフェクション後、50ミリリットルチューブに組換えHBVを含む培地を転送し、1.3.1に進みます。トランスフェクトされた細胞を含むプレートに新鮮な培養培地の10ミリリットルを追加します。
注：組換えHBVの産生は4週間維持されます。組換えHBVを含む培養培地は、1ヶ月間、4℃で保存することができます。
- 組換えHBVの精製
- 遠心分離による組換えHBV（5分間、2300×gで）を含有する培養培地から細胞破片を除去します。
- 0.45μmのメンブレンフィルターを通して上清を渡します。
- 培地に26％PEG / 1.5MのNaClを（130 gのNaClを49 gの0.5 M EDTAをpH8.0の1mlの1 M HEPES pHを5 mlの7.6 500 mlのポリエチレングリコール6000）の等量を追加含有する組換えHBV、穏やかに混合します。 4℃で一晩インキュベートします。
- 4℃で20分間、2300×gで遠心分離します。
- 上清を捨て、TNE（10mMトリス、50mMのNaCl、1mMのEDTA）0.5mlにペレットを溶解します。
- 5分間、2300×gで遠心分離することによってゴミを取り除きます。
- TNE 0.8 mlの20％スクロースにロード組換えHBVを含むTNEの0.5ミリリットル。
- 15℃で3時間、100,000×gで遠心分離します。
- できるだけ上清の限りを捨て、ペレットを保存します。培地を開始40mlのあたりの無血清DMEM 1ml中に再懸濁します。
- 4℃で一晩インキュベートします。
- 0.45μmのフィルターを通して濾過。 -80℃で0.5ミリリットルのアリコートとストアを準備します。
注：元のウイルスサンプルのレポータータンパク質の汚染が観察された場合、2時間を100,000×gでTNE 5〜30％のショ糖密度勾配超遠心分離によってウイルスを精製する、または往復のCsCl密度平衡化し、遠心分離50時間150,000×gでメートル1.1〜1.6グラム/ミリリットル。
組換えHBVの2.感染
- 10％FBS、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、250 / mlのG-418及び100 U / mlを補充したDMEM中のHBV感染に感受性である安定NTCP（HepG2細胞/ NTCP）15を発現する培養HepG2細胞加湿5％CO 2インキュベーター中で37℃で非必須アミノ酸。
- 感染の1日前に、プレートは約5×10 4のHepG2 /培地の0.1ミリリットルで96穴コラーゲンコートプレートにNTCP細胞14。
- 37℃の水浴中で解凍組換えHBVバイアルに残っている氷の小さなビットがあるまで。
- 以下を組み合わせることによって感染するための媒体を準備：1×リン酸で40％PEG800010μlの緩衝生理食塩水（PBS）、ジメチルスルホキシド（DMSO）2μlの、組換えHBV10μlの、新鮮な培養液の78μlの96ウェルプレートのウェルあたり。
- 96ウェルプレートの1ウェルに組換えHBV溶液100μlを加えます。
- ある日感染後、ウイルス画分から汚染レポータータンパク質を除去するために、ウェルあたり300μlのPBSに感染した細胞を3回洗浄します。
- 1週間またはそれ以下の場合は2％のDMSOを含む培地200μlに感染した細胞をインキュベートします。
3.分析
- 一週間感染後、PBSに感染した細胞を3回洗浄します。
- 感染細胞を溶解緩衝液50μlを加えます。
- 5分間培養プレートをロックし、その後5分間2000×gで遠心します。
- ルミノメータープレートにレポーター基質50μlのを追加します。
- レポーター基質を含むルミノメータープレートに細胞溶解物の20μlのを追加します。簡単にボルテックスで混和します。
- ルミノメーターでプレートを置き、15を読んで開始します。
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Representative Results
図1は、ゲノム上のHBVゲノム、転写されたRNA、ウイルスタンパク質およびそのコード領域の概略図を示します。ゲノム中のレポーター遺伝子とその位置も示されています。 図2は、レポーター遺伝子を含むHBVレポータープラスミドとヘルパープラスミドを示します。 pUC1.2HBV / NLレポーターはpUC1.2HBV 16のプレコアmRNAの転写開始部位から223から811ヌクレオチド位置を削除した後、レポーター遺伝子を挿入することによって構築しました。キャプシド形成シグナル配列における点突然変異を有するpUC1.2HBVdeltaは、部位特異的突然変異誘発PCRによって生成されました。レポータープラスミド（pUC1.2HBV / NL）とヘルパープラスミド（pUC1.2HBVdelta）はヒン DIIIおよびEcoRIで消化し、次いでゲル電気泳動に供しました。 pUCプラスミドのための3.0キロバイトと1.2HBV / NLまたは1.2HBVdelta用3.5キロバイトである期待のバンドは、 図に示されていますUREの2B。 