Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Udvikling af en hepatitis B virus Reporter system til at overvåge tidlige stadier af Replication Cycle

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Her beskriver vi en nyudviklet hepatitis B virus (HBV) reporter-system til at overvåge de tidlige stadier af HBV livscyklus. Denne forenklede in vitro-system vil støtte i screening af anti-HBV-midler ved anvendelse af en high-throughput strategi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kronisk infektion med hepatitis B virus (HBV) er en stor risikofaktor for kroniske leversygdomme 1. Selv om den nuværende terapeutiske strategier er baseret på nukleotidanaloger, som inhiberer HBV pol funktion og / eller indgivelse af type I interferon, der aktiverer immunresponser i inficerede individer såvel som indirekte undertrykke HBV proliferation gennem interferon-stimuleret genfunktioner 2, kan disse behandlinger ikke fjerne HBV DNA helt 3. Endvidere fremkomsten af HBVs som er resistente over for anti-pol midler er til bekymring 4. Administrationen af ​​kombinerede antivirale midler direkte rettet mod de forskellige trin i human immundefekt virus (HIV) eller hepatitis C-virus (HCV) livscyklussen blev vist at kunne undertrykke eller udrydde virus (es). Svarende til denne idé, udvikling af anti-HBV middel (midler), der virker direkte på de forskellige stadier i HBV livscyklus er vigtig for etablering af fremtidige HBV behandlinger.

Generelt etablering af et simpelt in vitro-dyrkningssystem af målet virus fremmer udviklingen af anti-virus midler. Der er dog mindst to hindringer for udviklingen af in vitro dyrkningssystemer til screening anti-HBV midler. Den første er manglen på en bekvem in vitro cellekultursystem for HBV-infektion / proliferation. I modsætning til andre vira, såsom HIV og HCV, som er opformeret i etablerede cellelinjer, er det vanskeligt at dyrke HBV in vitro på grund af eksperimentelle begrænsninger, herunder et snævert værtsområde. Anvendelsen af specifikke cellekultursystemer såsom den humane hepatoma-cellelinie HepaRG, som er følsomt for HBV-infektion, 5, 6, 7, er blevet udviklet for at overvinde disse problemer. Endvidere PxB celler, isoleret fra urokinase-type plasminogenaktivator transgene / SCID mus inokuleret med primære humane hepatocyt (PHH), viste sig at være modtagelige for HBV-infektion og replikation 8. Imidlertid HBV-replikation niveauer i HepaRG er afhængige af cellulær differentiering tilstand efter dyrkning, som kan forårsage inkonsistente og ureproducerbare resultater af HBV infektion / replikering niveauer. PxB er almindeligt anvendt for HBV-infektion eksperimenter, men er begrænset af dets tilgængelighed. En tetracyclin inducerbar HBV ekspression cellelinie HepAD38, er også blevet meget anvendt til at studere HBV-replikation, men dette system tillader kun evaluering efter transkription og ikke på posten trin af HBV-infektion 9. For nylig har identificeringen af natriumtaurocholat cotransporting polypeptid (Ntcp) som en funktionel receptor for HBV muliggjorde udviklingen af en variabel HBV dyrkningssystem 10. Faktisk Ntcp ekspression i ikke-følsomme leverkarcinom celler såsom Huh7 ogHepG2 muliggør HBV-infektion 10 og således har valget af HBV modtagelige cellelinier blevet udvidet, løse mange af de eksperimentelle begrænsninger. Det andet problem er manglen på en simpel assaysystem til evaluering HBV-infektion og replikation. Evaluering af HBV-infektion udføres sædvanligvis ved at analysere HBV-DNA, RNA og proteiner. Imidlertid kvantificering af disse virus markører er tidskrævende, ofte kostbare og ikke altid enkel. Derfor er udviklingen af ​​et simpelt assay-system, såsom anvendelse af et reportergen, kan overvinde problemer i forbindelse med HBV assaysystemer.

