Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

כאן אנו מתארים מערכת הכתב החדש שפותח הפטיטיס B וירוס (HBV) לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור החיים HBV. זה פשוט יותר במערכת במבחנה יסייע ההקרנה של תרופות אנטי-HBV משתמש באסטרטגיה תפוקה גבוהה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זיהום כרוני בנגיף הפטיטיס B (HBV) מהווה גורם סיכון עיקרי למחלות כבדות כרונית 1. למרות אסטרטגיות טיפוליות נוכחיות מבוססות על אנלוגים נוקלאוטיד המעכבות פונקצית pol HBV ו / או הממשל של אינטרפרון מסוג I שמפעיל מערכת חיסונית אצל אנשים נגועים וכן בעקיפין התפשטות HBV דיכוי באמצעות פונקציות גן מגורה אינטרפרון 2, טיפולים אלה לא יכולים לחסל HBV DNA לחלוטין 3. יתר על כן, הופעתה של HBVs כי הם עמידים בפני סוכני-Pol אנטי היא דאגה 4. הממשל של תרופות אנטי-ויראליות בשילוב ישירות מיקוד השלבים השונים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) או הפטיטיס C וירוס מחזור החיים (HCV) הוצגה לדכא בהצלחה או למגר את הנגיף (es). דומה לרעיון זה, פיתוח חומר נוגד-HBV (ים) אשר פועל ישירות על השלבים השונים של Hמחזור החיים BV חשוב לביסוס טיפולים HBV בעתיד.

באופן כללי, הקמת פשוט במערכת התרבות חוץ גופית של הנגיף היעד מקל על הפיתוח של תרופות אנטי-וירוס. עם זאת, ישנם לפחות שני מחסומים לפיתוח מערכות תרבות במבחנה להקרין תרופות אנטי-HBV. הראשון הוא העדר מערכת תרבית תאים נוח במבחנה עבור זיהום HBV / התפשטות. שלא כמו וירוסים אחרים, כגון HIV HCV, אשר מופצים בשורות תאים הוקמו, קשה לטפח HBV במבחנה בשל מגבלות ניסוי כוללים מגוון מארח צר. השימוש במערכות תרבית תאים ספציפיות כגון שורת תאי hepatoma אדם HepaRG, שהוא רגיש לזיהום HBV, 5, 6, 7 פותחו כדי להתגבר על בעיות אלה. יתר על כן, תאי PXB, מבודדים מן-טאי האוריקינאזמהונדס activator plasminogen PE / עכברים SCID מחוסן עם hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH), הוצגו להיות רגישים לזיהום HBV ושכפול 8. עם זאת, רמות שכפולות HBV ב HepaRG תלויות מדינת ההתמיינות אחרי התרבות, אשר יכול לגרום לתוצאות עקביות irreproducible של רמות HBV זיהום / שכפול. PXB משמש בדרך כלל ניסויי זיהום HBV אך מוגבל בגלל זמינותו. שורת תאי ביטוי HBV מושרה טטרציקלין, HepAD38, גם נעשתה שימוש נרחב ללמוד שכפול HBV, אבל מערכת זו מאפשרת רק הערכה לאחר שעתוק ולא צעד כניסת HBV זיהום 9. לאחרונה, זיהוי של פוליפפטיד cotransporting נתרן taurocholate (NTCP) כמו קולטן פונקציונלי עבור HBV אפשרה פיתוח של מערכת התרבות משתנה HBV 10. אכן, ביטוי NTCP בתאי hepatocarcinoma שאינם רגישים כגון Huh7 וHepG2 מאפשרת זיהום HBV 10 וכך, הבחירה של שורות תאים רגישים HBV הורחבה, לפתרון רב מהמגבלות ניסיון. הבעיה השנייה היא חוסר מערכת assay פשוט להעריך זיהום HBV ושכפול. הערכת זיהום HBV מתבצעת לרוב על ידי ניתוח HBV DNA, RNA וחלבונים. עם זאת, כימות של סמנים אלה של הווירוס הוא גוזל זמן, לעתים קרובות יקר ולא תמיד פשוט. לכן, הפיתוח של מערכת assay פשוטה, כגון שימוש גן כתב, אולי להתגבר על בעיות הקשורות במערכות assay HBV.

