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Immunology and Infection

Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti doi: 10.3791/54850 Published: December 10, 2016

Summary

Questo protocollo delinea il modello di topo cefoperazone di infezione da Clostridium difficile (CDI) con un ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabili, R20291. L'enfasi sul monitoraggio clinico della malattia, C. enumerazione batterica difficile, la tossina citotossicità, e cambiamenti istopatologici tutto CDI in un modello di topo sono dettagliati nel protocollo.

Introduction

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Clostridium difficile è un anaerobica,, bacillo spore gram-positivi che causa pericolo di vita la diarrea 1. Infezione da C. difficile (CDI) è associato ad un aumento della morbilità e della mortalità umana e si traduce in più di 4,8 miliardi di $ in spese sanitarie per anno 1-4. Nel 2013, i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie classificati C. difficile come un rischio resistenza agli antibiotici urgente, indicando che essa pone una minaccia urgente per la salute pubblica 1. Attualmente, il trattamento antibiotico con vancomicina e metronidazolo sono considerati lo standard di cura per CDI 5. Purtroppo, il ripetersi di CDI dopo il successo del trattamento con antibiotici è alto, che si verificano nel 20 - 30% dei pazienti 2,5-7. Pertanto, la scoperta di nuove terapie contro questo patogeno enterico è necessario. Per valutare terapie contro il C. difficile, un modello animale approssimare la malattia umana in acè necessario un ceppo linically rilevanti.

Inizialmente, i postulati di Koch sono stati stabiliti per il C. difficile nel 1977 utilizzando un modello di criceto siriano clindamicina trattati con 8. Questo modello è ancora utilizzato oggi per studiare gli effetti delle tossine di C. difficile sulla patogenesi 9,10. Tuttavia, CDI nel modello criceto si traduce in alti tassi di mortalità e non, sul ravvicinamento delle manifestazioni della malattia insidiosi croniche che possono essere visti in esseri umani con CDI 10,11. Sulla base della accessibilità e la disponibilità di piattaforme reagente murini in ricerca, un modello murino di CDI è rilevante.

Nel 2008, un modello di topo robusto CDI è stato istituito con il trattamento di topi con un cocktail di antibiotici nell'acqua potabile (kanamicina, gentamicina, colistina, metronidazolo e vancomicina) per 3 giorni, seguiti da un'iniezione intraperitoneale di clindamicina 12. Questo topi resi sensibili alla colite CDI e grave. Dipenderezione della dose somministrata inoculo, una serie di segni clinici e letalità può osservare utilizzando questo modello. Da quel momento, i vari regimi antibiotici sono stati studiati che alterano la flora intestinale murino, diminuendo la resistenza colonizzazione al punto in cui C. difficile può colonizzare il tratto gastrointestinale (rivisto nel miglior et al. E Lawley & Young) 13,14.

Più di recente, un ampio spettro di cefalosporina, cefoperazone, data in acqua potabile per 5 o 10 giorni rende riproducibile topi suscettibili di CDI 15. Dal momento che la somministrazione di cefalosporine di terza generazione sono associati ad un aumentato rischio di CDI negli esseri umani, l'uso del modello cefoperazone riflette in modo più accurato la malattia 16 in natura. Cefoperazone trattati topi suscettibili di C. difficile è stato messo in discussione con entrambe le spore di C. difficile e le cellule vegetativa di una varietà di ceppi che vanno a clinicarilevanza e virulenza 17. Nonostante alcuni degli studi originali che utilizzano C. cellule vegetative difficile del come la forma infettiva, spore di C. difficile del sono considerati la principale modalità di trasmissione 18.

Negli ultimi dieci anni, C. difficile R20291, un NAP1 / BI / 027 ceppo, è emerso, causando epidemie di CDI 19,20. Abbiamo cercato di determinare il decorso clinico della malattia, quando i topi Cefoperazone trattati si sono sfidati con il C. difficile ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabili, R20291. Dettagli Questo protocollo il decorso clinico, tra cui la perdita di peso, la colonizzazione batterica, la tossina citotossicità, e cambiamenti istopatologici nel tratto gastrointestinale dei topi sfidati con spore di C. difficile R20291. Nel complesso, questo modello di topo si rivela essere una piattaforma sperimentale prezioso per CDI approssimare malattie umane. Questo modello caratterizzato mouse può quindi essere utilizzato per valutare gli effettidi nuove terapie per il miglioramento della malattia clinica e sul restauro della resistenza colonizzazione contro C. difficile.

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Protocol

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Dichiarazione etica:
La cura degli animali e Usa Comitato Istituzionale (IACUC) alla North Carolina State University College di Medicina Veterinaria (NCSU) ha approvato questo studio. La cura NCSU animali e utilizzare la politica applica gli standard e le linee guida stabilite nel benessere degli animali Act e di estensione Health Research Act del 1985. Laboratorio strutture animali a NCSU aderire alle linee guida indicate nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Gli stati di salute degli animali sono stati valutati tutti i giorni, e gli animali moribondi sono stati umanamente eutanasia da CO 2 asfissia seguita da misure secondarie. i tecnici animali addestrati o un veterinario eseguite zootecnia in una struttura AAALAC accreditato nel corso di questo studio.

1. Amministrazione della antibiotici Cefoperazone in acqua potabile per raggiungere suscettibilità a C. difficile colonizzazione e malattia

NOTE: 6 topi da 5 a 8 settimane di età C57BL / WT (femmine e maschi)sono stati acquistati e messi in quarantena per 1 settimana prima di iniziare la somministrazione di acqua antibiotico. Dopo la quarantena, i topi sono stati alloggiati con cibo in autoclave, biancheria da letto, e l'acqua. modifiche gabbia sono state eseguite settimanalmente da personale di laboratorio in una cappa a flusso laminare.

