Summary
这里,我们描述了新开发的乙型肝炎病毒(HBV)报告系统来监视HBV生命周期的早期阶段。 该体外系统的简化将在使用高通量策略抗HBV剂的筛选帮助。
Introduction
乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是慢性肝病1的主要危险因素。虽然目前的治疗策略是基于抑制通过干扰素刺激基因功能2的HBV POL功能和/或激活在感染个体的免疫反应的I型干扰素的施用以及间接抑制HBV的增殖的核苷酸类似物,这些治疗不能消除HBV的DNA完全3。而且,对防聚合酶剂耐药HBVS的出现是关注4。合并的抗病毒剂直接针对人免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)的生命周期的不同步骤的管理被证明成功地抑制或根除病毒(ES)。类似这样的想法,即直接作用于H的不同阶段抗HBV剂的开发BV的生命周期是建立未来的乙肝治疗方法很重要。
在一般情况下,建立在目标病毒的体外培养系统中的简单的便于防病毒代理的发展。然而,有至少两个障碍的体外培养系统的发展,以筛选抗HBV剂。首先是缺乏一个方便的体外细胞培养HBV感染/扩散制度。不像其他的病毒,如HIV和HCV,其在建立的细胞系增殖,它是很难培养的HBV 体外因为实验的限制,包括一个窄的宿主范围的。使用具体的细胞培养系统,例如人肝癌细胞系HepaRG,这是易受HBV感染,5,6,7已经开发了克服了这些问题。此外,PXB的细胞,从尿激酶TY孤立PE纤溶酶原激活物的转基因/原发性人肝细胞(PHH)接种的SCID小鼠,被证明是容易受到HBV感染和复制8。然而,在HepaRG HBV复制的水平依赖于培养后的细胞的分化状态,这会导致HBV感染/复制水平的不一致和不可再现的结果。 PXB通常用于HBV感染实验,但是由它的可用性的限制。四环素诱导型HBV的表达细胞株,HepAD38,也被广泛用于研究HBV复制,但这种系统只允许转录后,而不是在HBV感染9的进入步骤评价。最近,牛磺胆酸钠cotransporting多肽的识别(NTCP)用作HBV的功能性受体已经允许可变的HBV培养系统10的开发。事实上,在非易感肝癌细胞如的Huh7 NTCP表达和肝癌使HBV感染10,因此,乙肝病毒易感细胞系的选择也不断扩大,解决许多实验的限制。第二个问题是缺少一种简单的测定系统来评估HBV感染和复制的。 HBV感染的评价通常是通过分析HBV DNA,RNA和蛋白质进行。但是,这些病毒标志物的定量是费时,常常是昂贵和不总是简单的。因此,一个简单的测定系统的发展,诸如使用报告基因,可能克服与HBV的测定系统相关的问题。
但是,因为可被包装成一个HBV衣壳基因组大小被限制-小于3.7 kb的11 -报告基因的大小应该尽可能地短。此外,分散在整个基因组中的多个顺式元件,其是病毒复制所必需的存在,限制了可用于在位置报道基因到基因组中的插入可以。若干报告已经试图插入外源基因,包括HIV-1的Tat,绿色荧光蛋白,和红色荧光蛋白,成HBV基因组11,12,13。然而,这些重组HBVS不是用于筛选HBV感染/复制,或用于影响HBV感染/复制因子的高通量筛选是有用的。这主要是因为重组病毒的生产效率低而造成低效病毒产生报道基因表达的降低强度的。
为了克服这些问题,我们构建了记者乙肝病毒生产的高产率。这种病毒是用于监测HBV复制循环的早期阶段,从入口到转录高度敏感。为了实现这一目标,NanoLuc(NL)被选择作为标记基因,因为它是一个小的(171个氨基酸)工程改造发光报告类=“外部参照”> 14。另外,NL是约150倍萤火虫或Renilla荧光素酶亮,和发光反应是ATP的独立的,这表明假命中率将是低的为高通量筛选。重组乙肝病毒的生产效率为约1/5的父的HBV,和类似报告以前的HBV的重组病毒的水平;然而,NL的亮度克服病毒生产率的问题,因此它可以被用于抗HBV剂的大量筛选。
使用原代肝细胞的抗HBV剂的筛查,HepaRG,HepAD38和NTCP转导的肝细胞可能是抗HBV剂通过常规方法(多个)的筛选是有用的。然而,在这里所描述的系统具有各种优点,例如简单的处理,灵敏度高,且成本低的筛选。这些优势是适用于高通量分析制定和确定新HBV药物达到治疗目的。