עם זאת, מכיוון שהגודל הגנום כי ניתן לארוז לתוך קפסיד HBV מוגבל - פחות מ -3.7 kb 11 - בגודל של גן כתב צריך להיות קצר ככל האפשר. יתר על כן, נוכחותם של אלמנטי ציס מרובים הפזורים לאורך הגנום, שחיוניים שכפול נגיפי, מגבילה את המשרות פנויות ב sertion של גן הכתב לתוך הגנום. כמה דיווחים ניסו להכניס גנים זרים, כולל HIV-1 טאט, חלבון פלואורסצנטי ירוק, DsRed, לתוך הגנום HBV 11, 12, 13. עם זאת, HBVs רקומביננטי אלה אינם יעילים לסינון HBV זיהום / שכפול, או להקרנת התפוקה הגבוהה של גורמים המשפיעים HBV זיהום / שכפול. זאת בעיקר בגלל הפריון הנמוך של וירוסים רקומביננטי והעוצמת המופחתים של ביטוי גני כתב הנגרם על ידי ייצור וירוס יעיל.

כדי להתגבר על בעיות אלה, בנינו HBV כתב עם תשואה גבוהה של ייצור וירוס. וירוס זה רגיש מאוד לניטור בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול HBV, מן הכניסה שעתוק. כדי להשיג זאת, NanoLuc (NL) נבחר גן סמן בגלל זה הוא (חומצות אמינו 171) קטנות מהונדסות כתב זורחclass = "Xref"> 14. יתר על כן, NL הוא כ 150-לקפל בהירים יותר גחלילית או בלוציפראז Renilla, והתגובה הזורחת היא ATP-עצמאית, דבר המצביעה על כך אחוזי הצלחת השווא יהיו נמוכים להקרנת תפוקה גבוהה. יעילות הייצור של HBV רקומביננטי הוא כ 1/5 של ההורה HBV, ובדומה לרמות דיווחו לאיתור וירוסים הקודם רקומביננטי HBV; עם זאת, את הבהירות של NL מתגברת בעיות פריון וירוס, כך שהוא יכול לשמש להקרנה ההמונית של תרופות אנטי-HBV.

הקרנת חומרים אנטי-HBV באמצעות hepatocytes העיקרי, HepaRG, HepAD38 ו hepatocytes-transduced NTCP יכול להיות שימושי לצורך ההקרנה של תרופות אנטי-HBV ידי השיטה המקובלת (ים). עם זאת, המערכת המתוארת כאן יש יתרונות שונים כגון טיפול פשוט, רגישות גבוהה, ועלות נמוכה להקרנה. יתרונות אלה מתאימים מבחני תפוקה גבוהים לפתח אילו חומרי HBV חדשים למטרות טיפוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפקה 1. של HBV רקומביננטי המקודד את החלבון Reporter

