Summary
Ce protocole décrit le modèle de souris céfopérazone d'infection à Clostridium difficile (CDI) en utilisant une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. L' accent mis sur la surveillance clinique de la maladie, C. énumération bactérienne difficile, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques tout au long de CDI dans un modèle de souris sont détaillés dans le protocole.
Introduction
Clostridium difficile est un anaérobie, bacillus sporulé Gram positif qui provoque la vie en danger de la diarrhée 1. Infection à C. difficile (ICD) est associée à une augmentation de la morbidité et la mortalité humaines et les résultats dans plus de 4,8 milliards $ en coûts de soins de santé par an 1-4. En 2013, les Centers for Disease Control and Prevention catégorisés C. difficile comme un risque urgent de résistance aux antibiotiques, ce qui indique qu'il constitue une menace urgente pour la santé publique 1. Actuellement, le traitement antibiotique vancomycine et métronidazole sont considérés comme la norme de soins pour CDI 5. Malheureusement, la récurrence du CDI après un traitement réussi avec des antibiotiques est élevée, se produisant dans 20 - 30% des patients 2,5-7. Par conséquent, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques contre cet agent pathogène entérique est nécessaire. Pour évaluer la thérapeutique contre C. difficile, un modèle animal approchant la maladie humaine en courant alternatifsouche linically pertinente est nécessaire.
Dans un premier temps , les postulats de Koch ont été établies pour C. difficile en 1977 en utilisant un modèle de hamster syrien clindamycine traité 8. Ce modèle est encore utilisé aujourd'hui pour étudier les effets des toxines de C. difficile sur la pathogenèse 9,10. Cependant, le CDI dans le modèle hamster entraîne des taux de mortalité élevés et ne se rapproche pas les manifestations de la maladie insidieuse chroniques qui peuvent être vus chez l' homme avec CDI 10,11. Sur la base de l'accessibilité et de disponibilité des plates-formes réactif de souris dans la recherche d'un modèle de souris de la CDI est pertinente.
En 2008, un modèle de souris robuste de CDI a été créé par le traitement des souris avec un cocktail d' antibiotiques dans l' eau potable (kanamycine, gentamicine, la colistine, le métronidazole et la vancomycine) pendant 3 jours , suivie d'une injection intrapéritonéale de clindamycine 12. Cette souris rendues sensibles à la colite CDI et sévère. Dépendretion de la dose d'inoculum administré, une gamme de signes cliniques et la létalité peut être observée en utilisant ce modèle. Depuis ce temps, divers traitements antibiotiques ont été étudiés qui modifient le microbiote intestinal murin, ce qui diminue la résistance à la colonisation au point où C. difficile peut coloniser le tractus gastro - intestinal (revue dans Best et al. Et Lawley & Young) 13,14.
Plus récemment, une céphalosporine à large spectre, céfopérazone, étant donné dans l'eau de boisson pendant 5 ou 10 jours rend reproductible des souris sensibles à la CDI 15. Depuis l' administration des céphalosporines de troisième génération sont associés à un risque accru de CDI chez l' homme, l' utilisation du modèle de céfopérazone reflète plus fidèlement la maladie 16 d'origine naturelle. Céfopérazone souris traitées sensibles à C. difficile ont été provoquées avec les deux spores de C. difficile et les cellules végétatives de diverses souches cliniques allant dansla pertinence et la virulence 17. Malgré certaines des études originales utilisant des cellules végétatives C. Difficile comme la forme infectieuse, spores de C. difficile sont considérés comme le principal mode de transmission 18.
Dans la dernière décennie, C. difficile R20291, a / BI / 027 souche NAP1, a vu le jour, ce qui provoque des épidémies de CDI 19,20. Nous avons cherché à déterminer l'évolution clinique de la maladie , lorsque les souris céfopérazone traités ont été exposés à la souche de C. difficile cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. Ce protocole détaille l'évolution clinique, y compris la perte de poids, la colonisation bactérienne, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques dans le tractus gastro - intestinal des souris infectées avec des spores de C. difficile R20291. Dans l'ensemble, ce modèle de la souris se révèle être une plate-forme expérimentale précieuse pour CDI approchant la maladie humaine. Ce modèle de souris caractérisé peut donc être utilisée pour évaluer les effetsde nouveaux produits thérapeutiques sur l'amélioration de la maladie clinique et sur la restauration de la résistance à la colonisation contre C. difficile.
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Protocol
Déclaration éthique:
La Commission institutionnelle animale soin et l'utilisation (IACUC) à la North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) a approuvé cette étude. Le NCSU Animal Care et Utiliser la politique applique les normes et les lignes directrices énoncées dans la Loi sur la Loi et Extension de recherche en santé du bien - être des animaux de laboratoire 1985. animaleries à NCSU adhérer aux lignes directrices énoncées dans le Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire. Les états de santé Les animaux ont été évalués de tous les jours, et les animaux moribonds ont été euthanasiés sans cruauté par asphyxie au CO2 suivie par des mesures secondaires. techniciens animaliers formés ou un vétérinaire effectué l'élevage dans un établissement AAALAC accrédité au cours de cette étude.
1. Administration de l'antibiotique céfopérazone dans l' eau potable pour atteindre Susceptibilité à C. difficile Colonisation et la maladie
NOTES: / 6 souris WT 5 à 8 semaines d'âge C57BL (femmes et hommes)ont été achetés et mis en quarantaine pour 1 semaine avant le début de l'administration de l'eau aux antibiotiques. Après la quarantaine, les souris ont été logées avec de la nourriture autoclavé, literie, et de l'eau. les changements de Cage ont été effectuées chaque semaine par le personnel de laboratoire dans une hotte à flux laminaire.