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Protocol
1.生产重组乙型肝炎病毒的编码蛋白质记者
- HepG2细胞的制备
- 制备细胞培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM),补充有10%胎牛血清(FBS),100U / ml青霉素,100微克/毫升链霉素和100单位/毫升的非必需氨基酸)。
- 板4×10 6个 HepG2细胞中在10ml培养基的转染前一天10厘米胶原包被的培养皿。孵育HepG2细胞于37℃在湿润的5%CO 2培养箱。
注意:当大约4×10 6个 HepG2细胞在10cm的胶原包被的培养皿铺板在10ml培养基中,它们将是70-90%汇合的第二天。
- 转
- 转染HepG2细胞pUC1.2HBV增量小量15的5微克和pUC1.2HBV / NL 15 5微克使用染试剂根据制造商的说明。
- 次日,除去培养基并加入10毫升的新鲜培养基。
- 一周转染后,将含有重组乙肝培养基转移到50ml管,并进行到步骤1.3.1。 10毫升新鲜培养基添加到含转染的细胞的板。
注:重组乙肝病毒的产量保持4周。含有重组乙肝病毒的培养基可以储存在4℃下1个月。
- 重组乙型肝炎病毒的分离纯化
- 从含有通过离心重组乙肝病毒(2300 xg离心5分钟)的培养基中除去细胞碎片。
- 通过0.45μm膜过滤器传递上清液。
- 的26%的PEG / 1.5 M氯化钠(聚乙二醇6000 130克,氯化钠49克,1 50ml的0.5M EDTA pH 8.0的和5ml的1M HEPES pH为7.6在500毫升)中加入等体积的培养基含重组HBV,轻轻混匀。在4℃孵育过夜。
- 离心2300 XG在4℃下20分钟。
- 弃去上清液并溶解沉淀在0.5ml TNE(10毫摩尔Tris,50mM NaCl中,1mM EDTA)中。
- 2,300 xg离心除去离心碎片5分钟。
- 负载0.5毫升含重组乙肝TNE的拖到TNE0.8毫升20%的蔗糖。
- 离心机在15℃100000×g下3小时。
- 丢弃尽可能多上清尽可能的,并保存沉淀。悬浮它在1毫升每40 ml起始培养基的无血清DMEM中。
- 在4℃孵育过夜。
- 通过0.45微米的过滤器过滤。在-80℃制备各取一份0.5ml和存储。
注意:如果发现原来的病毒样本的记者蛋白污染,10万XG在TNE 5-30%的蔗糖密度梯度超离心纯化病毒2小时,或来回氯化铯密度离心平衡米1.1-1.6克/毫升15万XG为50小时。
2.重组乙肝病毒感染的
- 培养HepG2细胞稳定表达NTCP(HepG2细胞/ NTCP)15易受HBV感染的DMEM补充有10%FBS,100U / ml青霉素,100微克/毫升链霉素,250微克/毫升的G-418和100U / ml的非必需氨基酸,在37℃在湿润的5%CO 2培养箱。
- 感染前一天,板约5×10 4的HepG2 / NTCP细胞14进入在0.1ml培养基中的96孔胶原包被板。
- 在37℃水浴解冻HBV重组,直到有剩余的小瓶冰小一点。
- 由以下结合制备用于感染的培养基:在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS),2微升二甲基亚砜(DMSO)中,加入10μl40%PEG8000的重组乙肝病毒的10微升和78微升新鲜培养基每一个96孔板的孔。
- 加入100微升的重组乙肝病毒溶液的96孔板的一个孔中。
- 感染后一天,洗净感染的细胞3次,用每孔300μl的PBS中,以从病毒级分除去的污染报告蛋白。
- 孵育感染细胞在200μl含有2%DMSO的一周或更少的培养基。
3.分析
- 感染后一周,洗感染的细胞3次,用PBS。
- 加入50μl裂解缓冲液的受感染的细胞。
- 摇动培养板进行5分钟,然后在2000 xg离心离心5分钟。
- 加入50微升记者基板进入光度计板。
- 加入20μl的细胞裂解物与含记者基板光度计板。涡旋简要混合。