Men fordi genomet størrelse, der kan pakkes i en HBV capsid er begrænset - mindre end 3,7 kb 11 - størrelsen af et reportergen bør være så kort som muligt. Tilstedeværelsen af ​​multiple cis elementer spredt over hele genomet, som er essentielle for viral replikation, begrænser jobs for i sertion af reportergenet i genomet. Adskillige rapporter har forsøgt at indsætte fremmede gener, herunder HIV-1-Tat, grønt fluorescerende protein, og DsRed, i HBV-genomet 11, 12, 13. Men disse rekombinante HBVs ikke anvendelig til screening af HBV-infektion / replikation, eller for high-throughput screening af faktorer, der påvirker HBV-infektion / replikation,. Dette er primært på grund af den lave produktivitet af rekombinante vira og den reducerede intensiteten af ​​reportergenekspression forårsaget af ineffektiv virusproduktion.

For at overvinde disse problemer, vi konstrueret en reporter HBV med et højt udbytte af virus produktion. Denne virus er meget følsom for overvågningen af ​​de tidlige faser af HBV-replikation cyklus, fra post til transkription. For at opnå dette, blev NanoLuc (NL) valgt som markør-gen, fordi det er et lille (171 aminosyrer) manipuleret luminescerende reporterclass = "xref"> 14. Desuden NL er cirka 150 gange lysere end ildflue eller Renilla luciferase, og det luminescerende reaktion er ATP-uafhængig, hvilket antyder, at den falske hit sats vil være lav for high-throughput screening. Produktionen effektivitet rekombinante HBV er ca. 1/5 af moderselskabet HBV, og ligner niveauer indberettet for tidligere HBV rekombinante vira; imidlertid lysstyrke NL overvinder virus produktivitet problemer, så det kan anvendes til massen screening af anti-HBV-midler.

Screening af anti-HBV midler ved anvendelse primære hepatocytter, kan HepaRG, HepAD38 og Ntcp-transducerede hepatocytter være anvendelige til screening af anti-HBV-midler ved konventionel fremgangsmåde (r). Men den her beskrevne system har forskellige fordele såsom simpel håndtering, høj følsomhed, og lave omkostninger til screening. Disse fordele er velegnede til analyser med høj kapacitet til at udvikle og identificere nye HBV agenter til terapeutiske formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Produktion af rekombinant HBV Encoding reporterproteinet

  1. Fremstilling af HepG2-celler
    1. Forbered celledyrkningsmedium (Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 100 U / ml ikke-essentielle aminosyrer).
    2. Plate 4 x 10 6 HepG2 celler i en 10-cm collagen-coatede skål i 10 ml dyrkningsmedium dagen før transfektion. Inkuber HepG2-celler ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-inkubator.
      BEMÆRK: Når ca. 4 x 10 6 HepG2-celler udplades i en 10 cm collagen-coatede skål i 10 ml dyrkningsmedium, vil de være 70-90% konfluente den næste dag.
  2. Transfektion
    1. Transfektion HepG2 celler med 5 pg pUC1.2HBV delta epsilon 15 og 5 pg pUC1.2HBV / NL 15 ved hjælp af en transfektionreagens i henhold til producentens anvisninger.
    2. Den næste dag fjernes dyrkningsmediet, og der tilsættes 10 ml frisk dyrkningsmedium.
    3. En uge efter transfektion overføre dyrkningsmedium indeholdende det rekombinante HBV til et 50 ml-rør og fortsætte til trin 1.3.1. Der tilsættes 10 ml frisk dyrkningsmedium til pladen indeholdende de transficerede celler.
      BEMÆRK: Produktion af det rekombinante HBV opretholdes i 4 uger. Kulturmediet indeholdende rekombinant HBV kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
  3. Oprensning af rekombinant HBV
    1. Fjerne cellerester fra dyrkningsmediet indeholdende rekombinant HBV ved centrifugering (2.300 x g i 5 min).
    2. Passere supernatanten gennem et 0,45 um membranfilter.
    3. Tilføj et tilsvarende volumen 26% PEG / 1,5 M NaCl (polyethylenglycol 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0, og 5 ml 1 M HEPES pH 7,6 i 500 ml) til dyrkningsmediet indeholdende rekombinantHBV og bland forsigtigt. Inkuber natten over ved 4 ° C.
    4. Centrifuger ved 2.300 xg i 20 min ved 4 ° C.
    5. Supernatanten fjernes, og pellet opløses i 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. Fjern snavs ved centrifugering ved 2300 xg i 5 min.
    7. Belastning 0,5 ml TNE indeholdende rekombinant HBV på 0,8 ml 20% sucrose i TNE.
    8. Der centrifugeres ved 100.000 x g i 3 timer ved 15 ° C.
    9. Bortskaffe så meget af supernatanten som muligt, og pellet. Resuspender den i 1 ml serumfrit DMEM per 40 ml start dyrkningsmedium.
    10. Inkuber natten over ved 4 ° C.
    11. Der filtreres gennem et 0,45 um filter. Forbered 0,5 ml portioner og opbevares ved -80 ° C.
      BEMÆRK: Hvis der observeres reporterprotein forurening af den oprindelige virus prøven, oprense virus ved densitetsgradientcentrifugering ultra-centrifugering på 5-30% sucrose i TNE ved 100.000 xg i 2 timer, eller CsCI densitet ækvilibreret centrifugering from 1,1-1,6 g / ml ved 150.000 xg i 50 timer.