- Préparer céfopérazone (0,5 mg / ml) dans de l' eau distillée stérile 7 jours avant le jour ciblé de la provocation (Figure 1).
- Remplir les bouteilles d'eau en autoclave avec de l'eau de céfopérazone (0,5 mg / ml) et les placer dans chaque cage de la souris.
REMARQUE: l'eau de céfopérazone fraîchement préparée doit être faite et changé tous les 2 jours pendant une période de 5 jours, comme noté dans les étapes 1.1 et 1.2. L'élimination appropriée de l'eau de céfopérazone suivant les directives institutionnelles de santé et de sécurité de l'environnement est recommandé. - Après 5 jours sur l'eau de céfopérazone, remplacer les bouteilles avec des bouteilles d'eau autoclavées remplis d'eau distillée stérile. Donner la souris et de l'eau potable pendant la durée de l'expérience.
2. Préparation de l'inoculum de spores de C. difficile et le gavage des souris
NOTE: Avant de commencer, assurez-vous que les éléments suivants sont placés dans la chambre anaérobie pendant au moins 24 heures: 1x tampon phosphate salin (PBS; voir Matériaux), cyclosérine taurocholate cefoxitin fructose agar (TCCFA) plaques (voir Matériaux et le fichier supplémentaire ), et un écarteur en forme de L stérile.
NOTE: Les souris contestées avec spores de C. difficile doivent être logés dans une animalerie de niveau de biosécurité 2.
- Obtenir une C. spore difficile le bilan de la souche souhaitée (dans ce cas, R20291) qui a été préparé plus tôt et conservé à 4 ° C dans l' eau stérile 21,22. Déterminer le dénombrement de cette spore stocks avant l'utilisation.
- Sur la base de la concentration connue (spores / ml) de la spore actions, calculer la dilution souhaitée pour obtenir 10 5 spores par 25 pi. Assurer le volume d'inoculum est suffisante pour inoculer tousdans l'expérience des souris (25 ul par souris) pour effectuer le dénombrement de l'inoculum (environ 30 ul), et pour tenir compte des erreurs de pipetage.
- Vortex C. spore difficile du stock d' origine. Ensuite, remettre le volume calculé (de l' étape 2.2) de la C. difficile spores original stock dans l' eau stérile dans un tube à centrifuger à bouchon à vis. Effectuez cette aérobiose dans une hotte à flux laminaire. Identifier ce mélange dilué comme le "inoculum de spores."
- Placer l'inoculum de spores dans un bain d'eau à 65 ° C et à chauffer pendant 20 min.
REMARQUE: Cette étape veillera à ce que spores de C. difficile ne restent actives après le traitement thermique. - Dans le hotte à flux laminaire, prendre 50 ul d'inoculum de spores chauffée, le placer dans un tube à centrifuger stérile, et le passer dans la chambre anaérobie 23. Utilisez cet exemple pour spore énumération.
- Dans la hotte à flux laminaire, charger le reste des spores chauffée inoculum intoa seringue de 1 ml fixée à une aiguille de gavage gastrique ampoule à pointe stérile. Utiliser une seringue stepper manuelle pour assurer la répétition précise et rapide de dosage entre les souris. Faire en sorte que l'aiguille de gavage est rempli avec l'inoculum de spores chauffé avant utilisation.
NOTE: Une nouvelle aiguille de gavage stérile pour chaque souris est pas nécessaire. Toutefois, si diverses doses de spores de C. difficile sont administrés, une nouvelle aiguille de gavage est recommandé pour chaque dose.
NOTE: spores de C. difficile sont très résistantes aux désinfectants traditionnels. Par conséquent, l'utilisation d'un désinfectant sporicide, tels que # 62 Perisept sporicide Désinfectant, est nécessaire. Le fabricant recommande un temps de contact de 2 minutes pour détruire les spores de C. difficile. - Chaque souris par gavage avec 25 ul de l'inoculum de spores. Retiens chaque souris doucement en saisissant l'animal par la peau lâche du cou et du dos afin d'immobiliser la tête. Utilisation de l'index immobiliser en outre la tête et de l'animalallongé l'œsophage. Assurez-vous que l'animal n'a pas vocaliser ou montrer d'autres signes de détresse pendant l'immobilisation.
REMARQUE: Le volume total administré à des souris par gavage ne doit pas dépasser 10 ml / kg de poids corporel (0,1 ml / 10 g). - Maintenir la souris dans une position verticale et passez délicatement l'aiguille de gavage dans le côté de la bouche. Diriger l'aiguille de gavage le long du toit de la bouche et de faire avancer lentement l'aiguille de gavage dans l'œsophage.
NOTE: Si une résistance est rencontrée, l'aiguille de gavage peut pénétrer dans la trachée et ne devraient donc pas être avancé, mais plutôt enlevé et repositionné immédiatement. - Une fois l'aiguille de gavage est approximativement à mi-chemin dans l'oesophage, l'injection de 25 ul de l'inoculum de spores chauffé et retirer doucement l'aiguille de gavage de l'oesophage.
NOTE: l'avancement Forceful de l'aiguille de gavage peut conduire à la rupture de l'oesophage ou de l'estomac. Par conséquent, si la résistance est rencontrée lors de l'avance de l'aiguille de gavage, Il est préférable de retirer immédiatement et repositionner l'aiguille de gavage. - Retour à l'animal de sa cage et l'observer pour toute la toux ou des signes de détresse respiratoire, car cela peut indiquer l'administration trachéale par inadvertance ou par aspiration de l'inoculum de spores chauffée.
NOTE: Les souris sont extrêmement sensibles à C. difficile après un traitement antibiotique; par conséquent, des précautions pour éviter la contamination croisée entre les cages est essentielle. Ceci est particulièrement important lors de la gestion des souris traitées aux antibiotiques mais non contestées comme témoins. - Après inoculer toutes les souris, placez le reste inoculum de spores chauffée dans un tube à centrifuger stérile et passer dans la chambre anaérobie des spores énumération.
- Pour l'énumération de l'inoculum de spores chauffée (de l'étape 2.4) et le reste gavées inoculum de spores chauffé, faire des dilutions 1:10 série de chaque inoculum dans PBS 1x. Il est recommandé de faire et de la plaque 4 - 5 dilutions (ie, 10 -1 à10 -5).
- En utilisant une technique aseptique, transférer 100 ul de chaque dilution en série sur une plaque TCCFA individuelle.
- À l'aide d'une spatule en forme de L stérile, de répartir uniformément la dilution appliquée au support à travers la plaque. Une répartition uniforme de l'inoculum dilué est essentiel pour le dénombrement précis des spores.
- Incuber les plaques en anaérobiose pendant 24 heures à 37 ° C. Après 24 h, C. unités formant des colonies (CFU) Difficile peuvent être énumérés pour obtenir la dose infectieuse administrée à des souris dans les 25 pi (0,025 ml) de volume (voir le fichier supplémentaire «Exemples de calculs"). Colonies de C. difficile sont plates et de couleur jaune pâle et ont des bords irréguliers et une apparence de verre dépoli 24.
NOTE: La limite de détection pour le dénombrement des bactéries est 10 2 CFU.
3. Suivi de perte de poids chez la souris et les signes cliniques de la maladie tout au long de l' infection à C. difficile
- Peser unNIMAUX avant et après le traitement antibiotique 5 jours, la céfopérazone, après la récupération de 2 jours au large des antibiotiques (jour 0), puis pendant toute la durée de l'expérience.
NOTE: Obtenir des poids à une heure régulière chaque jour. Poids obtenu le jour de la provocation (jour 0) devrait être utilisé comme le poids de référence initial pour la comparaison dans toute infection par C. difficile. - Placez une balance numérique dans une enceinte de sécurité biologique. Placer un bêcher en plastique stérile sur la balance et tarer le poids du bécher plastique. Puis, choisissez doucement la souris par la base de la queue et le placer dans le récipient en plastique.
- Placer le bécher sur la balance. Placez une main sur le dessus du bécher pour garantir que la souris n'échappe pas. Il peut prendre 2 - 3 sec pour obtenir un poids stable. Ensuite, placez doucement la souris de nouveau dans sa cage. Notez ce poids et répéter le processus pour chaque souris dans cette cage.
NOTE: Il est impératif que des précautions sont prises pour éviter cross-contamination entre les cages lors de l'obtention des poids. Chaque cage de souris devrait avoir son propre gobelet en plastique pour le pesage. Les béchers en plastique doivent être désinfectés avec un agent sporicide entre chaque utilisation et recouverts d'une feuille d'aluminium stérile.
- Placer le bécher sur la balance. Placez une main sur le dessus du bécher pour garantir que la souris n'échappe pas. Il peut prendre 2 - 3 sec pour obtenir un poids stable. Ensuite, placez doucement la souris de nouveau dans sa cage. Notez ce poids et répéter le processus pour chaque souris dans cette cage.
- Surveiller les animaux provoqués deux fois par jour (au minimum) pour des signes de clinique sévère infection à C. difficile, y compris la léthargie, perte d'appétit, diarrhée, et une posture voûtée.
- Humainement euthanasier les animaux qui perdent 20% de leur poids corporel initial de référence et / ou développer des signes cliniques sévères de l' infection à C. difficile ( voir la liste à l' étape 3.3).
REMARQUE: Les souris qui présentent des signes cliniques de l' infection à C. difficile doivent être pesés au besoin au cours de l'expérience pour veiller à ce qu'ils n'ont pas perdu 20% de leur poids de référence initial. Pendant des points de temps au début de l'expérience, cela pourrait signifier des mesures deux fois par jour.
4. Enumeration bactérienne de C. difficilede fèces de souris et contenu caecum
NOTE: Avant de commencer, assurez-vous que les éléments suivants sont placés dans la chambre anaérobie pendant au moins 24 heures: 1x PBS (voir Matériaux), plaques TCCFA (voir Matériaux), un écarteur en forme de L-stérile, et microtubes stériles et / ou plaques PCR pour dilutions.
- Obtention d' échantillons pour C. Enumeration difficile
NOTE: Avant d'obtenir les selles ou le contenu du caecum, peser microtubes stériles sur une échelle analytique. Noter le poids du tube sur le côté du tube, arrondi à quatre décimales (par exemple, 0,9864 g). Désignons ce poids comme le «poids du tube." Chaque échantillon prélevé doit être placé dans un tube à centrifuger pesé stérile.- collection stérile de matières fécales de souris
- retenir délicatement chaque souris en saisissant l'animal par la peau lâche du cou et du dos afin d'immobiliser la tête. Utilisez le petit doigt pour retenir doucement la queue de l'animal, thus exposer l'anus. Assurez-vous que l'animal n'a pas vocaliser ou montrer d'autres signes de détresse pendant l'immobilisation.
- Tenez, un tube à centrifuger stérile pesé directement sous l'anus de l'animal. Il est impératif que le tube ne soit pas en contact direct avec la souris.
- Comme défèque l'animal, de recueillir le culot fécale dans le tube. Garder le tube à température ambiante jusqu'à ce que tous les échantillons de matières fécales sont recueillies. Il peut prendre plusieurs minutes pour une souris de déféquer, nécessitant ainsi des tentatives répétées pour recueillir les matières fécales.