  1. הכנת התאים HepG2
    1. כן בינוני תרבית תאים (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עובר (FBS), 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 100 U / ml חומצות אמינו חיוניות).
    2. פלייט 4 x 10 6 תאים HepG2 בצלחת 10 ס"מ מצופה קולגן 10 מ"ל של מדיום תרבות יום לפני transfection. דגירת תאי HepG2 ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור humidified 5%.
      הערה: כאשר כ 4 x 10 6 תאים HepG2 הם מצופה בצלחת 10 ס"מ מצופה קולגן 10 מ"ל של מדיום תרבות, הם יהיו ומחוברות% 70-90 למחרת.
  2. transfection
    1. Transfect HepG2 תאים עם 5 מיקרוגרם של דלתא pUC1.2HBV אפסילון 15 ו -5 מיקרוגרם של pUC1.2HBV / NL 15 באמצעות transfectionמגיב בהתאם להוראות היצרן.
    2. למחרת, להסיר את המדיום התרבות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום תרבות טריים.
    3. שבוע לאחר transfection, להעביר את המדיום תרבות המכיל את HBV רקומביננטי לצינור מ"ל-50 לבין המשך לשלב 1.3.1. הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבות טרי לצלחת המכיל את התאים transfected.
      הערה: הפקה של HBV רקומביננטי נשמרת למשך 4 שבועות. מדיום התרבות המכיל HBV רקומביננטי יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש.
  3. טיהור של HBV רקומביננטי
    1. סור פסול תא ממדיום התרבות המכיל HBV רקומביננטי על ידי צנטריפוגה (2,300 XG במשך 5 דקות).
    2. להעביר את supernatant דרך פילטר קרום 0.45 מיקרומטר.
    3. הוסף נפח שווה של 26% PEG / 1.5 M NaCl (פוליאתילן גליקול 6000: 130 גרם, NaCl, 49 גרם, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA pH 8.0 ו -5 מ"ל של 1 M HEPES pH 7.6 ב 500 מ"ל) עד ​​בינוני התרבות רקומביננטי המכילHBV ומערבבים בעדינות. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. צנטריפוגה ב 2,300 XG במשך 20 דקות ב 4 °.
    5. בטל supernatant ו לפזר את גלולה ב 0.5 מ"ל של TNE (10 מ"מ טריס, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. הסר את הפסולת על ידי צנטריפוגה ב 2300 XG במשך 5 דקות.
    7. טען 0.5 מ"ל של TNE המכיל HBV רקומביננטי על סוכרוז 0.8 מ"ל של 20% ב TNE.
    8. צנטריפוגה ב 100,000 g × 3 שעות ב 15 מעלות צלזיוס.
    9. מחק כמה שיותר supernatant ככל האפשר, ולשמור גלולה. Resuspend זה ב 1 מ"ל של DMEM חופשית בסרום לכל 40 מ"ל של החל בינוני תרבות.
    10. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    11. סינון דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. הכן 0.5 מ"ל aliquots ולאחסן ב -80 ° C.
      הערה: אם זיהום חלבון הכתב של מדגם וירוס המקורי הוא ציין, לטהר את הנגיף על ידי צנטריפוגה אולטרה-שיפוע צפיפות של סוכרוז 5-30% TNE ב 100,000 XG במשך 2 שעות, או צנטריפוגה equilibrated צפיפות CsCl הלוך ושובמ 1.1-1.6 גרם / מ"ל ​​ב 150,000 XG במשך 50 שעות.

2. זיהום של HBV רקומביננטי

  1. HepG2 תרבות תאים המבטאים NTCP ביציבות (HepG2 / NTCP) 15 כי הם רגישים לזיהום HBV DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 250 מיקרוגרם / מ"ל G-418 ו- 100 U / ml חומצות אמינו חיוניות על 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO 2 humidified.
  2. יום אחד לפני ההדבקה, צלחת כ 5 x 10 4 HepG2 / תאים NTCP 14 לתוך צלחת מצופה 96-גם הקולגן 0.1 מ"ל של מדיום תרבות.
  3. HBV רקומביננטי הפשרה באמבט מי 37 ° C עד שיש קצת קטן של קרח שנותר הבקבוקון.
  4. הכן את המדיום עבור זיהום על ידי שילוב של הבאים: 10 μl של 40% PEG8000 ב בופר פוספט 1x (PBS), 2 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO), 10 μl של HBV רקומביננטי ו -78 μl של המדיום תרבות טרילכל גם צלחת 96-היטב.
  5. הוספת 100 μl של פתרון HBV רקומביננטי כדי היטב אחד של הצלחת 96-היטב.
  6. יום אחד לאחר ההדבקה, לשטוף את התאים הנגועים 3 פעמים עם 300 μl PBS לכל היטב כדי להסיר את חלבון הכתב המזהם מן שבר הווירוס.
  7. דגירת תאים נגועים 200 μl של מדיום התרבות המכיל DMSO 2% למשך שבוע או פחות.