- 放置在光度计板,并开始阅读15。
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Representative Results
图1显示了HBV基因组,转录的RNA,病毒蛋白和它们的编码区的基因组的示意图。在基因组中的报告基因和它的位置也被指示。 图2示出了包含报告基因的HBV报告质粒和辅助质粒。所述pUC1.2HBV / NL记者从pUC1.2HBV 16的前C mRNA的转录起始位点删除核苷酸位置223-811,然后插入报告基因构建。通过定点诱变PCR产生与包装信号序列的点突变的pUC1.2HBVdelta。报道质粒(pUC1.2HBV / NL)和辅助质粒(pUC1.2HBVdelta)与欣 DIII和EcoRⅠ消化,然后进行凝胶电泳。预期的条带,这是3.0kb的对的pUC质粒和3.5kb的用于1.2HBV / NL或1.2HBVdelta,显示在图URE 2B。 图3示出表示NTCP感染HBV重组HepG2细胞。要建立HepG2细胞稳定表达NTCP,HepG2细胞与PCAN-NTCP-myc基因编码NTCP-myc和新霉素抗性基因转染。被选择和扩大G418抗性细胞克隆。在HepG2细胞-NTCP-MYC-clone22容易受到HBV感染。 HepG2细胞或HepG2细胞-NTCP-myc基因-clone22的裂解物进行Western印迹。 NTCP是349个氨基酸的糖蛋白,用含有两个N-连接糖基化位点(Asn5和Asn11)的细胞外N-末端。未糖基化NTCP的43 kDa带和糖基化的10的65 kDa带示于图3A。肝癌-NTCP-MYC-clone22细胞表达的NTCP,但不HepG2细胞,均对重组HBV感染。 图4示出了报告基因的重组乙肝病毒感染的HepG2-NTCP-myc的克隆的动力学(A和B),病毒RNA和DNA(A)的水平图22(A)或人原代肝细胞(PHH)细胞(B)。 HBV的RNA和报告活性的水平3天感染的HepG2-NTCP-myc基因-clone22或PHH细胞后升高。与此相反,有感染后第9天在DNA水平没有变化,因为重组乙肝病毒是缺陷的功能核心和pol具有在细胞内DNA复制途径中起重要作用。 图5显示重组乙肝病毒的乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG),肝素和IFN-β的抑制。进入抑制剂如HBIG和肝素强烈小于10%分别75单位/毫升和150单位/毫升,抑制报告基因活性,而IFN-β在1000 U / ml的抑制报道基因活性小于50%。这些抑制剂的抑制作用是剂量依赖性的。 图6示出的HBV的生命周期。
网络连接古尔1:示意图HBV基因组和病毒RNA和蛋白质的基因组的相对位置。 HBV-DNA是通过在黑色的电弧所示。增强剂和启动子对电弧病毒RNA的转录的位置示于黄色。病毒RNA和基因组蛋白的位置由用虚线蓝线(RNA),并用彩色箭头(蛋白质),分别箭头表示。病毒的RNA按大小区分:3.5 kb和3.4 kb的mRNA表达分别表示前C / C和前基因组RNA /核心,2.5和2.1 kb的RNA的分别代表前S1前S2和/ S,以及0.8 kb的RNA表明X基因17。报告基因是由核心编码序列的相关的大小被取代。报告基因是由含有增强子第二核心启动子驱动。临:启动子,EnhI / PRO:增强I /启动子,EnhII /专业版:EnhancerII /启动,波尔:聚合酶,S:表面抗原。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图2:图示用于重组乙肝病毒的产生。 (A),蓝线表示前基因组RNA。在“A”代表伸展在3'末端聚A。蓝框表示对每种病毒蛋白的编码区。红色框指示记者基因从自身的起始密码子翻译。记者质粒不能产生前C区和Pol和包含在包装信号2突变辅助质粒(CTGTGCC到CTATGTC)表达所有HBV蛋白。 E:包装信号。 (B)中的报道质粒,辅助质粒和的pUC质粒用EcoRI和HindIII DIII消化。这些消化质粒进行凝胶电泳。