  1. Preparare cefoperazone (0,5 mg / ml) in acqua distillata sterile 7 giorni prima del giorno mirato di sfida (Figura 1).
  2. Riempire bottiglie d'acqua in autoclave con acqua cefoperazone (0,5 mg / ml) e metterli in ogni gabbia del mouse.
    NOTA: acqua cefoperazone preparati al momento dovrebbe essere fatto e cambiato ogni 2 giorni nel corso di un periodo di 5 giorni, come indicato nei passi 1.1 e 1.2. Si raccomanda il corretto smaltimento delle acque cefoperazone seguendo le linee guida di salute e sicurezza ambientale istituzionali.
  3. Dopo 5 giorni in acqua cefoperazone, sostituire le bottiglie con bottiglie d'acqua in autoclave riempite con acqua distillata sterile. Dare topi questa acqua potabile per la durata dell'esperimento.

2. Preparazione del C. difficile Spore inoculo e la sonda gastrica dei topi

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi che i seguenti componenti siano introdotti nella cella anaerobica per almeno 24 ore: 1x PBS (PBS; vedi Materiali), taurocolato cicloserina cefoxitina fruttosio agar (TCCFA) piastre (vedi Materiali e il file supplementare ), e sterile spalmatore a forma di L.

NOTA: I topi sfidati con spore di C. difficile del dovrebbero essere ospitati in una struttura di animali biosicurezza di livello 2.

  1. Ottenere un C. difficile spore magazzino del ceppo desiderato (in questo caso, R20291) che è stato preparato in precedenza e conservato a 4 ° C in acqua sterile 21,22. Determinare l'enumerazione di questa spora magazzino prima dell'uso.
  2. Sulla base della concentrazione nota (spore / ml) di spore magazzino, calcolare la diluizione desiderato per ottenere 10 5 spore per 25 microlitri. Assicurarsi che il volume di inoculo è adeguato per inoculare tuttitopi nell'esperimento (25 ml per il mouse), per eseguire l'enumerazione della inoculo (circa 30 ml), e per tenere conto di errori di pipettamento.
  3. Vortex l'originale C. difficile spore magazzino. Poi, risospendere il volume calcolato (dal punto 2.2) dell'originale C. difficile spore magazzino in acqua sterile all'interno di una provetta con tappo a vite. Eseguire questa aerobicamente in una cappa a flusso laminare. Identificare questa miscela diluita come il "spore inoculo."
  4. Inserire l'inoculo di spore in un bagno d'acqua 65 ° C e riscaldare per 20 min.
    NOTA: Questo passaggio farà sì che solo attivi spore di C. difficile del rimangono dopo il trattamento termico.
  5. All'interno della cappa a flusso laminare, prendere 50 ml di inoculo riscaldata spore, metterlo in una provetta sterile e farlo passare nella camera anaerobica 23. Utilizzare questo esempio per spore enumerazione.
  6. All'interno della cappa a flusso laminare, caricare il restante spore riscaldata inoculo intOA siringa da 1 ml collegato a un ago sonda gastrica gastrica lampadina a punta sterile. Utilizzare una siringa passo-passo manuale per garantire la ripetizione accurata e rapida di dosaggio tra i topi. Assicurarsi che l'ago sonda gastrica è riempito con l'inoculo di spore riscaldato prima dell'uso.
    NOTA: Un nuovo ago sonda gastrica sterile per ogni mouse non è richiesto. Tuttavia, se vengono somministrati varie dosi di spore di C. difficile, un nuovo ago sonda gastrica è raccomandato per ogni dose.
    NOTA: spore di C. difficile del sono altamente resistenti ai disinfettanti tradizionali. Pertanto, l'uso di un disinfettante sporicida, ad esempio # 62 Perisept sporicida disinfettante, è necessario. Il produttore consiglia un tempo di contatto di 2 minuti per distruggere spore di C. difficile.
  7. Gavage ogni topo con 25 ml di inoculo spore. Trattenere ogni mouse delicatamente afferrando l'animale dalla pelle allentata del collo e indietro per immobilizzare la testa. Utilizzando l'indice immobilizzare ulteriormente testa dell'animale eallungare l'esofago. Assicurarsi che l'animale non vocalizzare o mostrare altri segni di sofferenza durante la contenzione.
    NOTA: Il volume totale somministrato a topi con sonda gastrica non deve superare i 10 ml / kg di peso corporeo (0,1 ml / 10 g).
  8. Mantenere il mouse in posizione verticale, verticale e passare delicatamente l'ago sonda gastrica nel lato della bocca. Dirigere l'ago sonda gastrica lungo il tetto della bocca e far avanzare lentamente l'ago sonda gastrica nell'esofago.
    NOTA: Se si incontra alcuna resistenza, l'ago sonda gastrica può essere entrare nella trachea e quindi non dovrebbe essere avanzata, ma piuttosto rimosso e riposizionato immediatamente.
  9. Dopo che l'ago sonda gastrica è a circa metà strada nell'esofago, iniettare 25 ml di inoculo spore riscaldata ed estrarre delicatamente l'ago sonda gastrica dall'esofago.
    NOTA: l'avanzamento Forceful dell'ago sonda gastrica può portare alla rottura dell'esofago o dello stomaco. Pertanto, se la resistenza si incontra quando si avanza l'ago sonda gastrica, È meglio rimuovere immediatamente e riposizionare l'ago sonda gastrica.
  10. Rispedire l'animale verso la sua gabbia e osservarlo per qualsiasi tosse o segni di distress respiratorio, in quanto ciò potrebbe indicare amministrazione tracheale accidentale o l'aspirazione del inoculo spore riscaldata.
    NOTA: I topi sono estremamente sensibili a C. difficile dopo il trattamento antibiotico; di conseguenza, le precauzioni per evitare la contaminazione incrociata tra le gabbie è essenziale. Ciò è particolarmente importante nella gestione di topi trattati con antibiotici, ma contestati come controlli.
  11. Dopo vaccinare tutti i topi, posizionare il restante inoculo di spore riscaldato in una provetta sterile e passarlo nella camera anaerobica per spore enumerazione.
  12. Per l'enumerazione delle spore inoculo riscaldata (dal punto 2.4) e per il restante gavaged inoculo di spore riscaldata, fare 1:10 diluizioni seriali di ciascun inoculo in 1x PBS. Si raccomanda di fare e piastra 4 - 5 diluizioni (vale a dire, 10 -1 attraverso10 -5).
  13. Utilizzando una tecnica asettica, trasferire 100 ml di ogni diluizione in serie su una singola piastra TCCFA.
  14. Utilizzando uno sterile spreader a forma di L, distribuito diluizione applicata al mezzo attraverso la piastra. Anche diffusione dell'inoculo diluito è essenziale per il conteggio preciso delle spore.
  15. Incubare le piastre in anaerobiosi per 24 ore a 37 ° C. Dopo 24 ore, C. unità difficile del formanti colonie (CFU) possono essere enumerati per ottenere la dose infettiva somministrata a topi nei 25 ml (0,025 ml) di volume (vedere il file supplementare "Calcoli Esempio"). C. colonie difficile del sono piatte e giallo pallido e hanno bordi irregolari e un aspetto di vetro smerigliato 24.
    NOTA: Il limite di rilevazione per il conteggio dei batteri è di 10 2 CFU.