2. Infektion af rekombinant HBV

  1. Kultur HepG2-celler, der stabilt udtrykker Ntcp (HepG2 / Ntcp) 15, der er modtagelige for HBV-infektion i DMEM suppleret med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 250 ug / ml G-418 og 100 U / ml ikke-essentielle aminosyrer ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-inkubator.
  2. En dag før infektion, plade ca. 5 x 10 4 HepG2 / Ntcp celler 14 i en 96-brønd collagen coatede plade i 0,1 ml dyrkningsmedium.
  3. Thaw rekombinant HBV i et 37 ° C vandbad, indtil der er en lille smule is tilbage i hætteglasset.
  4. Forbered medium for infektion ved at kombinere følgende: 10 pi 40% PEG8000 i 1x phosphatpufret saltvand (PBS), 2 pi dimethylsulfoxid (DMSO), 10 pi rekombinant HBV og 78 pi frisk dyrkningsmediumpr brønd af en 96-brønds plade.
  5. Tilsæt 100 pi rekombinant HBV-opløsning til en brønd af 96-brønds plade.
  6. En dag efter infektion, vaske de inficerede celler 3 gange med 300 pi PBS per brønd for at fjerne den kontaminerende reporter protein fra virus fraktionen.
  7. Inkuber inficerede celler i 200 pi kulturmedium indeholdende 2% DMSO i en uge eller mindre.

3. Analyse

  1. En uge efter infektion, vaske de inficerede celler 3 gange med PBS.
  2. Der tilsættes 50 pi lysepuffer til de inficerede celler.
  3. Rock dyrkningspladen i 5 minutter, og derefter centrifugeres ved 2000 xg i 5 min.
  4. Der tilsættes 50 ul af reporter substrat i luminometeret plade.
  5. Tilsæt 20 pi cellelysat til et luminometer plade indeholdende reporter substrat. Vortexes kortvarigt.
  6. Pladen anbringes i luminometeret og igangsætte læse 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 viser en skematisk afbildning af HBV-genomet, transkriberede RNA'er, virusproteiner og deres kodende område på genomet. Reportergenet og dens placering i genomet er også angivet. Figur 2 viser HBV reporterplasmidet og hjælpe-plasmid indeholdende reportergenet. Den pUC1.2HBV / NL reporter blev konstrueret ved deletion nukleotidpositioner 223-811 fra transkriptionsinitieringsstedet for prækerne-mRNA af pUC1.2HBV 16 og derefter indsætte reportergenet. Den pUC1.2HBVdelta med punktmutationer i encapsidation signalsekvensen blev genereret ved steddirigeret mutagenese PCR. Reporterplasmid (pUC1.2HBV / NL) og hjælpe-plasmid (pUC1.2HBVdelta) blev spaltet med HindIII og EcoRI, og derefter underkastet gelelektroforese. De forventede bånd, som er 3,0 kb for pUC plasmidet og 3,5 kb for 1.2HBV / NL eller 1.2HBVdelta, er vist i figure 2B. Figur 3 viser HepG2 celler, der udtrykker Ntcp inficeret med rekombinant HBV. At etablere HepG2-celler, der stabilt udtrykker Ntcp blev HepG2-celler transficeret med pCAN-Ntcp-myc kodende Ntcp-myc og et neomycin-resistent gen. G418-resistente cellekloner blev selekteret og udvidet. HepG2-Ntcp-myc-clone22 er modtagelige for HBV-infektion. De lysater af HepG2 eller HepG2-Ntcp-myc-clone22 blev udsat for western blotting. Ntcp er et glycoprotein af 349 aminosyrer, med en ekstracellulær N-terminus indeholder to N-bundne glycosyleringssteder (Asn5 og Asn11). Den 43 kDa bånd af ikke-glycosyleret Ntcp og 65 kDa bånd af glycosyleret 10 er vist i figur 3A. HepG2-Ntcp-myc-clone22 celler, der udtrykker Ntcp, men ikke HepG2-celler, var modtagelige for rekombinant HBV-infektion. Figur 4 viser kinetikken for reportergenet (A og B), virus-RNA og DNA (A) niveauer i rekombinant HBV-inficerede HepG2-Ntcp-myc-klon22 (A) eller humane primære hepatocyt (PHH) celler (B). Niveauerne af HBV-RNA og reporter-aktivitet blev forhøjet ved 3 dage efter infektion i HepG2-Ntcp-myc-clone22 eller PhH celler. I modsætning hertil var der ingen ændring i DNA-niveauer ved 9 dage efter infektion, fordi rekombinant HBV er mangelfuld for funktionel kerne og pol, der har en vigtig rolle i den intracellulære DNA-replikation pathway. Figur 5 viser inhiberingen af rekombinant HBV ved hepatitis B immunglobulin (HBIg), heparin og IFN-β. Entry inhibitorer, såsom HBIG og heparin kraftigt undertrykt reporter aktivitet med mindre end 10% ved 75 U / ml og 150 U / ml, mens IFN-β undertrykte reporter aktivitet med mindre end 50% ved 1000 U / ml. Den inhiberende virkning af disse inhibitorer var dosisafhængig. Figur 6 viser livscyklus HBV.