广告/ 54849 / 54849fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3:重组乙型肝炎病毒感染HepG2细胞表达NTCP。 (A)中由HepG2细胞的转染与编码Myc标签NTCP的质粒随后选择用500微克/毫升G418的3周设立表达NTCP的稳定细胞系。 (:1000稀释1)NTCP-Myc在HepG2细胞水平稳定表达NTCP(肝癌,NTCP-Myc的-clone22)细胞被免疫印迹使用抗Myc抗体来确定。 (B)中的HepG2-NTCP-Myc的-clone22细胞感染在2%DMSO中和4%PEG8000的存在下重组乙肝病毒。在感染后72小时,报告活性的水平被报告测定来确定。结果代表三个独立实验,且误差棒显示第E标准的手段偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4:重组HBV感染的时间过程。 (A)中的HepG2-NTCP-Myc的-clone22细胞感染在2%DMSO中和4%PEG8000的存在下重组乙肝病毒。 HBV感染的水平通过报告基因活性(黑线)在感染后3,6或9天测定。乙肝病毒的RNA(蓝线)与DNA(橙色线)的水平同时通过RT-PCR和分别PCR 15,测定每种感染时间点。 (B)的原代人肝细胞(PHH)中,从与PHH接种尿激酶型纤溶酶原激活物的转基因/ SCID小鼠分离的,被感染的重组乙肝病毒在presenc2%DMSO和4%,PEG8000电子。 HBV感染的水平通过报告基因活性在感染后3,6,或9天测定。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5:重组HBV感染已知的抗HBV药物的影响。的HepG2-NTCP-Myc的-22细胞感染在HBIG,肝素和IFN-β在所指示的剂量存在的重组乙肝病毒,以及2%的DMSO和4%PEG8000。 HBV复制(A)和细胞活力(B)的水平通过报告基因活性感染后6天测定。 HBIG是中和乙肝病毒感染和肝素是包膜病毒抑制剂的抗体。结果代表三个独立实验,且误差棒显示装置的标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6:示意图乙肝生命周期。 HBV进入通过病毒受体的细胞,包括NTCP。衣壳相关松弛环状DNA(rcDNA)是未涂覆的,并转换成在核共价闭合环状DNA(cccDNA的)。 cccDNA的功能作为用于mRNA转录的模板。基因组RNA是由与芯和pol蛋白质组装衣壳的病毒衣壳。在进一步与HBS蛋白组装,衣壳参与由过程扩增HBV DNA称为cccDNA的复制过程。与HBS蛋白组装的病毒颗粒最终被释放到细胞外。OM /文件/ ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
HBV基因组有四个主要的开放阅读框(ORFs),包括核心,聚合酶,表面和X的ORF( 图1)。这四个HBV ORF的转录紧紧四个启动子调控:含有增强II的前核心/核心启动子,含有增强我18启动S1,S2启动子和X子。 3.5 kb和3.4 kb的mRNA的分别翻译成前C区和核心蛋白。大包膜蛋白(L)的从最大的亚基因组mRNA的(2.5kb的)产生的,而中间(M)和小的表面蛋白(S)是从短转录(2.1kb的)翻译。该0.8kb的转录物是X蛋白19,20的翻译的模板。前基因组RNA的5'和3'端包含多个功能的顺式元件,包括直接重复1(DR1),DR2和包装信号21,22。这些功能元件限制的报道分子或标记基因插入到前基因组RNA。我们通过使用两个向量,将含有报道基因和一个辅助载体的转移载体的反式互补构建重组乙肝病毒。转移载体被置换的报道基因( 图2)的芯和pol区域的构成。