図3は、組換えHBVに感染しNTCPを発現しているHepG2細胞を示しています。安定NTCPを発現するHepG2細胞を確立するために、HepG2細胞をpCAN-NTCP-MYCエンコーディングNTCP-mycおよびネオマイシン耐性遺伝子でトランスフェクトしました。 G418耐性細胞クローンを選択し、増殖させました。 HepG2細胞-NTCP-MYC-clone22は、HBV感染に感受性です。 HepG2細胞またはHepG2細胞-NTCP-MYC-clone22の溶解物をウェスタンブロッティングに供しました。 NTCPは2つのN結合型グリコシル化部位（Asn5及びAsn11）を含む細胞外N末端で349アミノ酸の糖タンパク質です。非グリコシル化NTCPの43 kDaのバンドおよびグリコシル化された10の65 kDaのバンドは、図3Aに示されています。 HepG2細胞-NTCP-MYC-clone22 NTCPを発現する細胞ではなく、HepG2細胞は、組換えHBV感染に感受性でした。 図4は、組換えHBVに感染したHepG2-NTCP-MYCクローンにおけるレポーター遺伝子の動態（A及びB）、ウイルスRNAおよびDNA（A）のレベルを示します図22（A）またはヒト初代肝細胞（PHH）細胞（B）。 HBV RNA、レポーター活性のレベルは、HepG2細胞-NTCP-MYC-clone22またはPHH細胞における感染後3日目に上昇しました。組換えHBVは細胞内のDNA複製経路において重要な役割を果たしている機能コアおよびpolために欠損しているのでこれとは対照的に、感染後9日目にDNAレベルでの変化はなかったです。 図5は 、B型肝炎免疫グロブリン（HBIG）、ヘパリンおよびIFN-βによる組換えHBVの阻害を示します。 IFN-βが1000 U / mlの50％未満によってレポーター活性を抑制しつつ、そのようなHBIGおよびヘパリンなどの侵入阻害剤が強く、それぞれ、75 U / mlおよび150 U / mlの10％未満によってレポーター活性を抑制しました。これらの阻害剤の阻害効果は、用量依存的でした。 図6は、HBVのライフサイクルを示しています。
Fiのグレ1：HBVゲノムとゲノム上のウイルスRNAとタンパク質の相対的な位置の概略図。 HBVのDNAは、黒でアークによって示されています。円弧上のウィルスRNAの転写のためのエンハンサーおよびプロモーターの位置は黄色で示されています。ゲノム上のウイルスRNAおよびタンパク質の位置はそれぞれ、点線の青い線（RNA）で着色矢印（タンパク質）と矢印で表されています。ウイルスRNAはサイズによって区別される：3.5キロバイトと3.4キロバイトのmRNAはそれぞれ、プリコア/ CおよびプレゲノムRNA /コアを示し、2.5および2.1 kbのRNAはそれぞれ、プレS1およびプレS2 / Sを表し、0.8 kbのRNAは、X遺伝子17を示しています。レポーター遺伝子は、コアコード配列の関連するサイズで置換されています。レポーター遺伝子は、エンハンサーIIを含有するコアプロモーターによって駆動されます。プロ：プロプロモーター、EnhI /：エンハンサーI /プロモーター、EnhII /プロ：EnhancerII /プロモーター、ポル：ポリメラーゼ、S：表面抗原。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：組換えHBVの生成のための回路図。 （A）ブルーラインは、プレゲノムのRNAを示しています。 ""ストレッチは、3 '末端にポリAを表します。青いボックスは、それぞれのウイルスタンパク質のコード領域を示します。赤いボックスは、独自の開始コドンから翻訳レポーター遺伝子を示しています。レポータープラスミドは、プレコアとポルを生成することはできません、およびキャプシド信号に2変異を含むヘルパープラスミド（CTATGTCへCTGTGCC）は、すべてのHBVタンパク質を発現します。 E：キャプシド信号。 （B）レポータープラスミド、ヘルパープラスミド及びpUCプラスミドは、 エコ RI及びヒン DIIIで消化しました。これらの消化されたプラスミドをゲル電気泳動に供しました。広告/ 54849 / 54849fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：組換えHBVはHepG2細胞NTCPを表現するに感染します。 （A）は、NTCPを発現する安定な細胞株は、3週間のG418を500μg/ mlの選択に続くMyc標識NTCPコードするプラスミドとHepG2細胞のトランスフェクションによって設立されました。 HepG2細胞におけるNTCP-mycのレベルの安定NTCP（HepG2細胞、NTCP-MYC-clone22）を発現する細胞を、抗Myc抗体（1,000倍希釈）を用いてウェスタンブロッティングによって決定しました。 （B）のHepG2-NTCP-Mycを-clone22細胞を、2％DMSO、4％PEG8000の存在下で、組換えHBVに感染させました。感染後72時間で、レポーター活性のレベルは、レポーターアッセイによって決定しました。結果は、3回の独立した実験を代表するものであり、エラーバーは番目の表示します手段の電子標準偏差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：組換えHBV感染の時間経過。 （A）のHepG2-NTCP-Mycを-clone22細胞を、2％DMSO、4％PEG8000の存在下で、組換えHBVに感染させました。 HBV感染のレベルは、感染後3,6または9日目にレポーター活性（黒線）により決定しました。 HBV RNA（青線）とDNA（オレンジ色のライン）のレベルは、同時に各感染の時点で、それぞれ、RT-PCRおよびPCR 15によって測定しました。 （B）PHHを接種したウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータートランスジェニック/ SCIDマウスから単離し、presenc組換えHBVを感染させた初代ヒト肝細胞（PHH）、2％DMSO、4％PEG8000の電子。 HBV感染のレベルは、感染後3,6、または9日目にレポーター活性によって決定しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：組換えHBV感染上の既知の抗HBV剤の効果。 HepG2細胞-NTCP-Mycを-22細胞は、組換えHBIG、示された用量でのヘパリンおよびIFN-βの存在下でHBV、ならびに2％DMSO、4％PEG8000を感染させました。 HBV複製（A）及び細胞生存率（B）のレベルは、6日目、感染後にレポーター活性によって決定しました。 HBIGは、HBV感染を中和し、ヘパリンがエンベロープウイルスの阻害剤である抗体です。結果は、3回の独立した実験、およびエラーバーの代表であります平均の標準偏差を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：HBVのライフサイクルの模式図。 HBVはNTCPなどのウイルス受容体を介して細胞内に入ります。キャプシド関連弛緩した環状DNA（rcDNA）がコーティングされていないで、核内の共有結合閉環状DNA（cccDNA）に変換します。 mRNA転写のためのテンプレートとしてcccDNA機能。ゲノムRNAは、コア及びpolのためのタンパク質で組み立てることによってウイルスキャプシドへキャプシドに包まれています。 HBSタンパク質と組み立てる前に、さらに、カプシドはプロセスによってHBV DNAを増幅に関与しているcccDNA複製プロセスと呼ばれます。 HBSタンパク質と組み立てられたウイルス粒子は、最終的に細胞外に放出されます。オム/ファイル/ ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
HBVゲノムは、コア、ポリメラーゼ、表面、およびXのORF（ 図1）を含む4つの主要なオープンリーディングフレーム（ORF）を有します。エンハンサーI 18を含むエンハンサーII、S1プロモーター、S2プロモーターおよびXプロモーターを含むプレコア/コアプロモーター：これら四つのHBVのORFの転写はしっかり4プロモーターによって調節されます。 3.5キロバイトと3.4キロバイトのmRNAは、それぞれ、プレコアおよびCoreタンパク質に翻訳されています。大エンベロープタンパク質（L）が最大のサブゲノムのmRNA（2.5キロバイト）、中（M）から製造され、小さな表面タンパク質（S）が短い転写物（2.1キロバイト）から翻訳されています。 0.8キロバイトの転写物は、Xタンパク質19、20の翻訳のためのテンプレートです。プレゲノムRNAの5 'および3'末端は、ダイレクトリピート1（DR1）、DR2およびパッケージングシグナル21、22を含む複数の機能シスエレメントが含まれています。これらの機能要素は、プレゲノムRNAにレポーターまたはマーカー遺伝子の挿入を制限します。我々は2つのベクター、レポーター遺伝子及びヘルパーベクターを含むトランスファーベクターのトランス相補性を使用して、組換えHBVを構築しました。トランスファーベクターは、レポーター遺伝子（ 図2）を有するコアおよびpol領域を置換することにより構築しました。
NTCPは、HBVのエントリ10のための細胞受容体として同定されました。 NTCP mRNAの発現は、HBV感染に感受性でないHepG2細胞において非常に低いので、我々は、NTCP-MYC（ 図3A）を発現する安定したHepG2細胞株を確立しました。 HepG2細胞の組換えHBV感染が全くレポーター活性を示さなかったのに対し、HepG2細胞におけるNTCP発現は、組換えHBV感染（ 図3B）に対する感受性を付与しました。組換えHBV感染の時間経過分析は、レポーター活性およびHBV RNAの両方がDであることを実証しました組換えHBV感染の3日以内にetectableと9日間の感染後にピークに達しました。しかしながら、増加したHBVのDNAレベル（ 図4）は観察されませんでした。このようなHBIGやヘパリンなどの侵入阻害剤は、組換えHBV感染（ 図5）を阻害しました。このシステムを示し、これらの結果は、初期転写のウイルス侵入からステージHBVの複製ではなく、DNAの複製および感染細胞から放出されたウイルスの再感染（ 図6）を監視するために使用することができます。
レポータータンパク質は、しばしば、PBSでウイルス感染した細胞を洗浄し、組換えHBVフラクションを汚染するので、3倍未満では、高いバックグラウンドをもたらすことができます。従って、組換えウイルスで処置したHBV-受けにくいHepG2細胞から培地中にレポーター活性を測定することによって、バックグラウンドレベルを確認することが重要です。バックグラウンドが高い場合、洗浄工程（3回、96ウェルプレートにウェルあたり300μlのPBSで洗浄）日BEFを追加鉱石のステップ3.1。
組換えHBVの産生が低い場合、例えば、GFPまたはDsRedのような蛍光タンパク質を発現する対照プラスミドでトランスフェクション効率をチェックします。一般的には、HepG2細胞のトランスフェクションの効率は35％以上でなければなりません。トランスフェクション効率が低い場合、高いトランスフェクション効率を達成するための具体的なトランスフェクション条件を最適化します。トランスフェクション効率が高い場合は、感染性の組換えHBV一次ヒト肝細胞を感染させるために、それを用いて製造されているかどうかを確認します。初代ヒト肝細胞にHBVの感染は、NTCPを発現肝癌細胞株よりも通常高いです。組換えHBVの効率的な感染が初代ヒト肝細胞で達成された場合、問題は、組換えHBVはないが、細胞が感染していることが。 NTCPを発現する安定したHepG2細胞クローンの数を確立し、感染性の高い細胞クローンを選択します。感染時の培養液中の低細胞集密度が悪い私になることがありnfectivity。培養物中の細胞の数を増やすと、感染効率を向上させます。 HBV感染のために、感染時にNTCPを発現するHepG2細胞のための80％〜95％の密集度は、高い感染率を提供します。
いくつかのレポーターHBVSの開発は13、多くのグループ11、12によって報告されているが、これらのレポーターHBVSのほとんどが悪く、生産性を示します。また、感染した細胞におけるレポーター活性は、高くなく、高スループットアッセイを用いて抗HBV剤をスクリーニングするために使用することは困難です。これとは対照的に、私たちのレポーターHBVシステムは、これまで報告された他のレポーターウイルスと比較して、ウイルスの比較的少量を用いて抗HBV剤のためのマススクリーニングを実施することを容易に感染した細胞で強いレポーター信号を生成します。
ここでは、初期の段階をモニターするための新規なHBVレポーター系を生成しましたHBV複製サイクル、これは感染後のレポータータンパク質の活性を測定することにより確認しました。記載の方法は、簡単、迅速、かつ費用対効果のHBVベクター系であり、ハイスループットスクリーニング法を使用して、HBVの宿主因子ならびに抗HBV化合物の同定のために有用であろう。実際、我々は、全ゲノムRNAi技術15によりHBVの宿主因子と抗HBV遺伝子を同定しました。組換えHBVは、機能コアおよびpolの製造のため欠損しているため、注目すべきは、このシステムは、このようなDNA複製段階、カプシド、ウイルスアセンブリおよび出芽としてHBV複製の後期の評価には適していません。組換えHBVのさらなる発展は、全HBVのライフサイクルを評価するために必要とされます。
要約すると、このシステムは、レポーター活性を測定することにより、HBV感染を評価するために使用することができます。したがって、例えば、PCR、RT-PCRのような複雑な分析技術を実施する必要がなく、HBVコアまたはS抗原ELISAは、HBV感染/複製を評価しました。このレポーターHBVが複製不能であるため、最終的に、感染の危険性はありません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/L EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
| Passive Lysis 5x Buffer | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | - | - | Reference 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | - | - | Reference 15 |
| pUC1.2HBV/NL | - | - | Reference 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products Organization | - | |
| IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
References
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