.3 ניתוח

  1. שבוע לאחר ההדבקה, לשטוף את התאים הנגועים 3 פעמים עם PBS.
  2. הוסף 50 μl של חיץ תמוגה אל התאים הנגועים.
  3. רוק הצלחה התרבות במשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות XG ב 2000 למשך 5 דקות.
  4. הוסף 50 μl של המצע כתב לתוך צלחת luminometer.
  5. הוסף 20 μl של lysate התא לצלחת luminometer המכיל את המצע הכתב. מערבבים על ידי vortexing בקצרה.
  6. מניחים את הצלחת luminometer וליזום קריאה 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1 מציג סכמה של הגנום HBV, RNAs עבד, חלבוני וירוס ובאזור הקידוד שלהם על הגנום. גן הכתב ומיקומו בגנום מסומן גם. איור 2 מציג את פלסמיד כתב HBV ו עוזרים פלסמיד המכיל את הגן המדווח. כתב pUC1.2HBV / NL נבנה על ידי מחיקת עמדות נוקלאוטיד 223-811 מאתר ייזום שעתוק של mRNA preCore של pUC1.2HBV 16 ולאחר מכן החדרת גן הכתב. PUC1.2HBVdelta עם מוטציות נקודתיות ברצף encapsidation האות נוצר על ידי PCR mutagenesis באתר ביים. פלסמיד Reporter (pUC1.2HBV / NL) ו פלסמיד עוזר (pUC1.2HBVdelta) היו מתעכל עם הין dIII לאקו RI, ולאחר מכן נתון ג'ל אלקטרופורזה. הלהקות הצפויות, שהן 3.0 kb עבור פלסמיד PUC ו -3.5 kb עבור 1.2HBV / NL או 1.2HBVdelta, מוצגות בתרשים2B יור. איור 3 מראה תאים HepG2 להביע NTCP נגוע HBV רקומביננטי. כדי להקים תאים HepG2 להביע NTCP ביציבות, תאים HepG2 היו transfected עם NTCP-myc קידוד pCAN-NTCP-myc ו גן עמיד neomycin. G418 עמיד שיבוטי תא נבחרו והרחיבו. HepG2-NTCP-myc-clone22 הוא רגיש לזיהום HBV. את lysates של HepG2 או HepG2-NTCP-myc-clone22 היו נתונים המערבי סופג. NTCP הוא גליקופרוטאין של 349 חומצות אמינו, עם אתרי glycosylation N הסופית- תאי המכיל שני N-linked (Asn5 ו Asn11). הלהקה 43 kDa של unglycosylated NTCP והלהקה 65 kDa 10 glycosylated מוצגים איור 3 א. תאים HepG2-NTCP-myc-clone22 להביע NTCP, אבל לא התאים HepG2, היו רגישים לזיהום HBV רקומביננטי. איור 4 מראה את קינטיקה של הגן הכתב (A ו- B), RNA וירוס ו- DNA (א) רמות נגוע-HBV רקומביננטי HepG2-NTCP-myc-שיבוט22 (א) או hepatocyte העיקרי אדם (PHH) תאים (B). רמות HBV RNA ופעילות הכתב היו גבוהות ב 3 ימים לאחר ההדבקה ב HepG2-NTCP-myc-clone22 או תאים PHH. לעומת זאת, לא חל שינוי ברמות ה- DNA ב 9 ימים לאחר ההדבקה מכיוון HBV רקומביננטי לוקה עבור ליבת pol פונקציונליות שיש תפקיד חשוב במסלול שהכפול הדנ"א התאי. איור 5 מראה את עיכוב של HBV רקומביננטי ידי גלובולין הפטיטיס B החיסון (HBIG), הפרין ו- IFN-β. מעכבי כניסה כגון HBIG ו הפרין מאוד דיכא את הפעילות הכתב על ידי פחות מ -10% ב -75 U / ml ו -150 U / ml, בהתאמה, בעוד IFN-β דיכא את הפעילות הכתב על ידי פחות מ 50% ב 1000 U / ml. ההשפעה המעכבת של מעכבים אלה הייתה תלויה במינון. איור 6 מציג את מחזור החיים של HBV.