NTCP被确定为乙肝条目10细胞受体。因为NTCP mRNA的表达很低在HepG2细胞中,这是不容易受到HBV感染,我们建立了表达NTCP-myc基因( 图3A)稳定的HepG2细胞系。而HepG2细胞的重组乙肝病毒感染显示没有报道分子活性,在HepG2细胞NTCP表达赋予易感性重组HBV感染( 图3B)。重组HBV感染的时间过程分析表明,这两个报告基因活性和HBV RNA的ð在重组乙型肝炎病毒感染3天etectable和第9天达到顶峰感染后;然而,增加的HBV DNA水平没有观察到( 图4)。进入抑制剂,如HBIG或肝素,抑制重组HBV感染( 图5)。表明该系统中,这些结果可以被用于监测从病毒进入到转录早期HBV的复制,但不是DNA复制和病毒的再感染从感染的细胞释放( 图6)。
由于报告蛋白经常污染了重组HBV馏分,洗涤病毒感染的细胞,用PBS小于三倍可能导致高背景。因此,通过从用重组病毒处理的HBV-不敏感的HepG2测量平台报告活性查询的背景水平是很重要的。如果背景是高,添加的洗涤步骤(3次用300微升PBS洗涤每孔在96孔板)一天BEF矿石步骤3.1。
如果生产重组乙型肝炎低,请与表达荧光蛋白,如GFP或红色荧光蛋白对照质粒转染效率。在一般情况下,HepG2细胞转染的效率应大于35%。如果转染效率是低的,优化特定转染条件,以实现高转染效率。如果转染效率高,检查感染HBV重组是否通过使用它来感染人原代肝细胞产生的。 HBV到原代人肝细胞的感染通常比与表达NTCP肝癌细胞株更高。如果重组乙肝病毒的有效感染原代人肝细胞中实现时,该问题不重组乙肝但被感染的细胞。建立一批表达NTCP稳定的HepG2克隆,并选择具有高度传染性细胞克隆。在感染时在培养低细胞汇合可能导致我差nfectivity。在培养增加的细胞数量提高感染效率。对于HBV感染,在感染时表达NTCP HepG2细胞80-95%汇合提供高感染率。
的几个记者HBVS发展已经报道许多组11,12,13,但大多数这些记者HBVS的显示生产率差。此外,在感染的细胞的报告基因活性不高,并且会难以用于使用高通量测定法筛选抗HBV剂。相比之下,我们的记者HBV系统产生在感染的细胞中,可以很容易进行大量筛选使用相比迄今报道的其他记者病毒的病毒的相当少量的抗HBV剂强烈报告信号。
这里,我们产生了一种新的HBV报告系统来监视的早期阶段HBV的复制周期,这是由感染后测定报告蛋白的活性进行验证。所描述的方法是一种简单,快速和具成本效益的HBV载体系统并且将用于通过使用高通量筛选方法鉴定HBV的宿主因素以及抗HBV化合物。事实上,我们通过全基因组RNAi技术发现了15个乙肝病毒宿主因子和抗乙肝病毒基因。值得注意的是,该系统不适合于HBV复制的后期阶段的评价,如DNA复制步骤,衣壳和病毒装配和出芽,因为重组乙肝病毒是缺陷型用于制造功能性芯和pol的。重组乙肝病毒的进一步发展是必需的,以评估整个HBV生命周期。
总之,本系统可用于通过测量报告基因活性,以评估HBV感染。因此,没有必要进行复杂的分析技术,例如PCR,RT-PCRHBV核心或S抗原ELISA来评估HBV感染/复制。最后,因为本记者HBV是复制缺陷,没有感染的危险。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
0.5 mol/L EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
Passive Lysis 5x Buffer | Promega | E1941 | |
GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
HepG2-NTCP1-myc-clone22 | - | - | Reference 15 |
pUC1.2HBV delta epsilon | - | - | Reference 15 |
pUC1.2HBV/NL | - | - | Reference 15 |
50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
HBIG | Japan Blood Products Organization | - | |
IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
References
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