- Peser les tubes contenant des matières fécales à l'échelle analytique. Noter le poids du tube, arrondi à quatre décimales (par exemple, 1,0021 g). Désignons le poids obtenu comme le "poids final du tube."
- Passez les échantillons de matières fécales dans la chambre anaérobie pour le dénombrement des bactéries directement après le prélèvement de selles.
- collection stérile du contenu du caecum de la souris au moment de la nécropsie
- Après euthanasie par asphyxie au CO2 suivie par des mesures secondaires, effectuer une nécropsie pour obtenir le caecum 25. Le caecum est la grande section en forme de virgule du tractus gastro-intestinal.
- Placez le caecum sur un plat en plastique de Pétri stérile. Utilisez un pas stérile à usage unique. 10 lame de scalpel pour couper le caecum ouvert de l'extrémité borgne de la poche pour exposer le contenu du caecum.
- extraire délicatement le contenu du caecum en appliquant une légère pression avec la lame de scalpel et de balayer le contenu vers la partie incisée du caecum.
NOTE: Il faut prendre soin de ne pas perturber le tissu caecum, qui sera soumis à l'examen histopathologique.
- extraire délicatement le contenu du caecum en appliquant une légère pression avec la lame de scalpel et de balayer le contenu vers la partie incisée du caecum.
- Placez les matières fécales dans un tube stérile de microcentrifugeuse pesé immédiatement après la collecte. Seulement environ 10 mg de contenu caecal est requis pour le dénombrement des bactéries.
- Peser les tubes contenant le contenu du caecum sur le scal analytiquee. Noter le poids du tube, arrondi à quatre décimales (par exemple, 1,0021 g). Désignons le poids obtenu comme le "poids final du tube."
- Passer les échantillons de contenu caecal dans la chambre anaérobie pour le dénombrement des bactéries.
- collection stérile de matières fécales de souris
- Enumeration bactérienne de C. difficile
- Calculer le poids final du contenu (fèces ou caecales) qui seront énumérés pour C. difficile. Interprété ce en soustrayant le «poids du tube final" du "poids du tube."
- Calculer une dilution 1:10 du contenu dans du PBS 1X et remettre en suspension en conséquence. Pour pelotes fécales, utilisez la pointe de la pipette pour perturber doucement le culot en solution (voir le fichier supplémentaire «Exemples de calculs").
- incuber dans des conditions anaérobies ces échantillons remis en suspension à la température ambiante pendant 30 min, permettant au contenu de se déposer.
- Faire des dilutions en série pour chaque échantillon dans PBS 1x pour enumration de la CFU par gramme de contenu (matières fécales ou caecum). Effectuez cette voie anaérobie.
- En utilisant une technique aseptique, transférer 100 ul de chaque dilution en série sur des plaques TCCFA. L'utilisation d'un écarteur en forme de L-stérile, étaler la dilution appliquée aux médias pour étaler uniformément à travers la plaque. Même la diffusion de la dilution est essentielle pour le dénombrement précis des colonies.
- Incuber les plaques en anaérobiose pendant 24 heures à 37 ° C. A cette époque, énumérer les colonies de C. difficile à obtenir le CFU par gramme de contenu (matières fécales ou caecum). Colonies de C. difficile sont plates et de couleur jaune pâle et ont des bords irréguliers et une apparence de verre dépoli 24.
NOTE: Ce protocole peut être utilisé pour énumérer C. difficile à partir d' autres contenus de GI murin, y compris l' iléon et le contenu colique. des plaques de PCR peuvent être utilisées pour réaliser des dilutions en série.
5. Vero cytotoxicité cellulaire Assay pour quantifier C. difficile Toxin Cytotoxiville
NOTE: Il est recommandé que cette analyse soit effectuée après l'achèvement du modèle de la souris sur des échantillons prélevés à l'autopsie et stockés à -80 ° C. Les techniques de culture cellulaire aseptiques sont essentielles pour prévenir la contamination des cellules Vero au cours de cet essai. Ce protocole prend 2 jours pour effectuer. Toutes les matières fécales et le contenu intestinal utilisé dans cet essai doivent être stockés dans un tube à centrifuger stérile pesé (notée avec le «poids du tube," voir la section ci-dessus). Le poids du tube final (y compris le contenu) est mesurée par une échelle analytique à quatre décimales près (voir la section ci-dessus). L'utilisation d'une pipette à canaux multiples est recommandée pour cet essai.
NOTE: Avant de commencer, assurez-vous que les éléments suivants sont disponibles: les cellules Vero, une modification de Dulbecco du milieu Eagle (DMEM) 1x avec 10% de sérum inactivé à la chaleur fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline / media streptomycine (notée "DMEM 1x médias; "voir Matériaux et le fichier supplémentaire), 0,25%Trypsine-EDTA, 1x PBS, 0,4% Trypan Bleu, une culture cellulaire plaque à fond plat de 96 puits, une plaque filtrante à 96 puits, Clostridium difficile Toxin A (aliquote de 3 pi à 1 ug / ul dans l' eau ultra-pure et conserver à -80 ° C), Clostridium difficile antitoxine, une feuille de calcul (pour les calculs et les cartes de la plaque; voir les fichiers supplémentaires).
NOTE: La prudence devrait être prise au cours de cet essai pour l' exposition du personnel à C. difficile et sa toxine.
- Fractionnement des cellules Vero (Jour 1)
- Préchauffer le milieu DMEM 1x, 0,25% de trypsine-EDTA, et 1x PBS dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Obtenir un flacon de cellules Vero de l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO 2) et la placer dans la culture cellulaire hotte à flux laminaire stérile. Utiliser 70% d'éthanol pour essuyer le capot et l'équipement avant de l'utiliser. En utilisant une pipette sérologiques, aspirez les médias du ballon de culture de tissus pour le retirer des cellules Vero et le jeter dans un déchet container.
- Rincer les cellules Vero avec 5 ml de 1 x PBS (préchauffé) dans le flacon de culture tissulaire. Aspirer le PBS et le jeter dans un conteneur de déchets.
- Ajouter 5 ml de 0,25% de trypsine-EDTA dans le ballon de culture tissulaire. Prévoyez un temps de 2 contact - 3 min. Pendant ce temps, observer les cellules commencent à se détacher de la surface du ballon. Agitez doucement le côté du flacon de culture de tissu à l'autre pour desserrer les cellules Vero.
- Après un temps de contact avec trypsine-EDTA, ajouter immédiatement 5 ml de DMEM 1x support dans le flacon de culture tissulaire. Cela neutralise la trypsine-EDTA. Utilisez cette solution pour laver délicatement les cellules Vero seules sur le dos du flacon. Ensuite, utilisez une pipette sérologique pour transférer ce mélange dans un tube conique de 15 ml.
- Centrifuger les cellules Vero dans le tube conique pendant 5 min à 180 xg et 25 ° C. Assurez-vous que la centrifugeuse est bien équilibrée. Après centrifugation, on observe une pastille visible des cellules Vero au fond du tube conique. Veillez à ne pas DISRUPT cette pastille. Aspirer le surnageant du tube conique et le jeter.
- Resuspendre les cellules Vero dans 3 ml de DMEM 1x médias.
- Compter les cellules Vero
- Ajouter 100 ul de la suspension de cellules Vero (faite à l'étape 5.1.7) à 100 pi de 0,4% de bleu Trypan. Mélanger doucement par pipetage la solution de haut en bas.
- Ajouter 10 ul de ce mélange dans chaque chambre d'un hémocytomètre.
- Comptez le nombre de cellules viables dans les quatre quadrants du hémocytomètre. Les cellules Vero mortes prendront le bleu Trypan et donc seront colorées en bleu (ces cellules ne doivent pas être comptées). Enregistrez ces numéros dans le "Vero cellulaire Feuille," fourni.
- Somme le nombre total de cellules Vero viables dans les quatre quadrants et calculer la moyenne. Multiplier par le facteur de dilution, qui est depuis 2 100 ul de cellules dans un total de 200 ul de liquide.
- Multiplier par le facteur de correction pour obtenir le "; le nombre de cellules / ml "Lors de l' utilisation d' un hémocytomètre, le facteur de correction est toujours 10 4 Multiplier par le volume total pour donner le." nombre total de cellules. ».
- Détermination du nombre de puits requis pour chaque expérience
NOTE: Un seul échantillon (soit les matières fécales ou du contenu intestinal) nécessite 24 puits séparés pour être effectuées en double. Une concentration de 10 5 cellules Vero par puits (volume total de 90 ul) est nécessaire.
REMARQUE: si l' on désire laisser incuber les cellules Vero plaques à 96 puits pendant une nuit à 37 ° C, une concentration de 10 3 cellules Vero par puits , il est recommandé de tenir compte de la durée d'incubation prolongée. Les calculs dans la cellule Feuille Vero devront être ajustées pour tenir compte de ce changement.- Déterminer le nombre de puits qui peuvent être utilisés en fonction de la quantité de cellules Vero disponibles (de l'étape 5.2; utiliser la cellule Vero Feuille, fourni).
- Déterminer le volume deSuspension de cellules Vero nécessaire pour remplir le nombre de puits désiré (sur la base du nombre d'échantillons testés). Assurez-vous que tout volume supplémentaire est ajouté pour compte pour le pipetage erreur (utiliser la condition Vero cellulaire Feuille).
- Diluer la suspension de cellules Vero (obtenu à l'étape 5.1.7) dans un milieu DMEM 1x pour obtenir le volume requis pour l'expérience.
- Les cellules Vero Semis dans un 96 puits de culture cellulaire Plate
- Utilisation de la cellule Vero resuspension de l'étape 5.3.2, utilisez une pipette multi-canaux pour ajouter 90 ul de la suspension de cellules Vero à chaque puits d'une culture cellulaire plaque à fond plat de 96 puits.
- Laisser incuber la plaque avec les cellules Vero dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant au moins 4 heures avant d' ajouter de la toxine (échantillons) dans les puits. Ce temps d'incubation va permettre aux cellules Vero à adhérer au fond de chaque puits.
- Création Solutions mères des échantillons (fèces ouLe contenu intestinal)
NOTE: Tous les échantillons devraient avoir le «poids du tube" et "poids de tube final" mesurée via une échelle analytique. Utilisez Vero cellulaire Feuille de calcul pour les calculs.- Calculer le poids du contenu. Convertir g en mg, puis mg à pl. Calculer le nombre total final de pi de solution nécessaires pour faire une dilution 1:10 dans PBS 1x. Calculer la quantité totale de 1 x PBS à ajouter à l'échantillon.
- Ajouter le volume total de 1 x PBS (calculé ci-dessus) à l'échantillon. Effectuez cette aérobiose, et en utilisant une technique aseptique. Pour pelotes fécales, utilisez la pointe de la pipette pour perturber doucement le culot dans la solution.
- Vortex les échantillons puis centrifuger eux à 3522 xg pendant 5 min à température ambiante. Assurez-vous que la centrifugeuse est bien équilibrée. Veillez à ne pas perturber le culot et remettre l'échantillon en solution.
REMARQUE: Au cours de l'étape 5.5.3, si seulement quelques échantillons sont en cours de traitement, les contenus peuvent être stérilisés parles faisant passer à travers un seul filtre de 0,22 um au lieu d'utiliser une plaque filtrante à 96 puits. Certains échantillons peuvent nécessiter plusieurs filtres pour stériliser le contenu du volume entier à l'aide de cette technique. - Stériliser le mélange échantillon / PBS en prenant 150 ul de surnageant et en le plaçant dans des puits séparés d'une plaque filtrante à 96 puits. Placer la plaque filtrante en toute sécurité au-dessus d'une culture cellulaire plaque à fond plat de 96 puits de sorte que le contenu filtrer dans cette plaque.
- Centrifuger la plaque de culture pile plaque filtrante / cellulaire à 431 xg pendant 5 min à température ambiante. Assurez-vous que la centrifugeuse est bien équilibrée et que la / cellule plaque de culture pile de plaques de filtre sont étroitement alignés et ne se déplace pas lors de la centrifugation.
NOTE: Ces contenus filtrés sont les 10 -1 stock qui sera utilisé dans les plaques de dilution. - Placer la plaque avec des échantillons filtrés sur de la glace.
- Dilution Création Plate # 1
NOTE: Dilution Plate # 1 (DP n ° 1) , il faudra 6 puits par échantillon, y compris positive (C. difficile Toxin A) et négatif (1x PBS) commande (voir le DP # 1 mise en page sur la cellule Feuille Vero).- Pour préparer le témoin positif (C. difficile Toxin A) pour cet essai, obtenir des aliquotes de 3 ul (1 ug / ul) à partir de -80 ° C et on ajoute 297 pi d'eau ultra - pure, ce qui donne une concentration finale de 0,01 ug / ul. Placer sur la glace.
- Attribuer les puits avec leurs dilutions (10 -1 à 10 -6) pour chaque échantillon et indiquer les contrôles positifs et négatifs (voir le DP # 1 mise en page).
- Ajouter des quantités appropriées de 1x PBS à chaque puits. Dans les 10 -1 puits, ajouter NO PBS. Les 10 -2 à 10 -6 puits, ajouter 90 ul de 1 x PBS.
- Ajouter des quantités appropriées des échantillons dans chaque puits. Dans les 10 -1 puits, ajouter 100 pi de la 10 -1 stock pour chaque échantillon (voir l' étape 5.5.7 du plat de filtree). Pour les 10 -2 à 10 -6 puits, faire des dilutions en série; commencer en prenant 10 pl du puits 10 -1 et de l' ajouter à 10 -2 puits. Continuer les dilutions en série sur la dilution 10 -6.
- Couvrir le DP # 1 plaque avec un joint adhésif en plastique transparent et placez-le sur la glace.
- Dilution Création Plate # 2
NOTE: Plate Dilution (DP n ° 2), il faudra 2 voies de 6 puits pour chaque échantillon, y compris les contrôles positifs et négatifs (voir le DP # 2 mise en page sur la cellule Feuille Vero).- Attribuer les puits avec leurs dilutions (10 -1 à 10 -6) pour chaque échantillon et indiquer les contrôles positifs et négatifs (voir le DP # 2 mise en page). Etiqueter les puits avec le nom de l'échantillon (désigné comme «puits d'échantillon») ou le nom échantillon avec antitoxine (désigné comme «puits d'antitoxine»).
- Calculer le montant de l'antitoxine requis pour cet essai. NOTE: L'antitoxine est un 25x disponiblesolution qui doit être dilué 1:25 dans PBS 1x. Placez l'antitoxine 1x solution préparée sur la glace.
- Pour "puits d'échantillon» , ajouter 20 ul de 1 x PBS à chaque puits pour toutes les dilutions (10 -1 à 10 -6) de cet échantillon. Pour "puits d'antitoxine," ajouter 20 pl de 1 x antitoxine à chaque puits pour toutes les dilutions (10 -1 à 10 6) de cet échantillon.
- Transférer 20 ul de l'échantillon dilué dans les puits de DP n ° 1 dans les puits désignés sur DP # 2 pour les lignes 1 - 6 et 7 rangées - 12 (voir le DP # 2 mise en page sur la cellule Feuille Vero). Mélanger la solution doucement par pipetage de haut en bas.
- Couvrir DP # 2 avec un joint adhésif en plastique transparent et permettre à 40 min d'incubation à la température ambiante. Cette incubation est de permettre à l'antitoxine à se lier et donc d' inactiver et de neutraliser la toxine de C. difficile.
- Après l'incubation, ajouter 10 ul de mélange de DP N ° 2 dans les puits de cellules Vero appropriés (voir la cellule Vero sur la plaque mise en Vero cellulaire Feuille). mélanger la solution par pipetage de haut en bas, en prenant soin de ne pas perturber les cellules Vero qui sont collées à la surface inférieure des puits doucement.
- Incuber la plaque de cellules Vero pendant une nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Évaluer les cellules Vero pour Arrondi en utilisant un microscope à lumière (jour 2)
NOTE: Rappelons que le facteur de dilution des changements par un facteur de 10 lors de l' ajout des échantillons de mélanges à la plaque de cellules Vero (par exemple, 10 -3 est maintenant 10 -4). Wells qui ont antitoxine présents devraient avoir peu ou pas de cellules Vero arrondi noté. L' arrondissement des cellules Vero (cytotoxicité) sera notée dans les échantillons qui contiennent de la toxine de C. difficile. Si l'activité cytotoxique est neutralisée dans une dilution contenant l'échantillon et l'antitoxine, la présence de toxine de C. difficile résultant dans des cellules Vero cytotoxicité est confirmée.- Examinez pour cellules Vero arrondi en utilisant un light microscope au grossissement de 200x. Pour les puits d'échantillons (y compris le contrôle positif), enregistrer la dilution du puits qui est le dernier à avoir 80% des cellules Vero arrondi noté.
- Calculer le titre cytotoxique, qui est définie comme étant la réciproque de la dilution la plus élevée qui a produit 80% de cellules Vero arrondi par gramme d'échantillon. Par exemple, si la dilution la plus élevée est 10 -5, le facteur de dilution serait de 10 -6 pour cet échantillon. Ainsi, le log [dernier facteur de dilution] / g d'échantillon serait log [10 6], ce qui donne un titre réciproque 6.
NOTE: Les cellules Vero doivent avoir subi au moins 3 - 4 passages et pas plus de 30 passages avant leur utilisation dans ce test 26.
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Representative Results
Au cours d'une étude représentative, 5-week-old C57BL / 6 souris WT ont été prétraités avec céfopérazone dans leur eau potable (0,5 mg / ml) pendant 5 jours et autorisés par jour 2 se laver avec de l'eau potable régulière. Les souris ont été provoquées avec 5 à 10 spores de C. difficile R20291 par gavage oral au jour 0 (figure 1A). Les souris ont été surveillés pour la perte de poids et les signes cliniques (léthargie, inappétence, la diarrhée et une posture voûtée) de CDI pendant 14 jours. Le défi de C57BL / 6 WT souris avec des spores de C. difficile R20291 a donné lieu à la diarrhée dans les 24 heures et la perte de poids significative dans les 48 heures après la provocation (figure 1B). Bien que non observée dans cette expérience, les souris éprouvées avec une dose plus élevée de C. difficile R20291 peuvent devenir gravement malades ou qui ont plus de 20% de perte de poids par 48-72 h post-défi, nécessitant ainsi l' euthanasie humaine. Par conséquent, les souris ont besoin d'un minimum de deux fois par joursurveillance après la provocation avec spores de C. difficile.
Dans cette étude représentative, une quantité importante de perte de poids et les signes cliniques de la maladie chez la souris ont également été observées sur les jours 2-7 après la provocation (figure 1B). A 7 jours après la provocation, les souris ont commencé à prendre du poids, et les signes cliniques de la maladie se calmèrent. La dernière semaine de l'expérience, les souris est apparu cliniquement normal, sans aucune preuve des signes cliniques de la CDI, y compris la diarrhée.
Pellets fécaux ont été recueillis avant le défi avec spores de C. difficile et chaque post-défi 48 h (figure 1C). Avant le traitement antibiotique, les souris ne sont pas colonisés par C. difficile. Dans après la provocation de 24 h avec spores de C. difficile, les souris ont été colonisés par 10 7 CFU de C. difficile par g de fèces (Figure 1C </ Strong>). Les souris est resté constamment colonisé par C. difficile tout au long de l'expérience, malgré l' absence de preuves de perte de poids ou des signes cliniques de CDI pour les 7 derniers jours de l'expérience.
Figure 1: céfopérazone souris traitées Challenged avec C. difficile R20291 Perte de poids et la pièce sont colonisées par C. difficile. A) 5-week-old C57BL / 6 souris WT JAX (n = 3M / 3F par groupe) ont été prétraité avec céfopérazone dans leur eau potable (0,5 mg / ml) pendant 5 jours et a permis un jour 2 se laver avec la consommation régulière eau. Les souris ont été contestées avec 10 5 spores de C. difficile R20291 par gavage oral le jour 0. Les souris ont été contrôlés pour la perte de poids et les signes cliniques (léthargie, inappétence, la diarrhée et une posture voûtée) de CDI pendant 14 jours. Les fèces ont été recueillies et utilisées pour le dénombrement des bactéries avant de commencer céfopérazone, immédiatement AFTEr finition de l'antibiotique, et aux jours 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13 et 14 tout au long de l'infection. Nécropsie a été réalisée aux jours 0, 2, 4, 7 et 14. B) La souris a perdu une quantité significative de leur poids initial après la provocation avec C. difficile R20291. Le poids moyen des souris a été mesurée tous les jours de jour 0. Perte de poids significative a été observée sur les jours 2 à 7 par rapport à jour 0, le poids de référence. Charge bactérienne C) C. difficile R20291 dans les fèces après le défi. Dans les 24 heures après le défi avec spores de C. difficile, toutes les souris ont été colonisés par 10 7 CFU (unités formant colonie) par gramme de fèces. Aucune différence significative de ces paramètres n'a été observée entre les femelles et les mâles. La signification a été déterminée par la Kruskal-Wallis unidirectionnelle test non paramétrique ANOVA suivie d' un post - test de Dunn (*, p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001, ****, p S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Quatre souris (2 mâles et 2 femelles) ont été euthanasiés sans cruauté et préparés pour la nécropsie au jour 0, avant l'infection, pour servir de témoins non infectés. En outre, une souris de chaque cage a été euthanasiés sans cruauté et préparé pour nécropsie les jours 2, 4, 7 et 14 après la provocation (figure 1A). Enumeration de C. difficile dans le contenu du caecum a été réalisée à chaque nécropsie. En concordance avec l' énumération fécale, aucun C. difficile a été détectée dans le contenu du caecum de souris avant la provocation avec C. difficile. A 48 heures après la provocation, les souris ont été colonisés par environ 10 8 CFU de C. difficile par g de contenu cæcal (Figure2A). Toutes les souris sont restées constamment colonisé tout au long de l'expérience.
Le contenu du caecum a également été évaluée dans l'infection quant à la présence de toxine de C. difficile en utilisant l'essai de cytotoxicité de cellules Vero. Aucune preuve de toxine C. difficile cytotoxicité a été détectée dans les matières fécales avant le défi (figure 2B). C. cytotoxicité difficile a été détecté 2 jours après le défi avec spores de C. difficile et a persisté tout au long de l'infection. En dépit de la colonisation assez uniforme par C. difficile, les variations des niveaux d'activité cytotoxique C. difficile est évidente chez les souris individuelles (figure 2B).
La majorité du contenu du caecum de souris neutralisé avec C. antitoxine difficile pendant le dosage des cellules Vero de cytotoxicité et a eu aucun signe de cytotoxicité (Vero CEll arrondissement) dans les dilutions effectuées. Cependant, quelques souris individuelles, en dépit de retester, avaient des preuves de 50 - 100% de cytotoxicité dans les 10 -1 dilution (dilution où l'échantillon est plus concentré), sans aucun signe de cellules Vero arrondi dans les autres dilutions. L'antitoxine utilisé dans cet essai est un anticorps polyclonal neutralisant la toxine de C. difficile, préparé chez la chèvre 27. Par conséquent, cette antitoxine ne peut neutraliser la toxine binaire C. difficile qui est produite par la souche R20291. Cependant, la toxine binaire C. difficile ne sont pas considérés comme 10 cytotoxique. Excessive toxine C. difficile ne peut être neutralisé par l'antitoxine ou la présence d'un autre agent cytotoxique autre que la toxine de C. difficile pourrait contribuer à cette constatation. Cette observation n'a pas d'incidence sur la détermination du titre de cytotoxicité pour ces échantillons, depuis la dernière dilution de chaque échantillon avec l'arrondi des cellules Vero de 80% avaientaucun signe de cytotoxicité lorsqu'il est combiné avec l'antitoxine à la dilution spécifiée.
Figure 2: Colonisation du caecum et cytotoxicité lors de l' infection avec C. difficile R20291. A) Souris caecum est resté constamment colonisé par C. difficile tout au long de l'expérience, en dépit de la résolution des signes cliniques et le gain de poids observé. Toutes les souris ont été colonisées avec plus de 10 8 CFU par gramme de matières fécales lorsqu'il est évalué à 2 jours après la provocation. B) cytotoxicité des cellules Vero dosage du contenu du caecum toute infection par C. difficile R20291. Après le défi avec spores de C. difficile, les souris avaient des niveaux significatifs de cytotoxicité, telle que mesurée dans le journal 10 dilution réciproque de la toxine par gramme de contenu caecal les jours 2, 4 et 7 après la provocation par rapport à jour 0 (médianes representéd par la ligne). La signification a été déterminée par la Kruskal-Wallis unidirectionnelle test non paramétrique ANOVA suivie d' un post - test de Dunn (*, p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001, ****, p ≤ 0,0001 ). Les barres d'erreur représentent les écarts-types de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Il est recommandé que l'évaluation histologique est effectuée par un vétérinaire pathologiste conseil certifié en aveugle. Pour marquer des tissus, un système de notation numérique 0-4 devrait être utilisée pour évaluer séparément l' œdème, l' infiltration de cellules inflammatoires, et des lésions des cellules épithéliales dans l'iléon, du caecum et du côlon basé sur un système de notation précédemment publié 17.
Après examen histopathologique aveuglémination du murin défi iléon, caecum et colon après avec C. difficile R20291, les changements pathologiques les plus importants ont été notés dans le caecum (Figure 3). Les scores totaux histologiques caecales étaient significativement différentes entre le jour 0 et 2 jours et 4 post-défi. Aucune lésion significative n'a été notée dans l'iléon tout au long de l' infection (Figure 3). lésions Milder ont été notées dans le côlon. Les scores totaux histologiques colique étaient significativement différentes entre le jour 0 et jours 2 et après la provocation 7 (figure 3).
Sections représentant H & E de l'iléon, caecum et du côlon à travers l' infection sont disponibles à la figure 4. Chaque image a son score histologique totale respective et les scores individuels pour des lésions épithéliales, l' inflammation et l' œdème, tel que déterminé par un pathologiste vétérinaire certifié aveugle ( SAM).
Figure 3: La notation histologique du murin iléon, caecum, et Colon lors de l' infection avec C. difficile R20291. Total des scores histologiques ont été calculés en additionnant les trois scores des paramètres évalués: épithélial des dommages, l'inflammation et l'œdème. Aucune modification histopathologique significative n'a été notée dans l'iléon toute infection. tissu caecum contenait des lésions histologiques les plus importantes au cours de CDI. Les scores totaux histologiques caecales étaient significativement différents du jour 0 aux jours 2 et 4 post-défi. lésions Milder ont été notées dans le côlon. Les scores totaux histologiques colique étaient significativement différents du jour 0 jours 2 et 7 post-défi. La signification a été déterminée par la Kruskal-Wallis unidirectionnelle test non paramétrique ANOVA suivie d' un post - test de Dunn (*, p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; ***, p804; 0,001; ****, P ≤ 0,0001). Les barres d'erreur représentent les écarts-types de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: histopathologie Pendant l' infection avec C. difficile R20291. Ce panneau contient des sections H & E représentatifs de l' iléon, du caecum et du côlon à travers l' infection par C. difficile R20291. Les scores totaux histologiques sont entre parenthèses () pour la journée et les tissus énumérés correspondant: pour la journée de iléon 0 (0), jour 2 (1), jour 4 (0), jour 7 (0), et le jour 14 (0) ; pour le jour du caecum 0 (0), jour 2 (5), 4 jours (4), 7 jours (3) et 14 jours (3); et pour le jour du côlon 0 (0), jour 2 (4), 4 jours (1), 7 jours (4) et 14 jours (2). Photomicrographies ont été obtenus sur un Microscope lumièree avec un appareil photo numérique de 5 mégapixels et son logiciel d'accompagnement (la barre d'échelle représente 200 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
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