איור 1
אלחוטי איור 1: סכמטי של הגנום HBV ומיקום היחסי של RNA וירוס וחלבונים על הגנום. HBV DNA מוצג על ידי קשת בשחור. מיקומו של המשפר ומקדם עבור השעתוק של RNA וירוס על הקשת מוצג בצהוב. המיקום של RNAs וחלבונים נגיפיים על הגנום מיוצגים על ידי חיצים עם קווים כחולים המקווקו (RNA) עם חצים צבעוניים (חלבונים), בהתאמה. RNAs וירוס מופלים על ידי גודל: 3.5 קילו ו 3.4 mRNAs kb מצביעים PreCore / C ו- RNA pregenomic / Core, בהתאמה, 2.5 ו -2.1 RNAs kb מייצגים preS1 ו preS2 / S, בהתאמה, ואת RNA 0.8 kb מציין גן X 17. גן כתב מוחלף על ידי הגודל הרלוונטי של רצף קידוד ליבה. גן הכתב הוא מונע על ידי אמרגן ליבה המכיל שפר שני. פרו: היזם, EnhI / Pro: Enhancer I / אמרגן, EnhII / Pro: EnhancerII / אמרגן, Pol: פולימראז, S: אנטיגן Surface. Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: סכמטי עבור הדור של HBV רקומביננטי. (א) קווים כחולים מציינים את RNA pregenome. "A" למתוח מייצג פולי בתחנה הסופית 3'. הקופסאות הכחולות מצביעים באזור קידוד עבור כל חלבון נגיפי. תיבת אדום מציינת גן כתב המתורגם קודון חניכה משלה. הפלסמיד הכתב אינו יכול לייצר PreCore ו Pol, ואת הפלסמיד עוזר המכיל 2 מוטציות האות encapsidation (CTGTGCC כדי CTATGTC) מבטא כל החלבונים HBV. E: אות encapsidation. (ב) פלסמיד הכתב, פלסמיד המתערב פלסמיד Puc היו מתעכלים עם אקו RI ו ין dIII. פלסמידים מתעכלים אלה היו נתונים ג'ל אלקטרופורזה.המודעה / 54,849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: HBV רקומביננטי מדביק HepG2 להביע NTCP. (א) שורת תאים יציבה מביע NTCP הוקמה על ידי transfection של תאים HepG2 עם קידוד פלסמיד myc-tagged NTCP ואחריו מבחר עם 500 מיקרוגרם / מ"ל של G418 למשך 3 שבועות. רמת NTCP-Myc בתאים HepG2 ביציבות להביע NTCP (HepG2-NTCP-myc-clone22) תאים נקבע על ידי המערבי סופג באמצעות נוגדנים אנטי-Myc (1: 1,000 דילול). (ב) HepG2-NTCP-myc-clone22 תאים נדבקו HBV רקומביננטי בנוכחות 2% DMSO ו -4% PEG8000. ב 72 שעות לאחר הדבקה, רמת פעילות הכתב נקבעה על ידי assay כתב. תוצאות מייצגות שלושה ניסויים בלתי תלויים, וברים שגיאים להראות הדואר סטיות תקן של האמצעים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: קורס זמן של זיהום HBV רקומביננטי. (א) HepG2-NTCP-myc-clone22 תאים נדבקו HBV רקומביננטי בנוכחות 2% DMSO ו -4% PEG8000. רמת זיהום HBV נקבעה על ידי פעילות כתב (קו שחור) בשעה 3, 6 או 9 ימים לאחר הדבקה. רמות HBV RNA (קו כחול) ו- DNA (קו כתום) נמדדו בו זמנית על ידי RT-PCR ו- PCR 15, בהתאמה, בכל נקודת זמן זיהום. (ב) hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה (PHH), מבודד מהונדס activator plasminogen האוריקינאז מסוג / עכברים SCID מחוסן עם PHH, נדבקו HBV רקומביננטי presencדואר של 2% DMSO ו -4% PEG8000. רמת זיהום HBV נקבעה על ידי פעילות כתב לאחר 3, 6, או 9 ימים לאחר הדבקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: השפעת תרופות אנטי-HBV ידוע על זיהום HBV רקומביננטי. HepG2-NTCP-myc-22 תאים נדבקו HBV רקומביננטי בנוכחות HBIG, הפרין ו- IFN-β במינון המצוין, כמו גם 2% DMSO ו -4% PEG8000. רמת שכפול HBV (א) ו כדאיויות תא (B) נקבעה על ידי פעילות כתב 6 ימים לאחר ההדבקה. HBIG הוא נוגדן מנטרל זיהום HBV ו הפרין הוא מעכב וירוסים אפופים. תוצאות מייצגות שלושה ניסויים בלתי תלויים, וברי שגיאה להראות סטיות התקן של אמצעי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: סכמטי של מחזור החיים HBV. HBV נכנס לתאים דרך קולטנים וירוס כולל NTCP. קפסיד הקשורים DNA מעגלי רגוע (rcDNA) הוא ללא ציפוי המרה ל- DNA מעגלי סגור קוולנטית (cccDNA) בגרעין. פונקציות cccDNA כתבנית שעתוק mRNA. ה- RNA הגנומי הוא encapsidated אל קפסיד וירוס על ידי הרכבת עם חלבונים עבור הליבה pol. לפני הרכבה נוספת עם חלבוני HBS, את הקופסית מעורבת הגברת DNA HBV באמצעות תהליך הנקרא תהליך שכפול cccDNA. חלקיקי נגיף התאספו עם חלבוני HBS בסופו של דבר הם שוחררו מחוץ לתא.om / קבצים / ftp_upload / 54,849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הגנום HBV יש ארבע מסגרות קריאה פתוחות עיקריות (ORFs) כולל הליבה, פולימראז, המשטח ו- X ORFs (איור 1). תמלול של ארבעה HBV ORFs מוסדר בחוזקה על ידי ארבעה יזמים: אמרגן precore / ליבה המכילים שפר שני, אמרגן S1, אמרגן האמרגן ו- X S2 המכיל משפר לי 18. תעתיקי 3.5 קילו ו 3.4 kb מתורגמים לחלבונים PreCore ו- Core, בהתאמה. החלבון לעטוף גדול (L) מופק mRNA subgenomic הגדול (2.5 kb), ואת באמצע (M) וחלבונים משטח קטן (S) מתורגמים פרוטוקול מן קצר יותר (2.1 kb). מתמליל 0.8 kb הוא תבנית לתרגום של חלבון X 19, 20. מסתיים 5'ו 3'של RNA pregenomic מכיל אלמנטים ציס פונקציונליים מרובים הכוללים ישירות חוזר 1 (DR1), DR2 ואיתות אריזה 21, 22. אלמנטים פונקציונליים אלה מגבילים את החדרת גנים הכתב או סמן לתוך RNA pregenomic. בנינו HBV רקומביננטי באמצעות-שלם טרנס של שני וקטורים, וקטור העברה המכיל את גן כתב וקטור עוזר. וקטור ההעברה נבנה על ידי החלפה של אזורי ליבת pol עם גן הכתב (איור 2).

NTCP זוהה קולטן הסלולר לכניסה HBV 10. מאחר ביטוי mRNA NTCP הוא נמוך מאוד בתאי HepG2, שאינם רגישים לזיהום HBV, הקמנו קו תא HepG2 יציב להביע NTCP-myc (איור 3 א). בעוד זיהום HBV רקומביננטי של תאי HepG2 לא הראה פעילות כתב, ביטוי NTCP בתאי HepG2 נתונות רגיש לזיהומי HBV רקומביננטי (איור 3 ב). ניתוח מהלך הזמן של זיהום HBV רקומביננטי הוכיח כי הן פעילות כתב HBV RNA היו דetectable בתוך 3 ימים של זיהום HBV רקומביננטי והגיע לשיא של 9 ימים postinfection; עם זאת, רמות HBV DNA גדלו לא נצפו (איור 4). מעכבי כניסה, כגון HBIG או הפרין, זיהום HBV רקומביננטי עכבות (איור 5). תוצאות אלו הצביעו על מערכת זו יכולה לשמש כדי לפקח על שכפול HBV בשלב מוקדם מן הכניסה וירוס כדי שעתוק, אבל לא שכפול הדנ"א ואת זיהום מחדש של וירוס שוחרר מבית תאים נגועים (איור 6).

מאחר וחלבון הכתב לעתים קרובות ומזהם את שבריר HBV רקומביננטי, שטיפת התאים נגוע בנגיף עם PBS פחות משלוש פעמים עלולות לגרום רקע גבוה. לכן, חשוב לבדוק את רמת הרקע על ידי מדידת פעילות כתב במדיום מ HepG2 HBV-unsusceptible שטופל וירוס רקומביננטי. אם הרקע הוא גבוה, להוסיף שלב כביסה (3 פעמים כביסה עם 300 μl PBS לכל היטב צלחת 96 היטב) חיל משלוח היוםעפרות צעד 3.1.

אם הייצור של HBV רקומביננטי הוא נמוך, לבדוק את יעילות transfection עם הפלסמיד מלא להביע חלבון פלואורסצנטי, כגון GFP או DsRed. באופן כללי, את היעילות של transfection של תאי HepG2 צריכה להיות גדולה מ -35%. אם את יעילות transfection היא נמוכה, לייעל את תנאי transfection ספציפיים כדי להשיג יעילות transfection גבוהה. אם את יעילות transfection היא גבוהה, לבדוק אם HBV רקומביננטי זיהומיות מופק על ידי משתמש בו כדי להדביק hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה. ההדבקה של HBV כדי hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה היא בדרך כלל גבוה יותר שורות תאים hepatoma להביע NTCP. אם הזיהום יעיל של HBV רקומביננטי מושגת hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה, הבעיה היא לא HBV רקומביננטי אבל התאים להיות נגוע. להקים מספר שיבוטי HepG2 יציבים להביע NTCP ובחר מאוד שיבוטי תא זיהומיות. confluency התא נמוך בתרבות בעת הזיהום עלול לגרום אני ענייהnfectivity. הגדלת מספר התאים בתרבות משפרת את יעילות הזיהום. עבור זיהום HBV, 80-95% confluency עבור תאי HepG2 להביע NTCP בעת הזיהום מספק שיעור זיהום גבוה.

התפתחות HBVs כתב כמה דווחה על ידי קבוצות רבות 11, 12, 13, אבל רוב HBVs הכתב הללו מראים הפרודוקטיביות עניים. יתר על כן, פעילות הכתב בתאים נגועים אינה גבוהה, והוא יהיה קשה להשתמש לסינון חומרים אנטי-HBV באמצעות assay תפוקה גבוהה. לעומת זאת, מערכת HBV לכתבנו מייצרת אות כתב חזקה בתאים הנגועים המקלה לנהל הקרנה המוני עבור תרופות אנטי-HBV באמצעות כמות קטנה יחסית של הנגיף לעומת וירוסי כתב אחרים דיווחו עד כה.

הנה, שעוררנו מערכת כתב HBV רומן לפקח בשלבים המוקדמים שלמחזור השכפול HBV וזה קיבל תוקף על ידי מדידת הפעילות חלבון הכתב לאחר ההדבקה. השיטה המתוארת היא מערכת וקטור HBV פשוטה, מהירה, חסכונית תהיה שימושי עבור זיהוי של גורמי מארח HBV וכן תרכובות אנטי HBV באמצעות שיטות הקרנת תפוקה גבוהה. ואכן, זיהינו גורמים המארח HBV וגנים אנטי-HBV ידי הטכנולוגיה כולו הגנום RNAi 15. מן הראוי לציין כי מערכת זו אינה מתאימה להערכת בשלבים המאוחרים של שכפול HBV כגון הצעד שכפול הדנ"א, קפסיד, והרכבה וירוס, ואת ניצני, כי HBV רקומביננטי לוקה לייצור גרעין pol פונקציונלי. פיתוח נוסף של HBV רקומביננטי נדרש להעריך את מחזור החיים HBV כולו.

לסיכום, מערכת זו יכולה לשמש כדי להעריך זיהום HBV ידי מדידת פעילות כתב. לכן, אין צורך לנהל טכניקות assay מסובכות כגון PCR, RT-PCR,HBV Core או S אנטיגן ELISA להעריך זיהום HBV / שכפול. לבסוף, מכיוון HBV הכתב הזה הוא פסול שכפול, אין סיכון של זיהום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter