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Immunology and Infection

Sviluppo di un virus System Reporter dell'epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Qui si descrive un virus dell'epatite B recentemente sviluppato (HBV) sistema reporter per monitorare le prime fasi del ciclo di vita HBV. Questo semplificata nel sistema vitro sarà di aiuto nella proiezione di agenti anti-HBV utilizzando una strategia ad alto rendimento.

Introduction

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L'infezione cronica da virus dell'epatite B (HBV) è un importante fattore di rischio per le malattie croniche del fegato 1. Sebbene strategie terapeutiche attuali si basano su analoghi nucleotidici che inibiscono la funzione HBV pol e / o la somministrazione di tipo I interferon che attiva risposte immunitarie negli individui infetti nonché indirettamente sopprimere la proliferazione HBV attraverso funzioni genici stimolati 2, questi trattamenti non possono eliminare HBV DNA completamente 3. Inoltre, l'emergere di HBVs che sono resistenti agli agenti anti-Pol è di preoccupazione 4. La somministrazione di agenti anti-virali combinati rivolti direttamente le varie fasi del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) o il ciclo di vita del virus dell'epatite C (HCV) è stato dimostrato che sopprimere o eliminare il virus (es) con successo. Simile a questa idea, lo sviluppo di anti-HBV agent (s) che agiscono direttamente sulle diverse fasi di HBV ciclo di vita è importante per stabilire le future terapie HBV.

In generale, la creazione di un semplice sistema di coltura in vitro del virus destinazione facilita lo sviluppo di agenti anti-virus. Tuttavia, ci sono almeno due ostacoli allo sviluppo di sistemi di coltura in vitro per lo screening agenti anti-HBV. La prima è la mancanza di una comoda vitro sistema di coltura cellulare a HBV / proliferazione. A differenza di altri virus, come l'HIV e HCV, che si propagano in linee cellulari stabilizzate, è difficile da coltivare HBV in vitro a causa delle limitazioni sperimentali compresa una gamma ristretta ospitante. L'uso di sistemi di coltura cellulare specifici quali la linea di cellule di epatoma umano HepaRG, che è suscettibile di infezione da HBV, 5, 6, 7 sono state sviluppate per superare questi problemi. Inoltre, le cellule PXB, isolate da urochinasi-tyPE attivatore del plasminogeno transgenici / topi SCID inoculati con primari epatociti umani (PHH), hanno dimostrato di essere suscettibili di infezione da HBV e la replicazione 8. Tuttavia, i livelli di replicazione dell'HBV in HepaRG dipendono dallo stato differenziazione cellulare dopo la cultura, che può causare risultati incoerenti e non riproducibili su livelli di infezione / replicazione dell'HBV. PXB è comunemente utilizzato per esperimenti di infezione da HBV, ma è limitata dalla sua disponibilità. Una linea di cellule espressione inducibile HBV tetraciclina, HepAD38, è stato ampiamente utilizzato per studiare la replicazione dell'HBV, ma questo sistema consente solo di valutazione dopo la trascrizione e non al passo ingresso di infezione da HBV 9. Recentemente, l'identificazione di sodio taurocolato cotransporting polipeptide (NTCP) come un recettore funzionale per HBV ha consentito lo sviluppo di un sistema di coltura variabile di HBV 10. In effetti, l'espressione NTCP in cellule di epatocarcinoma non sensibili, come Huh7 eHepG2 consente HBV 10 e, quindi, la scelta delle linee cellulari sensibili HBV è stata ampliata, risolvere molti dei limiti sperimentali. Il secondo problema è la mancanza di un semplice sistema di test per valutare HBV e la replicazione. Valutazione della HBV è solitamente condotta analizzando HBV DNA, RNA e proteine. Tuttavia, la quantificazione di questi marcatori virali è che richiede tempo, spesso costosi e non sempre semplice. Pertanto, lo sviluppo di un semplice sistema di analisi, ad esempio utilizzando un gene reporter, potrebbe superare i problemi associati ai sistemi di dosaggio HBV.

Tuttavia, poiché la dimensione del genoma che può essere confezionato in un capside HBV è limitata - meno di 3,7 kb 11 - la dimensione di un gene reporter deve essere il più breve possibile. Inoltre, la presenza di più elementi cis sparsi in tutto il genoma, che sono essenziali per la replicazione virale, limita le posizioni disponibili dal serimento del gene reporter nel genoma. Diversi studi hanno tentato di inserire geni estranei, compreso l'HIV-1 Tat, proteina fluorescente verde e DsRed, in HBV genoma 11, 12, 13. Tuttavia, questi HBVs ricombinanti non sono utili per lo screening HBV / replica, o per l'high-throughput screening dei fattori che influenzano l'infezione da HBV / replica. Questo è principalmente a causa della bassa produttività dei virus ricombinanti e la ridotta intensità di espressione del gene reporter causato dalla produzione di virus inefficiente.

Per superare questi problemi, abbiamo costruito un HBV giornalista con un alto rendimento di produzione di virus. Questo virus è altamente sensibile per monitorare le prime fasi del ciclo di replicazione dell'HBV, dall'entrata alla trascrizione. Per raggiungere questo obiettivo, NanoLuc (NL) è stato scelto come gene marcatore perché è un piccolo (171 amminoacidi) progettati giornalista luminescenticlass = "xref"> 14. Inoltre, NL è di circa 150 volte più luminoso di lucciola o Renilla luciferasi, e la reazione luminescenti è ATP-indipendenti, il che suggerisce che il tasso di successo falso sarà basso per lo screening ad alto rendimento. L'efficienza produttiva del HBV ricombinante è pari a circa 1/5 del genitore HBV, e simile a livelli riportati per precedenti virus ricombinanti HBV; tuttavia, la luminosità NL supera problemi di produttività virus in modo che possa essere utilizzato per lo screening di massa di agenti anti-HBV.

Proiezione di agenti anti-HBV utilizzando epatociti primari, HepaRG, HepAD38 e epatociti NTCP-trasdotte potrebbe essere utile per lo screening di agenti anti-HBV con il metodo convenzionale (s). Tuttavia, il sistema qui descritto presenta diversi vantaggi, quali una semplice manipolazione, ad alta sensibilità e basso costo per lo screening. Questi vantaggi sono adatti per dosaggi elevati di throughput per lo sviluppo e identificare nuovi agenti HBV per scopi terapeutici.

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Protocol

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1. Produzione di ricombinante HBV codifica per la proteina Reporter

  1. Preparazione delle cellule HepG2
    1. Preparare terreno di coltura cellulare (mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 100 ml aminoacidi U / non essenziali).
    2. Piastra 4 x 10 6 cellule HepG2 in 10 cm Piatto collagene rivestite in 10 ml di mezzo di coltura il giorno prima della transfezione. Incubare le cellule HepG2 a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore.
      NOTA: Quando circa 4 x 10 6 cellule HepG2 vengono piastrate in 10 cm piatto collagene rivestite in 10 ml di mezzo di coltura, saranno 70-90% confluenti il giorno successivo.
  2. trasfezione
    1. Cellule trasfezione HepG2 con 5 mg di pUC1.2HBV Delta Epsilon 15 e 5 mg di pUC1.2HBV / NL 15 utilizzando una trasfezioneReattivo secondo le istruzioni del produttore.
    2. Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco.
    3. Una settimana dopo la trasfezione, trasferire il terreno di coltura contenente l'HBV ricombinante ad un ml tubo 50 e procedere al punto 1.3.1. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco alla piastra contenente le cellule trasfettate.
      NOTA: Produzione del HBV ricombinante viene mantenuta per 4 settimane. Il mezzo di coltura contenente HBV ricombinante può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
  3. Purificazione di HBV ricombinante
    1. Rimuovere detriti cellulari dal mezzo di coltura contenente HBV ricombinante mediante centrifugazione (2300 xg per 5 min).
    2. Passare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 micron membrana.
    3. Aggiungere un volume uguale del 26% PEG / 1,5 M NaCl (polietilenglicole 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml di 0,5 M EDTA pH 8,0 e 5 ml di 1 M HEPES pH 7.6 a 500 ml) al mezzo di coltura contenente ricombinanteHBV e mescolare delicatamente. Incubare per una notte a 4 ° C.
    4. Centrifugare a 2300 xg per 20 min a 4 ° C.
    5. Eliminare il supernatante e sciogliere il precipitato in 0,5 ml di TNE (10 mm Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. Rimuovere i detriti per centrifugazione a 2.300 xg per 5 min.
    7. Carico 0.5 ml di TNE contenente HBV ricombinante su 0,8 ml di 20% di saccarosio in TNE.
    8. Centrifugare a 100.000 xg per 3 ore a 15 ° C.
    9. Scartare tanto del surnatante possibile, e salvare il pellet. Risospendere in 1 ml di siero DMEM senza per 40 ml di mezzo di coltura di partenza.
    10. Incubare per una notte a 4 ° C.
    11. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. Preparare 0,5 ml aliquote e conservare a -80 ° C.
      NOTA: Se si osserva la contaminazione proteina reporter del campione virus originale, di purificare il virus dal gradiente di densità ultra-centrifugazione del 5-30% di saccarosio in TNE a 100.000 xg per 2 ore, o CsCl densità equilibrata centrifugazione from 1.1-1.6 g / ml a 150.000 xg per 50 ore.

2. L'infezione di HBV ricombinante

  1. Cellule Culture HepG2 stabilmente esprimenti NTCP (HepG2 / NTCP) 15 che sono suscettibili di infezione da HBV in DMEM supplementato con 10% FBS, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, 250 ug / ml di G-418 e 100 U / ml aminoacidi non essenziali a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore.
  2. Un giorno prima dell'infezione, piatto di circa 5 x 10 4 HepG2 / cellule NTCP 14 in una piastra ricoperta da 96 pozzetti di collagene in 0,1 ml di terreno di coltura.
  3. Scongelare HBV ricombinante in un bagnomaria C 37 ° fino a quando c'è un piccolo pezzo di ghiaccio che resta nel flaconcino.
  4. Preparare il mezzo di infezione combinando i seguenti: 10 ml di 40% PEG8000 in 1x tampone fosfato salino (PBS), 2 ml di dimetilsolfossido (DMSO), 10 ml di HBV ricombinante e 78 ml di terreno di coltura frescoper pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  5. Aggiungere 100 pl di soluzione di HBV ricombinante ad un pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
  6. Un giorno dopo l'infezione, lavare le cellule infettate 3 volte con 300 ml di PBS per pozzetto per rimuovere la proteina contaminante giornalista dalla frazione virus.
  7. Incubare le cellule infette in 200 ml di terreno di coltura contenente 2% DMSO per una settimana o meno.

3. Analisi

  1. Una settimana dopo l'infezione, lavare le cellule infettate 3 volte con PBS.
  2. Aggiungere 50 ml di tampone di lisi delle cellule infette.
  3. Oscillare la piastra di coltura per 5 minuti, quindi si centrifuga a 2000 xg per 5 min.
  4. Aggiungere 50 ml di substrato giornalista nella piastra luminometro.
  5. Aggiungere 20 ml di lisato cellulare ad una piastra luminometro contenente il substrato giornalista. Mescolare vortexando brevemente.
  6. Porre la piastra in luminometro e avviare la lettura 15.

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Representative Results

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La figura 1 mostra uno schema del genoma HBV, RNA trascritti, proteine del virus e la cui regione codificante sul genoma. Il gene reporter e la sua posizione nel genoma sono anche indicati. La Figura 2 mostra l'HBV plasmide reporter e helper plasmide contenente il gene reporter. Il reporter pUC1.2HBV / NL è stato costruito eliminando posizioni nucleotidiche 223-811 dal sito inizio della trascrizione del mRNA precore di pUC1.2HBV 16 e quindi l'inserimento del gene reporter. Il pUC1.2HBVdelta con mutazioni puntiformi nella sequenza segnale di incapsidamento è stato generato da sito-diretta mutagenesi PCR. Reporter plasmide (pUC1.2HBV / NL) e plasmide helper (pUC1.2HBVdelta) sono stati digeriti con Hin DIII e Eco RI, e quindi sottoposti ad elettroforesi su gel. Le bande attesi, che sono 3,0 kb per il plasmide pUC e 3,5 kb per 1.2HBV / NL o 1.2HBVdelta, sono mostrati in Figure 2B. La figura 3 mostra cellule HepG2 che esprimono NTCP infetti con HBV ricombinante. Per stabilire cellule HepG2 esprimono stabilmente NTCP, cellule HepG2 sono state trasfettate con codifica PCAN-NTCP-myc NTCP-myc e un gene resistente alla neomicina. cloni di cellule G418-resistenti sono stati selezionati ed espansi. Il HepG2-NTCP-myc-clone22 è suscettibile di infezione da HBV. I lisati di HepG2 o HepG2-NTCP-myc-clone22 sono stati sottoposti a western blotting. NTCP è una glicoproteina di 349 aminoacidi, con un extracellulare N-terminale che contiene due siti di glicosilazione N-linked (Asn5 e Asn11). Il 43 kDa banda non glicosilata NTCP e la banda 65 kDa di glicosilata 10 sono mostrati in figura 3A. cellule HepG2-NTCP-myc-clone22 esprimono NTCP, ma non le cellule HepG2, erano suscettibili di infezione da HBV ricombinante. La Figura 4 mostra la cinetica del gene reporter (A e B), RNA virus e DNA (A) livelli ricombinante HBV-infetti HepG2-NTCP-myc-clone22 (A) o cellule epatociti primari (PHH) umane (B). I livelli di HBV RNA e attività di giornalista sono stati elevati a 3 giorni dopo l'infezione in HepG2-NTCP-myc-clone22 o cellule PHH. Al contrario, non vi era alcuna variazione dei livelli di DNA a 9 giorni dopo l'infezione causa HBV ricombinante è carente per nucleo funzionale e pol che hanno un ruolo importante nella via di replicazione del DNA intracellulare. La Figura 5 mostra l'inibizione di HBV ricombinante da epatite B immunoglobuline (HBIG), eparina e IFN-β. inibitori di ingresso come HBIG ed eparina soppressi fortemente l'attività giornalista di meno del 10% a 75 U / ml e 150 U / ml, rispettivamente, mentre IFN-β soppressa dell'attività giornalista di meno del 50% a 1.000 U / ml. L'effetto inibitorio di questi inibitori era dose-dipendente. La figura 6 mostra il ciclo di vita di HBV.

Figura 1
Fi figura 1: Schema del genoma HBV e posizione relativa di RNA virus e proteine ​​sul genoma. HBV DNA è indicato da un arco in nero. La posizione del enhancer e promotori per la trascrizione degli RNA virali sull'arco viene visualizzato in giallo. La posizione di RNA virale e proteine ​​sul genoma sono rappresentati da frecce con linee blu tratteggiate (RNA) e con frecce colorate (proteine), rispettivamente. RNA virus sono discriminati in base alle dimensioni: 3,5 kb e 3,4 kb mRNA indicano rispettivamente precore / C e RNA pregemonico / Core, 2,5 e 2,1 kb RNA rappresentano rispettivamente preS1 e preS2 / S, e l'RNA 0,8 kb indica gene X 17. Un gene reporter è sostituita dalla dimensione rilevante della sequenza codificante nucleo. Il gene reporter è guidata da un promotore nucleo contenente enhancer II. Pro: Promoter, EnhI / Pro: Enhancer I / promoter, EnhII / Pro: EnhancerII / promoter, Pol: polimerasi, S: antigene di superficie. target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Schema per la generazione di HBV ricombinante. (A) le linee blu indicano l'RNA pregenome. La "A" tratto rappresenta poli A al capolinea 3'. caselle blu indicano la regione codificante per ogni proteina del virus. La scatola rossa indica un gene reporter tradotto dalla propria iniziazione codone. Il plasmide giornalista non può produrre precore e Pol, e il plasmide helper contenente 2 mutazioni nel segnale di incapsidamento (CTGTGCC a CTATGTC) esprime tutte le proteine ​​di HBV. E: segnale di incapsidamento. (B) Il plasmide reporter plasmide helper e pUC plasmide sono stati digeriti con Eco RI e Hin DIII. Questi plasmidi digeriti sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel.annuncio / 54849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: HBV ricombinante infetta HepG2 esprimere NTCP. (A) una linea cellulare stabile che esprime NTCP è stato istituito con la transfezione di cellule HepG2 con un plasmide codifica Myc-tag NTCP seguita dalla selezione con 500 mg / ml di G418 per 3 settimane. Il livello di NTCP-Myc in cellule HepG2 stabilmente che esprimono NTCP (HepG2-NTCP-Myc-clone22) cellule è stata determinata mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-Myc (1: 1000 diluizione). (B), le cellule HepG2-NTCP-Myc-clone22 sono stati infettati con HBV ricombinante in presenza di 2% DMSO e 4% PEG8000. A 72 ore dopo l'infezione, il livello di attività reporter è stato determinato mediante saggio giornalista. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti, e barre di errore mostrano °e deviazioni standard dei mezzi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Tempo corso di infezione da HBV ricombinante. Cellule HepG2-NTCP-Myc-clone22 (A) sono stati infettati con HBV ricombinante in presenza di 2% e il 4% DMSO PEG8000. Il livello di infezione HBV è stata determinata dall'attività giornalista (linea nera) a 3, 6 o 9 giorni dopo l'infezione. I livelli di HBV RNA (linea blu) e del DNA (linea arancione) sono stati contemporaneamente misurati mediante RT-PCR e PCR 15, rispettivamente, in ogni punto l'infezione. (B) epatociti umani primari (PHH), isolati da urochinasi tipo attivatore del plasminogeno transgenici topi / SCID inoculati con PHH, sono stati infettati con HBV ricombinante nel Presence del 2% DMSO e 4% PEG8000. Il livello di infezione HBV è stata determinata dall'attività reporter 3, 6 o 9 giorni dopo l'infezione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Effetto di noti agenti anti-HBV sulla infezione da HBV ricombinante. HepG2-NTCP-Myc-22 cellule sono state infettate con HBV ricombinante in presenza di HBIG, eparina e IFN-β alle dosi indicate, nonché 2% DMSO e 4% PEG8000. Il livello di replicazione dell'HBV (A) e vitalità cellulare (B) è stata determinata dall'attività giornalista 6 giorni dopo l'infezione. HBIG è un anticorpo che neutralizza l'infezione da HBV ed eparina è un inibitore i virus con involucro. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti, e barre di errore mostrare le deviazioni standard dei mezzi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: Schema del ciclo di vita HBV. HBV entra nelle cellule attraverso recettori del virus tra cui NTCP. Capside associata DNA circolare rilassato (rcDNA) è patinata e convertito in DNA circolare covalentemente chiuso (cccDNA) nel nucleo. funzioni cccDNA come modello per la trascrizione di mRNA. L'RNA genomico è encapsidated al capside del virus assemblando con le proteine ​​per il core e pol. Prima ulteriormente il montaggio con le proteine ​​HBS, il capside è coinvolto in amplificazione di HBV DNA da un processo chiamato il processo di replica cccDNA. particelle virali assemblati con proteine ​​HBS alla fine vengono rilasciati all'esterno della cellula.om / files / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il genoma HBV ha quattro principali fasi di lettura aperti (ORF), tra cui il nucleo, polimerasi, di superficie e X ORF (Figura 1). Trascrizione di questi quattro HBV ORF è strettamente regolata da quattro promotori: il promotore precore / core contenenti enhancer II, S1 promotore, promotrice S2 e X promotore contenente enhancer I 18. I 3,5 kb e 3,4 kb mRNA sono tradotti in precore e Core proteine, rispettivamente. La grande proteina busta (L) è prodotto dal più grande mRNA subgenomico (2,5 kb), e al centro (M) e le proteine ​​di superficie di piccole dimensioni (S) sono convertite dalla trascrizione più breve (2,1 kb). Il 0,8 kb trascritto è il modello per la traduzione della proteina X 19, 20. 5'e 3'estremità del RNA pregemonico contengono più elementi cis funzionali che includono la ripetizione diretta 1 (DR1), DR2 e un segnale di confezionamento 21, 22. Questi elementi funzionali limitano l'inserimento di giornalista o di marcatori geni nel RNA pregemonico. Abbiamo costruito HBV ricombinante utilizzando trans-complementazione di due vettori, un vettore di trasferimento contenente il gene reporter e un vettore aiutante. Il vettore di trasferimento è stato costruito mediante sostituzione delle regioni centrali e pol con il gene reporter (Figura 2).

NTCP è stato identificato come un recettore cellulare per l'HBV ingresso 10. Poiché l'espressione di mRNA NTCP è molto bassa nelle cellule HepG2, che non sono suscettibili di infezione da HBV, abbiamo stabilito una linea cellulare HepG2 stabile che esprime NTCP-myc (Figura 3A). Mentre infezione da HBV ricombinante di cellule HepG2 non ha mostrato alcuna attività di giornalista, espressione NTCP in cellule HepG2 conferito suscettibilità alle infezioni da HBV ricombinante (Figura 3B). L'analisi decorso dell'infezione da HBV ricombinante ha dimostrato che sia l'attività giornalista e HBV RNA sono stati detectable entro 3 giorni di infezione da HBV ricombinante e ha raggiunto un picco a 9 giorni postinfection; tuttavia, un aumento dei livelli di HBV DNA non sono stati osservati (Figura 4). Gli inibitori di ingresso, come HBIG o eparina, inibita ricombinante infezione da HBV (Figura 5). Questi risultati indicati sistema possono essere utilizzati per monitorare precoce replica fase HBV dall'entrata virus di trascrizione, ma non replicazione del DNA e la re-infezione da virus rilasciato dalle cellule infette (Figura 6).

Dal momento che la proteina reporter spesso contamina la frazione HBV ricombinante, lavare le cellule infettate dal virus con PBS meno di tre volte possono provocare un fondo elevato. Pertanto, è importante controllare il livello di fondo misurando l'attività reporter supporto dallo HepG2 HBV-unsusceptible trattati con il virus ricombinante. Se lo sfondo è alto, aggiungere una fase di lavaggio (3 volte lavando con 300 microlitri di PBS per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti) il giorno befminerale di passo 3.1.

Se la produzione del HBV ricombinante è basso, controllare l'efficienza di trasfezione con un plasmide di controllo che esprime una proteina fluorescente come GFP o DsRed. In generale, l'efficienza di trasfezione di cellule HepG2 deve essere superiore al 35%. Se l'efficienza di trasfezione è bassa, ottimizzare le condizioni di trasfezione specifiche per raggiungere efficienze elevate trasfezione. Se l'efficienza di trasfezione è alta, controllare se infettiva HBV ricombinante è prodotto da utilizzarlo per infettare epatociti umani primari. Infettività di HBV per epatociti umani primari è in genere superiore a linee cellulari di epatoma che esprimono NTCP. Se l'infezione efficiente di HBV ricombinante è raggiunto in epatociti umani primari, il problema non è l'HBV ricombinante ma le cellule infetta. Stabilire una serie di cloni stabili che esprimono HepG2 NTCP e selezionare cloni di cellule altamente infettivi. confluenza delle cellule a basso contenuto di cultura al momento della infezione può provocare un calo infectivity. Aumentando il numero di cellule nella coltura migliora l'efficienza dell'infezione. Per l'infezione da HBV, 80-95% di confluenza per le cellule HepG2 esprimono NTCP al momento dell'infezione fornisce un alto tasso di infezione.

Lo sviluppo di diversi HBVs giornalista è stata riportata da molti gruppi di 11, 12, 13, ma la maggior parte di questi HBVs giornalista mostrare scarsa produttività. Inoltre, l'attività reporter cellule infette non è così elevato, e sarebbe difficile da utilizzare per lo screening di agenti anti-HBV utilizzando un saggio ad alta prestazione. Al contrario, il nostro sistema reporter HBV produce un forte segnale giornalista nelle cellule infette che rende facile per condurre screening di massa per gli agenti anti-HBV utilizzando una quantità relativamente piccola del virus rispetto ad altri virus giornalista segnalati finora.

Qui, abbiamo generato un sistema HBV giornalista romanzo per monitorare le prime fasi diil ciclo di replicazione dell'HBV e questo è stato convalidato misurando l'attività proteina reporter dopo l'infezione. Il metodo descritto è un sistema di HBV vettore semplice, rapida e conveniente e sarà utile per l'identificazione di fattori dell'ospite HBV e composti anti-HBV utilizzando metodi di screening ad alto rendimento. In effetti, abbiamo identificato fattori dell'ospite HBV e geni anti-HBV per intero genoma tecnologia RNAi 15. Da notare, questo sistema non è adatto per la valutazione delle ultime fasi di replicazione dell'HBV come la fase di replicazione del DNA, capside e assemblaggio del virus, e germogliare, perché HBV ricombinante è carente per la produzione di un nucleo funzionale e pol. L'ulteriore sviluppo di HBV ricombinante è tenuto a valutare l'intero ciclo di vita del virus HBV.

In sintesi, questo sistema può essere utilizzato per valutare HBV misurando l'attività giornalista. Pertanto, non vi è alcuna necessità di condurre tecniche di saggio complicate come la PCR, RT-PCR,HBV Core o S antigene ELISA per valutare l'infezione da HBV / replica. Infine, perché questo reporter HBV è incompetente replica, non vi è alcun rischio di infezione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Sviluppo di un virus System Reporter dell'epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione
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Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

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