figur 1
Fi gur 1: Skematisk af HBV-genomet og relative placering af virus-RNA og proteiner på genomet. HBV-DNA er vist ved en bue i sort. Placeringen af ​​enhanceren og promotorer for transkriptionen af ​​virus-RNA'er på buen er vist i gul. Placeringen af ​​virale RNA'er og proteiner på genomet er repræsenteret af pile med stiplede blå linjer (RNA) og med farvede pile (proteiner), henholdsvis. Virus RNA'er diskrimineres ved størrelse: 3,5 kb og 3,4 kb mRNA'er indikerer prækerne / C og prægenomisk RNA / Core henholdsvis 2,5 og 2,1 kb RNA'er repræsenterer preS1 og preS2 / S, henholdsvis og 0,8 kb RNA angiver X-gen 17. En reportergen er substitueret med den relevante størrelse kerne kodende sekvens. Reportergenet drives af en kernepromotor indeholdende enhancer II. Pro: Promotor, EnhI / pro: Enhancer I / promotor, EnhII / Pro: EnhancerII / promotor, Pol: Polymerase, S: Surface antigen. target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Skematisk til frembringelse af rekombinant HBV. (A) Blå linjer viser pregenome RNA. "A" stretch betegner poly A ved 3'-terminalen. Blå felter angiver den kodende region for hvert virus protein. Den røde felt angiver et reportergen oversat fra egen initieringscodon. Reporterplasmidet kan ikke producere prækerne og Pol, og hjælper-plasmid indeholdende 2 mutationer i encapsidation signal (CTGTGCC til CTATGTC) udtrykker alle HBV-proteiner. E: indkapsling signal. (B) Reporterplasmidet, hjælpe-plasmid og pUC-plasmid blev fordøjet med Eco RI og HindIII. Disse spaltede plasmider blev underkastet gelelektroforese.annonce / 54.849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Rekombinant HBV inficerer HepG2, der udtrykker Ntcp. (A) En stabil cellelinie, der udtrykker Ntcp blev etableret ved transfektion af HepG2 celler med et plasmid, der koder Myc-tagget Ntcp efterfulgt af selektion med 500 ug / ml G418 i 3 uger. Niveauet af Ntcp-Myc i HepG2-celler stabilt udtrykker Ntcp (HepG2-Ntcp-Myc-clone22) celler blev bestemt ved western blotting under anvendelse af anti-myc antistoffer (1: 1000 fortynding). (B) HepG2-Ntcp-Myc-clone22 celler blev inficeret med rekombinant HBV i nærværelse af 2% DMSO og 4% PEG8000. Ved 72 timer efter infektion, blev niveauet af reporter-aktivitet bestemt ved reporter assay. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg, og fejl søjler viser the standardafvigelser af midlerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Tidsforløb af rekombinant HBV-infektion. (A) HepG2-Ntcp-Myc-clone22 celler blev inficeret med rekombinant HBV i nærværelse af 2% DMSO og 4% PEG8000. Niveauet af HBV-infektion blev bestemt ved reporter aktivitet (sort linie) ved 3, 6 eller 9 dage efter infektion. Niveauer af HBV-RNA (blå linie) og DNA (orange linje) blev samtidigt målt ved RT-PCR og PCR 15 henholdsvis