3. Monitoraggio perdita di peso del mouse e segni clinici della malattia in tutto infezione da C. difficile

  1. pesare unnimals prima e dopo il trattamento antibiotico 5 giorni cefoperazone, dopo il recupero 2 giorni off di antibiotici (giorno 0) e quindi per tutta la durata dell'esperimento.
    NOTA: Ottenere pesi in un momento costante ogni giorno. Pesi ottenuti il giorno di sfida (giorno 0) dovrebbe essere usato come peso di base iniziale per il confronto durante infezione da C. difficile.
  2. Posizionare una bilancia digitale in un armadio biosicurezza. Posizionare un bicchiere di plastica sterile sulla bilancia e tarare il peso del bicchiere di plastica. Poi, delicatamente sollevare il mouse la base della coda e posizionarlo nel bicchiere di plastica.
    1. Posizionare il bicchiere di nuovo sulla scala. Passa una mano sopra la parte superiore del beaker per assicurare che il mouse non sfugge. Si può prendere 2 - 3 secondi per ottenere un peso stabile. Poi, posizionare delicatamente il mouse di nuovo nella sua gabbia. Registrare questo peso e ripetere il processo per ogni mouse in quella gabbia.
      NOTA: E 'imperativo che vengono prese delle precauzioni necessarie per evitare la contaminazionezione tra le gabbie quando l'ottenimento di pesi. Ogni gabbia di topi deve avere la propria beaker di plastica per la pesatura. I bicchieri di plastica devono essere disinfettati con un agente sporicida tra ogni utilizzo e coperto con un foglio di alluminio sterile.
  3. Monitorare gli animali sfidato due volte al giorno (al minimo) per i segni di clinicamente grave infezione da C. difficile, tra letargia, perdita di appetito, diarrea, e la postura ricurva.
  4. Umanamente eutanasia gli animali che perdono il 20% del loro peso corporeo al basale iniziale e / o sviluppare gravi segni clinici di infezione C. difficile (elencati al punto 3.3).
    NOTA: I topi che presentano segni clinici di infezione da C. difficile devono essere valutati in base alle esigenze durante l'esperimento per garantire che essi non hanno perso il 20% del loro peso corporeo al basale iniziale. Durante punti temporali primi nell'esperimento, questo potrebbe significare misurazioni due volte al giorno.

4. Conta batterica di C. difficileda mouse feci e contenuti del cieco

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi che i seguenti elementi sono collocati nella camera anaerobica per almeno 24 ore: 1x PBS (vedi Materiali), piastre TCCFA (vedi Materiali), sterile diffusore a forma di L, e tubi microcentrifuga sterili e / o piastre PCR per diluizioni.

  1. Ottenere campioni di C. difficile enumerazione
    NOTA: Prima di ottenere feci o contenuti del cieco, pesare microprovette sterili su scala analitica. Registrare il peso del tubo sul lato del tubo, arrotondamento alla quarta cifra decimale (ad esempio, 0,9864 g). Indichiamo questo peso come il "peso tubo". Ciascun campione prelevato deve essere posto in una provetta sterile pesato.
    1. raccolta sterile di feci di topo
      1. frenare delicatamente ogni topo afferrando l'animale dalla pelle allentata del collo e indietro per immobilizzare la testa. Utilizzare il dito mignolo di frenare dolcemente la coda dell'animale, thus esponendo l'ano. Assicurarsi che l'animale non vocalizzare o mostrare altri segni di sofferenza durante la contenzione.
      2. Tenere una, provetta sterile pesato direttamente sotto l'ano dell'animale. È indispensabile che il tubo non venga a contatto diretto con il mouse.
        1. Come l'animale defeca, raccogliere il pellet fecale nel tubo. Mantenere il tubo a temperatura ambiente fino a quando tutti i campioni fecali sono raccolti. Si può richiedere diversi minuti per un mouse a defecare, e perciò necessitano di tentativi di ripetizione per raccogliere le feci.
      3. Pesare le provette contenenti feci sulla scala analitica. Registrare il peso del tubo, l'arrotondamento alla quarta cifra decimale (per esempio, 1,0021 g). Indichiamo il peso ottenuto come il "peso tubo finale".
      4. Far passare i campioni di feci nella camera anaerobica per il conteggio dei batteri direttamente dopo la raccolta delle feci.
    2. raccolta sterile di topo contenuti del cieco al momento della necroscopia
      1. Dopo l'eutanasia umana da CO 2 asfissia seguita da misure secondarie, eseguire una necroscopia per ottenere cieco 25. Il cieco è la grande sezione, a forma di virgola del tratto gastrointestinale.
      2. Posizionare il cieco su un piatto di plastica sterile Petri. Utilizzare un usa e getta, non sterili. 10 bisturi per tagliare il cieco aperta da fine cieca della sacca per esporre il contenuto cecale.
        1. estrarre delicatamente il contenuto cecale esercitando una leggera pressione con il bisturi e spazzare il contenuto verso la parte incisa del cieco.
          NOTA: Si deve prestare attenzione a non distruggere il tessuto del cieco, che sarà sottoposto per l'esame istopatologico.
      3. Posizionare il contenuto cecale in una, provetta sterile pesato immediatamente dopo la raccolta. Solo circa 10 mg di contenuto del cieco sono necessari per il conteggio dei batteri.
      4. Pesare le provette contenenti il ​​contenuto del cieco sul scal analiticoe. Registrare il peso del tubo, l'arrotondamento alla quarta cifra decimale (per esempio, 1,0021 g). Indichiamo il peso ottenuto come il "peso tubo finale".
      5. Far passare i campioni di contenuto cecale nella camera anaerobica per il conteggio dei batteri.
  2. Enumerazione batterica di C. difficile
    1. Calcolare il peso finale dei contenuti (feci o cecale) che verranno elencati per C. difficile. Eseguita questa sottraendo il "peso tubo finale" dal "peso tubo".
    2. Calcolare una diluizione 1:10 del contenuto in 1X PBS e risospendere di conseguenza. Per pellet fecali, utilizzare la punta della pipetta di interrompere delicatamente il pellet in soluzione (vedere il file supplementare "Calcoli Esempio").
    3. Anaerobicamente incubare questi campioni risospese a temperatura ambiente per 30 min, permettendo il contenuto di stabilirsi.
    4. Fai diluizioni in serie per ogni campione in PBS 1x per enumrazione del CFU per g di contenuti (feci o del cieco). Eseguire questa anaerobica.
    5. Utilizzando una tecnica asettica, trasferire 100 ml di ogni diluizione seriale piastre TCCFA. Utilizzando uno sterile spreader a forma di L, diffondere la diluizione applicata ai media per diffondere uniformemente esso tutta la piastra. Anche diffusione della diluizione è essenziale per un accurato conteggio delle colonie.
    6. Incubare le piastre in anaerobiosi per 24 ore a 37 ° C. In questo momento, enumerare colonie di C. difficile avere la CFU per g di contenuto (feci o cecale). C. colonie difficile del sono piatte e giallo pallido e hanno bordi irregolari e un aspetto di vetro smerigliato 24.
      NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato per enumerare C. difficile da altri contenuti GI murino, tra cui ileale e il contenuto del colon. piastre PCR possono essere utilizzati per fare diluizioni seriali.

5. Vero cellulare citotossicità test per quantificare C. difficile tossina Cytotoxicittà

NOTA: Si raccomanda che questo dosaggio essere eseguita dopo il completamento del modello di topo su campioni raccolti all'autopsia e conservati a -80 ° C. Asettiche tecniche di coltura cellulare sono essenziali per prevenire la contaminazione di cellule Vero durante questo test. Questo protocollo richiede 2 giorni di tempo per eseguire. Tutte le feci e contenuto intestinale utilizzato in questo test devono essere conservati in una provetta sterile pesato (indicato con il "peso tubo", vedere la sezione precedente). Il peso del tubo finale (compresi i contenuti) viene misurato mediante una bilancia analitica con l'approssimazione di quattro cifre decimali (vedi paragrafo precedente). L'uso di una pipetta multicanale è consigliato per questo test.

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi che i seguenti articoli sono disponibili: cellule Vero, la modifica di Dulbecco di Eagle (DMEM) 1x con il 10% di siero di calore-inattivato fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / media streptomicina (indicato come "DMEM 1x media; "vedi Materiali e il file supplementare), 0,25%Tripsina-EDTA, 1x PBS, 0,4% Trypan Blue, una coltura cellulare piatto fondo piatto a 96 pozzetti, una piastra di filtro a 96 pozzetti, Clostridium difficile Toxin A (aliquota in 3 ml a 1 mg / mL in acqua ultra pura e conservare a -80 ° C), Clostridium difficile antitossina, un foglio di lavoro (per i calcoli e le mappe piatto; vedere file supplementari).

NOTA: Si deve usare cautela durante questo test per l'esposizione del personale a C. difficile e la sua tossina.

  1. Dividere le cellule Vero (1 ° giorno)
    1. Preriscaldare i media DMEM 1x, 0,25% tripsina-EDTA, e 1x PBS in un bagno d'acqua a 37 ° C.
    2. Ottenere un pallone di cellule Vero dall'incubatore coltura cellulare (37 ° C e 5% CO 2) e collocarlo nella coltura cellulare cappa a flusso laminare sterile. Utilizzare il 70% di etanolo per pulire il cofano e le attrezzature prima dell'uso. Usando una pipetta sierologica, aspirare il supporto dal pallone di coltura tissutale per rimuoverlo dalle cellule Vero e scartare in uno spreco container.
    3. Risciacquare le cellule Vero con 5 ml di PBS 1x (preriscaldato) nel pallone di coltura tissutale. Aspirare il PBS e scartare in un contenitore per rifiuti.
    4. Aggiungere 5 ml di 0,25% tripsina-EDTA al pallone di coltura tissutale. Un tempo di contatto di 2 - 3 min. Durante questo tempo, osservare le cellule iniziano a venire fuori dalla superficie pallone. oscillare delicatamente il lato pallone di coltura tissutale a lato per allentare le cellule Vero.
    5. Dopo il tempo di contatto con tripsina-EDTA, aggiungere subito 5 ml di DMEM 1x supporti nel pallone di coltura tissutale. Ciò neutralizzare la tripsina-EDTA. Utilizzare questa soluzione per lavare delicatamente le cellule Vero slegati dal retro del pallone. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire questa miscela in un tubo conico da 15 ml.
    6. Centrifugare le cellule Vero nel tubo conico per 5 minuti a 180 xg e 25 ° C. Assicurarsi che la centrifuga è ben bilanciata. Dopo centrifugazione, osservare un pellet visibile di cellule Vero sul fondo del tubo conico. Fare attenzione a non DISRUPT questo pellet. Aspirare il surnatante dal tubo conico e scartarla.
    7. Risospendere le cellule Vero in 3 ml di DMEM 1x media.
  2. Contando le cellule Vero
    1. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare Vero (fatta nel passaggio 5.1.7) a 100 ml di 0,4% Trypan Blue. Mescolare delicatamente pipettando la soluzione su e giù.
    2. Aggiungere 10 ml di questa miscela a ciascuna camera di un emocitometro.
    3. Contare il numero di cellule vitali all'interno dei quattro quadranti della emocitometro. cellule Vero morti prenderanno il Blu Trypan e, quindi, saranno di colore blu (queste cellule non devono essere conteggiati). Registrare questi numeri nella "cella del foglio Vero," a condizione.
    4. Somma il numero totale di cellule Vero vitali nei quattro quadranti e calcolare la media. Moltiplicare per il fattore di diluizione, che è 2 da 100 ml di cellule sono in un totale di 200 ml di liquido.
    5. Moltiplicare per il fattore di correzione per dare il "; numero di cellule / ml "Quando si usa un emocitometro, il fattore di correzione è sempre 10 4 Moltiplicare per il volume totale a dare." numero totale di cellule "..
  3. Determinare il numero di pozzetti necessari per ogni esperimento
    NOTA: un singolo campione (feci o contenuto intestinale) richiede 24 pozzetti separati da eseguire in duplice copia. È necessaria una concentrazione di 10 5 cellule Vero per pozzetto (volume totale di 90 microlitri).
    NOTA: Se si desidera incubare le cellule Vero piastre a 96 pozzetti notte a 37 ° C, una concentrazione di 10 3 cellule Vero per pozzetto è raccomandato per tenere conto del tempo di incubazione. I calcoli all'interno della cella del foglio Vero avrebbero bisogno di essere regolato per tenere conto di questo cambiamento.
    1. Determinare il numero di pozzetti che possono essere utilizzati in base alla quantità di cellule Vero disponibili (dal punto 5.2; utilizzare la cella di prospetto Vero, fornito).
    2. Determinare il volume disospensione cellulare Vero necessario per riempire il numero di pozzetti desiderati (in base al numero di campioni in prova). Assicurarsi che qualsiasi volume supplementare è aggiunto al conto per l'errore pipettando (utilizzare la condizione Vero cella del foglio di lavoro).
    3. Diluire la sospensione cellulare Vero (ottenuto nel passaggio 5.1.7) in mezzi DMEM 1x per ottenere il volume richiesto per l'esperimento.
  4. Cellule Vero semina in un 96 pozzetti cultura zolla delle cellule
    1. Utilizzando la risospensione delle cellule Vero dal punto 5.3.2, utilizzare una pipetta multicanale aggiungere 90 ml di sospensione cellulare Vero a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto di coltura cellulare a 96 pozzetti.
    2. Incubare la piastra con le cellule Vero in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 per almeno 4 ore prima di aggiungere tossina (campioni) ai pozzetti. Questo tempo di incubazione consentirà alle cellule Vero di aderire al fondo di ciascun pozzetto.
  5. Creazione di soluzioni madre dai campioni (feci oContenuto intestinale)
    NOTA: Tutti i campioni devono avere il "peso tubo" e "peso tubo finale" misurata tramite una scala analitica. Utilizzare Vero cella del foglio per i calcoli.
    1. Calcolare il peso del contenuto. Convertire g a mg, poi mg per ml. Calcolare il numero totale finale di ml di soluzione necessari per fare una diluizione 1:10 in PBS 1x. Calcolare la quantità totale di PBS 1x per aggiungere al campione.
    2. Aggiungere il volume totale di PBS 1x (calcolato sopra) al campione. Eseguire questa aerobico, e con tecnica asettica. Per pellet fecali, utilizzare la punta della pipetta di interrompere delicatamente il pellet nella soluzione.
    3. Agitare i campioni e poi centrifugare a 3.522 xg per 5 min a temperatura ambiente. Assicurarsi che la centrifuga è ben bilanciata. Fare attenzione a non disturbare il pellet e risospendere il campione in soluzione.
      NOTA: Durante la fase 5.5.3, anche se solo pochi campioni sono in fase di elaborazione, i contenuti possono essere sterilizzati confacendoli passare attraverso un filtro da 0,22 micron invece di utilizzare una piastra filtrante a 96 pozzetti. Alcuni campioni possono richiedere più filtri per sterilizzare l'intero contenuto del volume utilizzando questa tecnica.
    4. Sterilizzare la miscela campione / PBS prendendo 150 ml di surnatante e sistemazione in pozzetti separati su una piastra filtrante a 96 pozzetti. Posizionare la piastra filtrante saldamente sulla sommità di una piastra a fondo piatto di coltura cellulare a 96 pozzetti in modo che il contenuto sarà filtrata in questa piastra.
    5. Centrifugare la pila piastra di coltura piatto filtro / cellulare a 431 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che la centrifuga sia correttamente bilanciato e che il / Cell Stack piastra di coltura piastra filtrante sono strettamente allineati e non si sposterà durante la centrifugazione.
      NOTA: Questi contenuti filtrati sono lo stock di 10 -1 che verrà utilizzato nelle piastre di diluizione.
    6. Mettere piastra con i campioni filtro sul ghiaccio.
  6. Creazione di diluizione Plate # 1
    NOTA: diluizione PlaTE # 1 (DP 1 #) richiederà 6 pozzi per campione, tra cui positivo controlli negativi (1x PBS) (vedi il DP # 1 il layout sulla cella del foglio Vero) (C. difficile tossina A) e.
    1. Per preparare il controllo positivo (C. difficile tossina A) per questa analisi, ottenere 3 microlitri aliquote (1 mg / mL) da -80 ° C e aggiungere 297 ml di acqua ultrapura, ottenendo una concentrazione finale di 0,01 mg / mL. Mettere in ghiaccio.
    2. Etichettare i pozzi con le loro diluizioni (10 -1 a 10 -6) per ogni campione e indicare i controlli positivi e negativi (vedi il DP # 1 layout).
    3. Aggiungere adeguate quantità di 1x PBS a ciascun pozzetto. Nei 10 -1 pozzi, aggiungere NO PBS. Per i 10 -2 a 10 -6 pozzi, aggiungere 90 ml di PBS 1x.
    4. Aggiungere adeguate quantità di campioni in ciascun pozzetto. Nei 10 -1 pozzi, aggiungere 100 ml di brodo 10 -1 per ogni campione (vedere il passaggio 5.5.7 dal plat filtroe). Per i 10 -2 a 10 -6 pozzi, fare diluizioni seriali; cominciare prendendo 10 microlitri dal pozzo 10 -1 e aggiungendolo al 10 -2 bene. Continuare le diluizioni seriali fuori alla diluizione 10 -6.
    5. Coprire il DP # 1 piastra con un chiaro sigillo adesivo di plastica e posizionarlo sul ghiaccio.
  7. Creazione di diluizione Plate # 2
    NOTA: piastra di diluizione (DP # 2) richiederà 2 corsie di 6 pozzetti per ciascun campione, compresi i controlli positivi e negativi (vedere il layout DP # 2 sulla cella del foglio Vero).
    1. Etichettare i pozzi con le loro diluizioni (10 -1 a 10 -6) per ogni campione e indicare i controlli positivi e negativi (vedere il layout DP # 2). Etichettare i pozzetti con il nome del campione (indicato come "pozzi campione") o il nome del campione con l'antitossina (indicato come "pozzi di antitossina").
    2. Calcolare la quantità di antitossina richiesto per questo test. NOTA: L'antitossina è uno stock 25xsoluzione che deve essere diluito 1:25 in PBS 1x. Mettere la soluzione preparata antitossina 1x sul ghiaccio.
    3. Per "i pozzetti del campione," aggiungere 20 ml di PBS 1x per ogni bene per tutte le diluizioni (10 -1 a 10 -6) di quel campione. Per i "pozzi di antitossina," aggiungere 20 ml di 1x antitossina per ogni bene per tutte le diluizioni (10 -1 a 10 6) di quel campione.
    4. Trasferire 20 ml di campione diluito in pozzetti da DP # 1 nei pozzetti su DP # 2 per righe 1 - 6 e righe 7 - 12 (vedere la disposizione DP # 2 sulla cella di prospetto Vero). Mescolare lentamente la soluzione pipettando su e giù.
    5. Coprire DP # 2 per un buon sigillo adesivo plastico e consentire 40 min di incubazione a temperatura ambiente. Questo incubazione è quello di permettere l'antitossina di legare e quindi inattivare e neutralizzare la tossina di C. difficile.
    6. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 ml di miscela da DP # 2 alle appropriate pozzi cellule Vero (vedere il layout zolla delle cellule Vero sul Vero cella del foglio di lavoro). Mescolare delicatamente la soluzione pipettando su e giù, facendo attenzione a non disturbare le cellule Vero che sono rispettati la superficie inferiore dei pozzetti.
    7. Incubare la piastra di cellule Vero notte in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2.
  8. Valutare cellule Vero per arrotondamento utilizzando un microscopio ottico (giorno 2)
    NOTA: Ricordiamo che il fattore di diluizione cambia di un fattore pari a 10 quando si aggiungono le miscele campione alla piastra cellule Vero (ad esempio, 10 -3 è ora 10 -4). Wells che hanno antitossina presenti dovrebbero avere poco o nessun arrotondamento delle cellule Vero notato. Arrotondamento cellule Vero (citotossicità) sarà notato in campioni che contengono C. difficile tossina. Se l'attività citotossica è neutralizzata in una diluizione contenente il campione e l'antitossina, viene confermata la presenza di tossina di C. difficile conseguente citotossicità su cellule Vero.
    1. Esaminare per l'arrotondamento delle cellule Vero utilizzando un light microscopio a 200X ingrandimento. Per i pozzetti del campione (compreso il controllo positivo), registrare la diluizione del bene che è l'ultima ad avere l'80% di arrotondamento delle cellule Vero notato.
    2. Calcolare il titolo citotossico, che è definito come il reciproco della diluizione più elevata che ha prodotto 80% di cellule Vero arrotondamento per g di campione. Ad esempio, se la diluizione massima è 10 -5, allora il fattore di diluizione sarebbe 10 -6 per questo esempio. Così, il registro [fattore di diluizione finale] / g di campione sarebbe log [10 6], da cui si ricava un titolo reciproco di 6.
      NOTA: cellule Vero devono aver percorso almeno 3 - 4 passaggi e non più di 30 passaggi prima del loro utilizzo in questo test 26.

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Representative Results

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Durante uno studio rappresentativo, 5 settimane di età C57BL / 6 topi WT sono stati pretrattati con cefoperazone nella loro acqua potabile (0,5 mg / ml) per 5 giorni e ha permesso a 2 giorni lavare con acqua potabile normale. I topi sono stati sfidati con 10 5 spore di C. difficile R20291 tramite sonda gastrica al giorno 0 (Figura 1A). I topi sono stati monitorati per la perdita di peso e segni clinici (letargia, inappetenza, diarrea, e la postura ingobbita) di CDI per 14 giorni. La sfida di C57BL / 6 topi WT con spore di C. difficile R20291 provocato diarrea entro 24 ore e significativa perdita di peso entro 48 ore post-sfida (Figura 1B). Anche se non osservata in questo esperimento, i topi sfidato con una dose maggiore di C. difficile R20291 possono diventare gravemente ammalati o avere superiore al 20% la perdita di peso da 48-72 ore post-sfida, che richiede quindi l'eutanasia umana. Pertanto, topi richiedono un minimo di due volte al giornoil monitoraggio dopo sfida con spore di C. difficile.

In questo studio rappresentativo, una notevole quantità di perdita di peso e sintomi clinici della malattia nei topi è stato osservato anche nei giorni 2-7 post-sfida (Figura 1B). A 7 giorni post-challenge, i topi hanno cominciato ad aumentare di peso, e segni clinici di malattia placata. Con l'ultima settimana di questo esperimento, i topi è apparso clinicamente normale, senza evidenza dei segni clinici di CDI, tra cui la diarrea.

Pellet fecali sono stati raccolti prima della sfida con spore di C. difficile e ogni 48 ore post-sfida (Figura 1C). Prima del trattamento antibiotico, topi non furono colonizzate con C. difficile. All'interno di posta sfida 24 ore con spore di C. difficile, i topi sono stati colonizzati con 10 7 UFC di C. difficile per g di feci (Figura 1C </ Strong>). Mice è rimasto persistentemente colonizzato da C. difficile tutto l'esperimento, nonostante nessuna prova di perdita di peso o segni clinici di CDI per gli ultimi 7 giorni dell'esperimento.

Figura 1
Figura 1: Cefoperazone topi trattati sfidati con C. difficile R20291 perdita Exhibit peso e sono colonizzate con C. difficile. A) 5 settimane di età C57BL 6 topi / WT JAX (n = 3M / 3F per gruppo) sono stati pretrattati con cefoperazone nella loro acqua potabile (0,5 mg / ml) per 5 giorni e ha permesso a 2 giorni lavare con regolare potabile acqua. I topi sono stati sfidati con 10 5 spore di C. difficile R20291 tramite sonda gastrica il giorno 0. I topi sono stati monitorati per la perdita di peso e segni clinici (letargia, inappetenza, diarrea, e la postura ingobbita) di CDI per 14 giorni. Feci sono stati raccolti e utilizzati per il conteggio dei batteri prima di iniziare cefoperazone, subito after finire l'antibiotico, e ai giorni 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, e 14 durante l'infezione. Necroscopia è stato eseguito nei giorni 0, 2, 4, 7, e 14 B) I topi ha perso una quantità significativa del loro peso basale dopo sfida con C. difficile R20291. Il peso corporeo medio di topi è stata misurata ogni giorno dalle giorno 0. Significativa perdita di peso è stato visto nei giorni 2 a 7 rispetto al giorno 0, il peso della linea di base. C) C. difficile R20291 carica batterica nelle feci dopo la sfida. Entro 24 ore dopo la sfida con spore di C. difficile, tutti i topi sono stati colonizzati con 10 7 CFU (unità formanti colonia) per g di feci. Non ci sono differenze significative in questi parametri sono stati osservati tra femmine e maschi. La significatività è stata determinata con il test ANOVA non parametrico di Kruskal-Wallis a senso unico seguito da post-test di Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001; ****, p Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Quattro topi (2 maschi e 2 femmine) sono stati umanamente eutanasia e preparati per la necroscopia al giorno 0, prima di infezione, per servire come controlli non infetti. Inoltre, un mouse da ciascuna gabbia era umanamente eutanasia e preparato per necroscopia nei giorni 2, 4, 7, e 14 post-sfida (Figura 1A). Conteggio di C. difficile all'interno del contenuto del cieco è stato eseguito ad ogni necroscopia. In accordo con l'enumerazione fecale, nessun C. difficile è stato rilevato nel contenuto cecale di topi prima della sfida con C. difficile. A 48 ore post-sfida, i topi sono stati colonizzati con circa 10 CFU 8 di C. difficile per g di contenuti del cieco (Figura2A). Tutti i topi sono rimasti persistentemente colonizzato tutto l'esperimento.

Contenuto del cieco è stato valutato anche durante l'infezione per la presenza di tossina di C. difficile utilizzando il test di citotossicità su cellule Vero. Nessuna evidenza di C. difficile tossina citotossicità è stata rilevata nel contenuto cecale precedenti alla sfida (Figura 2B). C. citotossicità difficile è stato rilevato 2 giorni dopo la sfida con spore di C. difficile e persisteva per tutta l'infezione. Nonostante la colonizzazione abbastanza uniforme con C. difficile, variazione dei livelli di C. difficile attività citotossica è evidente in topi individuali (Figura 2B).

La maggior parte dei contenuti del mouse cecal neutralizzato con antitossina di C. difficile durante il test di citotossicità delle cellule Vero e non aveva alcun segno di tossicità (Vero cell arrotondamento) nelle diluizioni effettuate. Tuttavia, alcuni topi individuali, nonostante retesting, avevano evidenza di 50 - 100% citotossicità in 10 -1 di diluizione (diluizione dove il campione è più concentrata), senza evidenza di cellule Vero arrotondamento nelle altre diluizioni. L'antitossina utilizzato in questo saggio è un policlonale anticorpi neutralizzanti al C. difficile tossina, preparata nelle capre 27. Pertanto, questo antitossina non può neutralizzare la tossina di C. difficile binario che viene prodotta dal ceppo R20291. Tuttavia, la tossina binaria C. difficile non è considerato essere citotossici 10. Un'eccessiva C. difficile tossina in grado di essere neutralizzato l'antitossina o la presenza di un altro agente citotossico diverso C. difficile tossina potrebbe contribuire a questo risultato. Questa osservazione non influenzare la determinazione del titolo citotossicità per questi campioni, dallo scorso la diluizione di ogni campione con l'arrotondamento delle cellule Vero 80% ha avutonessun segno di tossicità quando combinato con l'antitossina alla diluizione specificata.

figura 2
Figura 2: La colonizzazione del cieco e citotossicità durante l'infezione con C. difficile R20291. A) Mouse ceca è rimasto persistentemente colonizzato da C. difficile tutto l'esperimento, nonostante la risoluzione dei segni clinici e l'aumento di peso osservato. Tutti i topi sono stati colonizzati con più del 10 8 UFC per g di contenuto cecale quando valutati a 2 giorni dopo la sfida. B) test di citotossicità delle cellule Vero dal contenuto del cieco durante l'infezione da C. difficile R20291. Dopo la sfida con spore di C. difficile, i topi avevano livelli significativi di citotossicità, misurata in log 10 di diluizione reciproco di tossina per g di contenuti del cieco nei giorni 2, 4, e 7 post-sfida rispetto al giorno 0 (mediane represented dalla linea). La significatività è stata determinata con il test ANOVA non parametrico di Kruskal-Wallis a senso unico seguito da post-test di Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001 ). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard dalla media. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Si raccomanda che la valutazione istologica è condotta da un patologo veterinario bordo certificata in modo cieco. Per il punteggio del tessuto, un sistema di punteggio numerico 0-4 dovrebbe essere impiegato per valutare separatamente l'edema, infiltrazione di cellule infiammatorie, e danni alle cellule epiteliali nel ileo, cieco, colon e sulla base di uno schema di punteggio precedentemente pubblicato 17.

Su esame istopatologico accecatoinazione del murino ileo, cieco, e due punti che seguono sfida con C. difficile R20291, le più significative alterazioni patologiche sono stati notati nel cieco (Figura 3). I punteggi totali istologiche cecale erano significativamente differenti tra il giorno 0 e giorni 2 e 4 post-sfida. Nessuna lesione significativa è stata notata nell'ileo tutta infezione (Figura 3). Le lesioni più lievi sono stati notati nel colon. I punteggi totali istologici del colon sono risultati significativamente differenti tra il giorno 0 e giorni 2 e 7 Post sfida (Figura 3).

Rappresentante H & E sezioni del ileo, cieco e del colon in tutto infezione sono disponibili nella figura 4. Ogni immagine ha il suo rispettivo punteggio istologico totale e punteggi singoli per danno epiteliale, infiammazione ed edema, come determinato da un patologo veterinario bordo certificata cieco ( SAM).


Figura 3: punteggio istologico del Murine Ileo, Intestino cieco, e del colon durante l'infezione con C. difficile R20291. Totale punteggi istologici sono stati calcolati sommando tutti e tre i punteggi dei parametri valutati: epiteliale danni, infiammazione ed edema. Non sono significativi cambiamenti istopatologici sono stati notati nell'ileo tutta infezione. tessuto cecal conteneva le lesioni istologiche più significativi durante CDI. I punteggi totali istologici cecale erano significativamente differenti dal giorno 0 nei giorni 2 e 4 post-sfida. Le lesioni più lievi sono stati notati nel colon. I punteggi totali istologici del colon erano significativamente differenti dal giorno 0 nei giorni 2 e 7 post-sfida. La significatività è stata determinata con il test ANOVA non parametrico di Kruskal-Wallis a senso unico seguito da post-test di Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p804; 0.001; ****, P ≤ 0,0001). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard dalla media. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: istopatologia durante l'infezione con C. difficile R20291. Questo pannello contiene rappresentativi sezioni H & E di ileo, cieco e del colon in tutto infezione da C. difficile R20291. I punteggi istologici totali sono tra parentesi () per il corrispondente giorno e tessuti elencati: per il giorno ileo 0 (0), il giorno 2 (1), il giorno 4 (0), il giorno 7 (0), e il giorno 14 (0) ; per il giorno cieco 0 (0), giorno 2 (5), il giorno 4 (4), il giorno 7 (3), e il giorno 14 (3); e per il giorno colon 0 (0), giorno 2 (4), giorno 4 (1), il giorno 7 (4), e il giorno 14 (2). Microfotografie sono stati ottenuti su un Microscopio di lucee con una fotocamera digitale da 5 megapixel e il relativo software (la barra della scala rappresenta 200 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1x PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1x Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

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References

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Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain
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Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).More

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

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