på hver infektion tidspunkt. (B) Primære humane hepatocytter (PhH), isoleret fra urokinase-plasminogenaktivator transgene / SCID mus inokuleret med PHH, blev inficeret med rekombinant HBV i presence på 2% DMSO og 4% PEG8000. Niveauet af HBV-infektion blev bestemt ved reporter aktivitet ved 3, 6, eller 9 dage efter infektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Virkning af kendte anti-HBV midler på rekombinant HBV-infektion. HepG2-Ntcp-Myc-22-celler blev inficeret med rekombinant HBV i nærværelse af HBIG, heparin og IFN-β ved de angivne doser, samt 2% DMSO og 4% PEG8000. Niveauet af HBV-replikation (A) og cellelevedygtighed (B) blev bestemt ved reporteraktivitet 6 dage efter infektion. HBIG er et antistof, som neutraliserer HBV-infektion og heparin er en inhibitor for indkapslede vira. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg, og fejlsøjler viser standardafvigelser af midlerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Skematisk af HBV livscyklus. HBV træder ind i celler via virus receptorer, herunder Ntcp. Capsid-associeret afslappet cirkulært DNA (rcDNA) er ubelagt og omdannes til kovalent lukket cirkulært DNA (cccDNA) i kernen. cccDNA fungerer som en skabelon for mRNA-transkription. Det genomiske RNA indkapsles for virus capsid ved samling med proteiner til kernen og pol. Før yderligere samling med HBS-proteiner, er capsidet involveret i amplifikation HBV-DNA ved en proces kaldet cccDNA replikationsprocessen. Viruspartikler samlet med HBS-proteiner vinder frigives uden for cellen.about / filer / ftp_upload / 54.849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HBV-genomet har fire primære åbne læserammer (ORF'er), herunder kernen, polymerase, overflade og X ORF'er (figur 1). Transkription af disse fire HBV ORF'er er stramt reguleret af fire promotorer: den prækerne / kerne-promotorholdige enhancer II, S1-promotor, S2 promotoren og X-promotoren indeholdende enhancer I 18. De 3,5 kb og 3,4 kb mRNA oversættes til prækerne og Core proteiner, hhv. Den store kappeproteinet (L) er fremstillet af det største subgenomiske mRNA (2,5 kb), og den midterste (M) og små overfladeproteiner (e) er oversat fra det kortere transkript (2,1 kb). Den 0,8 kb udskrift er skabelonen for oversættelse af X protein 19, 20. 5'og 3'ender af prægenomisk RNA indeholde flere funktionelle cis elementer, der omfatter direkte gentagelse 1 (DR1), DR2 og et pakningssignal 21, 22. Disse funktionelle elementer begrænser indsættelsen af ​​reporter- eller markørgener i prægenome RNA. Vi konstruerede rekombinant HBV ved anvendelse af trans-komplementation af to vektorer, en transfervektor indeholdende reportergenet og et hjælper-vektor. Vektor overførslen blev konstrueret ved udskiftning af de centrale og pol regioner med reportergenet (figur 2).

Ntcp blev identificeret som en cellulær receptor for HBV post 10. Fordi ekspressionen af Ntcp mRNA er meget lav i HepG2-celler, som ikke er modtagelige for HBV-infektion, vi etableret en stabil HepG2-cellelinje, der udtrykker Ntcp-myc (figur 3A). Henviser rekombinant HBV infektion af HepG2-celler viste ingen reporteraktivitet, Ntcp ekspression i HepG2-celler tillagt modtagelighed for rekombinant HBV-infektion (figur 3B). Tidsforløbet af rekombinant HBV-infektion viste, at både reporter aktivitet og HBV-RNA blev detectable inden for 3 dage af rekombinant HBV-infektion og toppede ved 9 dage efter infektion; imidlertid blev forøget HBV-DNA-niveauer ikke observeret (figur 4). Entry inhibitorer, såsom HBIG eller heparin, inhiberet rekombinant HBV-infektion (figur 5). Disse resultater indikerede dette system kan anvendes til at overvåge tidligt stadium HBV-replikation fra virus indgang til transkription, men ikke DNA-replikation og reinfektion af virus frigivet fra inficerede celler (figur 6).

Da reporterproteinet ofte forurener det rekombinante HBV fraktion, vask af virusinficerede celler med PBS mindre end tre gange kan resultere i en høj baggrund. Derfor er det vigtigt at kontrollere baggrundsniveauet ved måling reporter-aktivitet i medium fra HBV-unsusceptible HepG2 behandlet med det rekombinante virus. Hvis baggrunden er høj, tilføje et vasketrin (3 gange vask med 300 pi PBS per brønd i en plade med 96 brønde) dagen befmalm trin 3.1.

Hvis produktionen af ​​det rekombinante HBV er lav, kontrollere transfektionseffektiviteten med en kontrol plasmid, der udtrykker et fluorescerende protein, såsom GFP eller DsRed. Generelt bør effektiviteten af ​​transfektion af HepG2-celler være større end 35%. Hvis transfektionseffektiviteten er lav, optimere særlige transfektionsbetingelser at opnå høje transfektionseffektiviteter. Hvis transfektionseffektiviteten er høj, kontrollere, om infektiøst rekombinant HBV frembringes ved at bruge det til at inficere primære humane hepatocytter. Infektivitet af HBV til primære humane hepatocytter er normalt højere end til hepatom cellelinjer, der udtrykker Ntcp. Hvis der opnås en effektiv infektion af rekombinant HBV i primære humane hepatocytter, er problemet ikke det rekombinante HBV men cellerne inficeret. Etablere en række stabile HepG2 kloner, der udtrykker Ntcp og vælg yderst smitsomme celle kloner. Lav cellekonfluens i kultur på tidspunktet for infektion kan resultere i ringe infectivity. Forøgelse af antallet af celler i kulturen forbedrer infektionseffektivitet. For HBV-infektion, 80-95% konfluens til HepG2 celler, der udtrykker Ntcp på tidspunktet for infektion giver en høj infektion sats.

Udviklingen af flere reporter HBVs er blevet rapporteret af mange grupper 11, 12, 13, men de fleste af disse reporter HBVs viser dårlig produktivitet. Desuden reporter aktiviteten i inficerede celler ikke er så høj, og ville være vanskelig at anvende til screening anti-HBV-midler under anvendelse af en high-throughput assay. I modsætning hertil vores reporter HBV system producerer et stærkt reporter signal i de inficerede celler, der gør det nemt at udføre masse screening for anti-HBV midler under anvendelse af en relativt lille mængde af virus i forhold til andre reportermolekyler vira rapporteret indtil nu.

Her, genereret vi en hidtil ukendt HBV reporter system til overvågning de tidlige stadier afHBV-replikation cyklus og dette blev valideret ved måling reporterproteinet aktivitet efter infektion. Den beskrevne fremgangsmåde er en enkelt, hurtig og omkostningseffektiv HBV vektorsystem og vil være nyttige til identifikation af HBV-vært faktorer samt anti-HBV-forbindelser ved hjælp af høj-throughput screeningsmetoder. Faktisk vi identificeret HBV vært faktorer og anti-HBV gener ved hel-genom RNAi teknologi 15. Af note er dette system ikke egnet til evaluering af de sene stadier af HBV-replikation, såsom DNA-replikation trin, capsid, og virus montage og knopskydning, fordi rekombinant HBV er mangelfuld til fremstilling af en funktionel kerne og pol. Den videre udvikling af rekombinant HBV er forpligtet til at evaluere hele HBV livscyklus.

Sammenfattende kan dette system anvendes til at evaluere HBV-infektion ved måling reporteraktivitet. Derfor er der ikke behov for at foretage komplicerede assayteknikker, såsom PCR, RT-PCR,HBV kerne eller S-antigen ELISA for at vurdere HBV-infektion / replikation. Endelig fordi denne reporter HBV er replikationsinkompetent, er der ingen risiko for infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
Udvikling af en hepatitis B virus Reporter system til at overvåge tidlige stadier af Replication Cycle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter