Summary
このプロトコルは、臨床的に関連すると遺伝的に扱いやすい歪み、R20291を使用して、 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）のセフォペラゾンマウスモデルの概要を説明します。臨床疾患のモニタリング、 ディフィシル細菌列挙、毒素の細胞毒性、およびマウスモデルにおいてCDIを通じて組織病理学的変化を重視したプロトコルで詳述されています。
Introduction
クロストリジウム・ディフィシルは、生命を脅かす下痢1の原因となる嫌気性、グラム陽性、芽胞形成桿菌です。 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）が増加し、ヒトの罹患率および死亡率と年間1-4あたりの医療費のオーバー$ 4.8十億の結果と関連しています。 2013年には、疾病管理予防センター（CDC）は、それが公衆衛生1に緊急の脅威をもたらすことを示す、緊急の抗生物質耐性のリスクとしてクロストリジウム・ディフィシルを分類しました。現在、抗生物質バンコマイシンによる治療およびメトロニダゾールはCDI 5のためのケアの標準と考えられています。患者2,5-7の30％ -残念ながら、抗生物質による治療成功後のCDIの再発は20で発生した、高いです。したがって、この腸管病原体に対する新規治療法の発見が必要です。 ディフィシル 、交流で人間の病気を近似するモデル動物に対する治療薬を評価するために、linically関連株が必要とされています。
最初は、コッホの仮説は、クリンダマイシン処理したシリアンハムスターモデル8を使用して、1977年にC.ディフィシルのために設立されました。このモデルは、まだ病因9,10上のC.ディフィシル毒素の効果を調査するために、今日利用されています。しかし、CDIは、ハムスターモデルで高い死亡率をもたらし、CDI 10,11を有するヒトで見られる慢性潜行性の疾患の症状を近似しません。研究におけるマウスのプラットフォームのアクセシビリティと試薬可用性に基づいて、CDIのマウスモデルは関連しています。
2008年には、CDIの堅牢なマウスモデルは、クリンダマイシン12の腹腔内注射した3日間飲料水中の抗生物質カクテル（カナマイシン、ゲンタマイシン、コリスチン、メトロニダゾール、及びバンコマイシン）でマウスを処理することによって設立されました。これは、CDIと重度の大腸炎の影響を受けやすいマウスをレンダリング。左右される投与接種用量にる、臨床徴候および死亡率の範囲は、このモデルを用いて観察することができます。この時以来、様々な抗生物質療法は、 クロストリジウム・ディフィシルが消化管コロニー形成することができる点に植民地抵抗を低減、マウスの腸内細菌叢を変化させることが検討されている（ベストらに検討を。そしてローリー＆ヤング）13,14。
最近になって、5または10日間、飲料水中に与えられた広域スペクトルセファロスポリン、セフォペラゾンは、再現CDI 15感受性マウスをレンダリングします。第三世代セファロスポリンの投与は、ヒトにおけるCDIのリスク増加と関連しているので、セフォペラゾンモデルの使用は、より正確に天然に存在する病気16を反映しています。 クロストリジウム・ディフィシルの影響を受けやすいセフォペラゾン処置したマウスは、 クロストリジウム・ディフィシル胞子および臨床に至るまでの株の様々な栄養細胞の両方でチャレンジされています関連性と毒性17。感染性形態としてクロストリジウム・ディフィシレ栄養細胞を利用し、元の研究のいくつかにもかかわらず、 クロストリジウム・ディフィシルの胞子は変速機18の主要なモードと考えられています。
過去十年間では、C。ディフィシル R20291、NAP1 / BI / 027株は、CDI 19,20の流行を引き起こし、浮上しています。私たちは、セフォペラゾン処置したマウスは、R20291、臨床的に関連すると遺伝的に扱いやすいC.ディフィシル株で攻撃したとき、疾患の臨床経過を決定しようとしました。このプロトコルは、体重減少、細菌コロニー形成、毒素の細胞毒性、およびC.ディフィシル R20291の胞子でチャレンジしたマウスの胃腸管における組織病理学的変化を含め、臨床経過を詳しく説明します。全体として、このマウスモデルは、CDIは、ヒトの疾患を近似するための貴重な実験プラットフォームであることが分かります。この特徴づけマウスモデルは、このような効果を評価するために利用することができます臨床疾患の改善にとC.ディフィシルに対する植民地抵抗の回復に対する新規治療薬の。
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Protocol
倫理的な声明：
獣医のノースカロライナ州立大学カレッジの施設内動物管理使用委員会（IACUC）（NCSU）は、この研究を承認しました。 NCSU動物管理ポリシーを使用しNCSUで1985実験動物施設の動物保護法およびヘルスリサーチ延長法に定める基準とガイドラインは、 実験動物の管理と使用に関する指針に定められたガイドラインに準拠して適用されます。動物の健康状態を毎日評価し、瀕死の動物は人道的に二次対策が続くCO 2窒息により安楽死させました。訓練された動物の技術者や獣医師は、この研究の間、AAALAC認定施設で畜産業を行いました。
C.ディフィシル植民地や疾患に対する感受性を達成するために飲料水における抗生物質セフォペラゾンの1.管理
注：5〜8週齢のC57BL / 6 WTマウス（雌雄）前抗生物質の水の投与開始に購入し、1週間のために隔離されました。検疫に続いて、マウスをオートクレーブ処理、食品、寝具、水で飼育しました。ケージの変化は、層流フード中で実験室のスタッフが、毎週行われました。
- 7日前の課題の目標日（ 図1）に滅菌蒸留水にセフォペラゾン（0.5 mg / mlで）を準備します。
- セフォペラゾン水でオートクレーブ処理水ボトル（0.5 mg / mlで）を記入し、各マウスのケージの中にそれらを配置します。
注：新たに調製セフォペラゾン水ステップ1.1および1.2に示すように、5日間の期間中に行われたと2日ごとに出て変更する必要があります。制度的環境の健康と安全のガイドラインに従ってセフォペラゾン水の適正処理をお勧めします。 - セフォペラゾン水に5日後、滅菌蒸留水で満たされたオートクレーブ処理水のボトルとボトルを交換してください。実験期間中、マウスにこの飲料水を与えます。
2. C.ディフィシレ胞子接種材料の作製とマウスの経口胃管栄養法
注：始める前に、以下の項目は、少なくとも24時間、嫌気性チャンバー内に設置されていることを確認：1×リン酸緩衝生理食塩水（PBSを、マテリアルを参照してください）、タウロコール酸サイクロセリンのセフォキシチンフルクトース寒天（TCCFA）プレート（材料と補足ファイルを参照してください）、および滅菌L字型ヒートスプレッダ。
注： クロストリジウム・ディフィシル胞子でチャレンジしたマウスは、バイオセーフティレベル2動物施設に収容する必要があります。
- 以前製造し、滅菌水21,22に4℃で保存した（この場合、R20291での）目的の株のC.ディフィシレ胞子の株式を取得します。使用前に、この胞子株の列挙を決定します。
- 胞子株の既知濃度（胞子/ ml）に基づいて、25μlの当たり10 5胞子を得ることが所望の希釈を計算します。接種量はすべて接種するのに十分であることを確認します実験（マウス当たり25μlの）のマウス、接種物（約30μL）の列挙を実行するために、ピペッティングの誤差を考慮するため。
- 渦元ディフィシレ胞子ストック。そして、スクリューキャップマイクロ遠心チューブ内の滅菌水で元のC.ディフィシレ胞子ストック（ステップ2.2）から計算されたボリュームを再懸濁します。層流フード内で好気的にこれを実行します。この希釈された混合物を識別し、「胞子接種。」
- 65℃の水浴中に胞子接種物を置き、20分間それを加熱します。
注：この手順は、アクティブなクロストリジウム・ディフィシルの胞子は、熱処理後に残ることが保証されます。 - 層流フード内には、滅菌マイクロチューブに配置し、加熱された胞子接種の50μLを取り、嫌気室23に渡します。胞子計数のために、このサンプルを使用してください。
- 層流フード内で、残りの加熱された胞子接種のint型をロードoaに1-mlの注射器は滅菌電球ひっくり返した胃強制経口投与針に取り付けられています。マウスの間、正確かつ迅速な反復投与を確実にするために、手動シリンジステッパを利用します。胃管栄養針を使用する前に加熱された胞子接種で満たされていることを確認してください。
注：各マウスのための新しい滅菌胃管栄養針は必要ありません。 C.ディフィシレ胞子の様々な用量が投与されている場合は、新しい胃管栄養針が各用量を推奨します。
注：C.ディフィシル胞子は、伝統的な消毒剤への耐性が高いです。したがって、このような＃62 Perisept殺胞子消毒剤として殺胞子殺菌剤の使用は、必要です。メーカーは、 クロストリジウム・ディフィシル胞子を破壊する2分間の接触時間をお勧めします。 - 胃管栄養胞子接種25μlの各マウス。ヘッドを固定化するために、首と背中のたるんだ皮膚によって動物をつかんで静かに各マウスを抑えます。人差し指を使用すると、動物の頭を固定し、へ食道を細長いです。動物は発声や拘束時の苦痛の他の徴候を示していないことを確認してください。
注：胃管栄養法によりマウスに投与し、総容量は10ミリリットル/ kg体重（0.1ミリリットル/ 10グラム）を超えてはなりません。 - 直立、垂直位置でマウスを維持し、そっと口の側に強制経口投与針を渡します。口の屋根に沿って胃管栄養針を向けると、ゆっくりと食道に胃管栄養針を進めます。
注：任意の抵抗に遭遇した場合、胃管栄養針が気管に入ることができるため、高度なされるべきものではなく、すぐに削除され、再配置さ。 - 胃管栄養針が食道にほぼ中間た後、加熱された胞子接種の25μLを注入し、静かに食道から胃管栄養針を撤回。
注：胃管栄養針の説得力進歩は、食道や胃の破裂につながる可能性があります。そのため、抵抗に遭遇した場合に強制経口投与針を進めた場合には、それはすぐに削除して強制経口投与針の位置を変更することをお勧めします。 - そのケージに動物を返し、これは不注意気管内投与または加熱された胞子接種の吸引を指示することができるように、任意の咳や呼吸困難の徴候のためにそれを観察します。
注：マウスは、抗生物質治療後のクロストリジウム・ディフィシルに非常に敏感です。したがって、ケージの間の交差汚染を防止するための予防措置が不可欠です。コントロールとして扱わ抗生物質が、比類のないマウスを管理する場合、これは特に重要です。 - すべてのマウスに接種した後、滅菌マイクロチューブに残っている加熱された胞子接種を配置し、胞子計数のための嫌気性チャンバーにそれを渡します。
- 加熱された胞子接種の列挙のために、残りの強制飼養加熱胞子接種（ステップ2.4から）、1×PBS中の各接種物の1:10連続希釈液を作ります。 5希釈（ すなわち、10 -1を介して- 4作り、プレートすることをお勧めします10 -5）。
- 無菌技術を使用して、個々のTCCFA板上に各シリアル希釈液100μlを移します。
- 無菌のL字形のスプレッダーを使用して、均等にプレート全体の媒体に適用希釈を広げます。でも希釈した接種材料の広がりが胞子の正確な列挙のために不可欠です。
- 37℃で24時間嫌気的に培養します。 24時間後、 クロストリジウム・ディフィシルコロニー形成単位（CFUのは）（補足ファイル」の計算例」を参照）を25μl（0.025ミリリットル）容積でマウスに投与感染量を得るために列挙することができます。 C.ディフィシルのコロニーは平坦で淡黄色であり、不規則なエッジとすりガラスの外観24を有しています。
注：細菌の計数のための検出限界は10 2 CFUです。
3. クロストリジウム・ディフィシル感染症全体でマウスの減量及び疾患の臨床徴候を監視
- 量ります抗生物質のオフ2日間の回復後5日間セフォペラゾン抗生物質治療、（0日）の前後nimals、その後、実験期間のため。
注：毎日一貫した時にウェイトを取得します。重みは、チャレンジの日（0日目）は、C。ディフィシル感染症全体で比較するための最初のベースライン重みとして使用する必要があります取得しました。 - バイオセーフティキャビネットにデジタルスケールを配置します。スケールの上に滅菌プラスチックビーカーを置き、プラスチックビーカーの重量を風袋引き。そして、静かに尾の付け根によってマウスをピックアップし、プラスチックビーカーにそれを置きます。
- バック規模でビーカーを置きます。マウスが逃げないことを確実にするために、ビーカーの上に手を置きます。安定重量を得るために3秒 - それは2を取ることができます。そして、そっと背中そのケージにマウスを置きます。この重量を記録し、そのケージ内の各マウスのためのプロセスを繰り返します。
注：注意事項は、クロスcontaminaを防ぐために取られることが肝要ですケージの間化の重みを求めます。マウスの各ケージは、計量のために、独自のプラスチックビーカーを持っている必要があります。プラスチックビーカーは、各使用の間に殺胞子剤で消毒し、滅菌アルミホイルでカバーされるべきです。
- バック規模でビーカーを置きます。マウスが逃げないことを確実にするために、ビーカーの上に手を置きます。安定重量を得るために3秒 - それは2を取ることができます。そして、そっと背中そのケージにマウスを置きます。この重量を記録し、そのケージ内の各マウスのためのプロセスを繰り返します。
- 嗜眠、食欲不振、下痢、および猫背の姿勢を含む臨床的に重度のクロストリジウム・ディフィシル感染症の兆候のために1日2回（最低でも）挑戦動物を監視します。
- 人道的に彼らの初期のベースラインの体重の20％を失った動物を安楽死させるおよび/または（ステップ3.3に記載されている）、C。ディフィシル感染症の重篤な臨床徴候を開発しています。
注：必要に応じて、 クロストリジウム・ディフィシル感染症の臨床徴候を表示するマウスは、彼らが最初のベースライン体重の20％を失っていないことを確認するために、実験中に秤量する必要があります。実験では初期の時点の間に、これは1日2回の測定を意味するかもしれません。
C.ディフィシルの4細菌列挙マウス糞便および盲腸内容物から
注：1×PBS（材料を参照）、TCCFAプレート（材料参照）、無菌のL字型スプレッダー、および滅菌マイクロチューブおよび/または：始める前に、以下の項目は、少なくとも24時間、嫌気性チャンバー内に配置されていることを確認希釈用のPCRプレート。
- C.ディフィシル列挙するためのサンプルを得ます
注：糞や盲腸コンテンツを取得する前に、分析的規模で滅菌マイクロチューブの重量を量ります。 4小数点以下（ 例えば、0.9864グラム）に丸め、チューブの側にチューブの重量を記録します。この重みを表す "チューブ重量。」収集した各サンプルは、滅菌、秤量したマイクロチューブに配置する必要があります。- マウスの糞の無菌コレクション
- 軽く頭を固定化するために、首と背中のたるんだ皮膚によって動物を把握することにより、各マウスを抑えます。トン、静かに動物の尾を抑制するために小指を使用しますHUSは肛門を露出させます。動物は発声や拘束時の苦痛の他の徴候を示していないことを確認してください。
- 滅菌を持ち、直接動物の肛門の下でマイクロチューブの重量を量りました。管は、マウスに直接接触しないことが肝要です。
- 動物は排便のように、チューブに糞を収集します。すべての糞便サンプルが収集されるまで室温でチューブを保管してください。マウスは排便することは、このように糞を収集するために繰り返し試みを必要と、数分かかることがあります。
- 分析スケールでの糞を含むチューブを秤量します。 4小数点以下（ 例えば、1.0021グラム）に丸め、チューブの重量を記録します。以下のようにして得られた重みを表す「最終チューブの重量。」
- 直接便の採取後に細菌の計数のための嫌気性チャンバー内に糞便サンプルを渡します。
- 剖検時のマウス盲腸内容物の無菌コレクション
- 二次対策に続いてCO 2窒息により人道的な安楽死の後、盲腸25を得るために剖検を行います。盲腸は、胃腸管の大規模な、コンマ状の部分です。
- 滅菌プラスチックペトリ皿に盲腸を置きます。使い捨て、滅菌なしを使用してください。 10手術用メスの刃は、盲腸内容物を露出させるために、ポーチの盲端からオープン盲腸をカットします。
- ゆっくりメスの刃で光の圧力を適用し、盲腸の切開部に向かって内容を掃引することによって盲腸内容物を抽出します。
注：ケアは、病理組織学的検査のために提出される盲腸組織を、中断しないように注意する必要があります。
- ゆっくりメスの刃で光の圧力を適用し、盲腸の切開部に向かって内容を掃引することによって盲腸内容物を抽出します。
- 滅菌に盲腸内容物を置き、収集直後にマイクロチューブを秤量しました。盲腸内容物の約10 mgを細菌計数のために必要とされます。
- 分析年度に盲腸内容物を含むチューブを秤量電子。 4小数点以下（ 例えば、1.0021グラム）に丸め、チューブの重量を記録します。以下のようにして得られた重みを表す「最終チューブの重量。」
- 細菌の計数のための嫌気性チャンバー内に盲腸内容物のサンプルを渡します。
- マウスの糞の無菌コレクション
- C.ディフィシルの細菌列挙
- クロストリジウム・ディフィシルのために列挙された内容（糞や盲腸）の最終重量を計算します。 「最終チューブの重量を "差し引くことによって、これを実行される「チューブの重量。」
- 1X PBSに内容の1:10希釈を計算し、それに応じて再懸濁します。糞粒のために、静かに（補足ファイル」の計算例」を参照）溶液中にペレットを破壊するためにピペットの先端を使用します。
- 嫌気内容は沈降させ、30分間室温でこれらの再懸濁サンプルをインキュベートします。
- 列挙型のために1×PBSで各サンプルの連続希釈液を作りますコンテンツ（糞便または盲腸）のグラム当たりのCFUのeration。嫌気的にこれを実行します。
- 無菌技術を使用して、TCCFAプレートに各シリアル希釈液100μlを移します。無菌のL字形のスプレッダーを使用して、均等にプレート全体に広がるようにメディアに適用される希釈を広げます。でも希釈の広がりは、コロニーの正確な列挙のために不可欠です。
- 37℃で24時間嫌気的に培養します。このとき、コンテンツ（糞便または盲腸）のグラム当たりのCFUを得るために、 クロストリジウム・ディフィシルのコロニーを列挙。 C.ディフィシルのコロニーは平坦で淡黄色であり、不規則なエッジとすりガラスの外観24を有しています。
注：このプロトコルは、回腸および結腸内容を含む他のネズミのGIコンテンツから、 クロストリジウム・ディフィシルを列挙するために使用することができます。 PCRプレートを連続希釈物を作製するために使用することができます。
C.ディフィシル毒素Cytotoxiを定量化するために5 Vero細胞毒性アッセイシティ
注：これは、このアッセイは、サンプル剖検時に採取し、-80℃で保存上のマウスモデルの完了後に実行することをお勧めします。無菌細胞培養技術は、このアッセイ中のVero細胞の汚染を防止するために不可欠です。このプロトコルは、実行するために2日かかります。すべての糞と、このアッセイで利用腸の内容物を秤量し、滅菌マイクロチューブに格納する必要があります（で示される「チューブの重量、 "上記のセクションを参照してください）。 （内容を含む）、最終チューブの重量は最寄の4小数点以下の分析スケールを介して測定される（上記のセクションを参照してください）。マルチチャンネルピペットの使用は、このアッセイのために推奨されます。
注：ベロ細胞を、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンをメディアでダルベッコのイーグル培地の改変（DMEM）1Xは（DMEM 1X」と表記：開始する前に、次の項目が使用可能であることを確認メディア; "材料と補足ファイルを参照してください）、0.25％超純水で1μgの/μlので3μlの中のトリプシンEDTA、1×PBS、0.4％トリパンブルー、96ウェル細胞培養平底プレート、96ウェルフィルタープレート、 クロストリジウム・ディフィシル毒素A（分量と-80℃で保存）、 クロストリジウム・ディフィシル抗毒素、計算やプレートマップのワークシートが（;補足ファイルを参照してください）。
注：注意クロストリジウム・ディフィシルとその毒素に対する人事露光のために、このアッセイの間に取られるべきです。
- ベロ細胞分割（1日目）
- DMEM 1X培地、0.25％トリプシンEDTA、及び1×PBSを37℃の水浴中で予熱します。
- 細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）からのVero細胞のフラスコを取得し、無菌細胞培養層流フードに配置。使用前にフードや機器を拭うために70％エタノールを使用してください。血清学的ピペットを使用して、ベロ細胞から取り外し、廃棄物cにそれを廃棄し、組織培養フラスコから培地を吸引ontainer。
- 1×PBS 5mlでVero細胞をすすぎ、組織培養フラスコ中で（予熱）。 PBSを吸引し、廃棄物容器にそれを捨てます。
- 組織培養フラスコに、0.25％トリプシン-EDTAの5ミリリットルを追加します。 3分 - 2の接触時間を許可します。この間、細胞を観察するには、フラスコ表面から脱落し始めます。静かにVero細胞を緩めるために左右に組織培養フラスコ側を揺らし。
- トリプシンEDTAとの接触時間の後、すぐに組織培養フラスコにDMEM 1×培地の5ミリリットルを追加します。これは、トリプシン-EDTAを中和します。優しくフラスコの背面にある任意の付着していないVero細胞を洗浄するために、このソリューションを使用してください。その後、15mlのコニカルチューブにこの混合物を転送するために血清学的ピペットを使用しています。
- 遠心分離機180×gで5分間、25°Cのための円錐管中でVero細胞を。遠心分離器が適切にバランスしていることを確認してください。遠心分離後、コニカルチューブの底にVero細胞の可視ペレットを観察します。ないDISRに注意してくださいこのペレットをUPT。円錐管からの上清を吸引除去し、それを捨てます。
- DMEM 1X培地3mlにベロ細胞を再懸濁します。
- Vero細胞を計数
- 0.4％トリパンブルーの100μlに（ステップ5.1.7で行われた）Vero細胞懸濁液100μlを加えます。静かに上下ソリューションをピペットで混ぜます。
- 血球計数器の各チャンバーに、この混合物の10μlのを追加します。
- 血球計数器の4つの象限内の生存細胞の数をカウントします。死んだVero細胞は、（これらの細胞はカウントされません）トリパンブルーを取り上げるので、青色に染色されます。これらの数字を録音する "ベロ細胞のワークシート、"提供。
- すべての4つの象限中の生存Vero細胞の総数を合計し、平均値を算出します。細胞100μlを液体200μlの合計であるので、2で希釈係数で乗算します。
- 「与えるために補正係数を掛け;細胞数/ mlの「血球計数器を使用する場合、補正係数は、常に10 4で得た総体積を掛ける。「細胞の総数」。
- 各実験についてウェルズ必要な数の決定
注：単一のサンプル（糞便または腸の内容のいずれか）が重複して実行される24の別々のウェルが必要です。ウェルあたり10 5個のVero細胞（90μlの総体積）の濃度が必要です。
注：1は37℃で一晩ベロ細胞を96ウェルプレートをインキュベートすることを望む場合には、ウェル当たり10 3 Vero細胞の濃度は、拡張インキュベーション時間を考慮することをお勧めします。ベロ細胞ワークシート内の計算は、この変化を考慮して調整される必要があります。- （ステップ5.2から、ベロ細胞のワークシート、提供を使用します）利用可能なVero細胞の量に基づいて利用することができるウェルの数を決定します。
- の音量を決定しますベロ細胞懸濁液（試験される試料の数に基づく）所望のウェルの数を満たすために必要。追加のボリュームが（提供ベロ細胞のワークシートを使用）エラーをピペッティングするためのアカウントに追加されていることを確認。
- 実験に必要な体積を得るために、DMEM 1X培地に（ステップ5.1.7）で得られたベロ細胞懸濁液を希釈します。
- 96ウェル細胞培養プレートに播種Vero細胞
- ステップ5.3.2からのベロ細胞の再懸濁を用いて、96ウェル細胞培養平底プレートの各ウェルにベロ細胞懸濁液の90μLを加えるために、マルチチャンネルピペットを使用します。
- ウェルに毒素（サンプル）を添加する前に、4時間の最低ベロ37℃で細胞培養インキュベーター中で細胞を、5％CO 2でプレートをインキュベートします。このインキュベーション時間は、Vero細胞を、各ウェルの底に付着することができます。
- （糞便またはサンプルから原液を作成します腸の内容）
注：すべてのサンプルは分析規模を経由して測定された「チューブ重量」と「最終チューブの重量を "持っている必要があります。計算のためのVero細胞のワークシートを使用してください。- 内容物の重量を計算します。 MGにグラムを変換し、その後μlにはmg。 1×PBSで1:10希釈液を作るために必要なソリューションのμlの最終合計数を計算します。サンプルに追加する1×PBSの総量を計算します。
- サンプルに1×PBS（上記で計算）の総容量を追加します。好気的にこれを実行し、無菌技術を使用して。糞粒のために、静かに溶液中にペレットを破壊するためにピペットの先端を使用します。
- サンプルをボルテックスし、次いで、室温で5分間、3522×gで、それらを遠心分離します。遠心分離器が適切にバランスしていることを確認してください。ペレットを破壊し、溶液中にサンプルを再懸濁しないように注意してください。
注：ほんの数のサンプルが処理されている場合、ステップ5.5.3の間、内容によって滅菌することができます96ウェルフィルタープレートを使用する代わりに、単一0.22μmのフィルターに通します。いくつかのサンプルは、この技術を使用してボリューム全体の内容を滅菌するために複数のフィルタを必要とし得ます。 - 上清の150μLを取り、96ウェルフィルタープレート上の別々のウェルにそれを置くことによって、サンプル/ PBS混合物を滅菌します。内容はこのプレートにフィルタリングするように、96ウェル細胞培養平底プレートの上にしっかりとフィルタープレートを置きます。
- 室温で5分間、431×gで遠心分離フィルタープレート/細胞培養プレートスタック。遠心分離器が適切にバランスが取れていることを確認し、フィルタープレート/細胞培養プレートスタックはしっかりと合っていることを、遠心分離中にシフトしません。
注：これらのフィルタ処理内容は希釈プレートに利用されるであろう10 -1入荷です。 - 氷の上にフィルタリングのサンプルでプレートを置きます。
- 希釈プレート＃1を作成します
注：希釈プラTE＃1は、（DP＃1）（ベロ細胞のワークシート上のDP＃1レイアウトを参照してください）正（C.ディフィシル毒素A）と負（1×PBS）対照を含むサンプルあたり6ウェル、必要になります。- このアッセイの陽性コントロール（C.ディフィシル毒素A）を調製し、-80°Cから3-μlのアリコート（1μgの/μl）を取得し、0.01μgの/μlの最終濃度を得、超純水297μlを添加します。氷の上に置きます。
- 各サンプルのための彼らの希釈（10 -1〜10 -6）でウェルにラベルを付け、陽性および陰性対照を示している（DP＃1レイアウトを参照してください）。
- 各ウェルに1×PBSの適切な量を追加します。 10 -1井戸では、NO PBSを追加しません。 10 -2〜10 -6ウェルについて、1×PBSの90μlを添加します。
- 各ウェルにサンプルの適切な量を追加します。 10 -1のウェルでは、各サンプルについて10 -1株式の100μlを添加する（フィルタプラットからステップ5.5.7を参照してください。E）。 10 -2〜10 -6のウェルについては、連続希釈液を作ります。 10 -1井戸から10μLを取り、ウェル10 -2に追加して起動します。 10 -6希釈のうちの連続希釈を続けます。
- 透明なプラスチックの接着シールでDP＃1プレートをカバーし、氷の上に置きます。
- 希釈プレート＃2を作成します
注：希釈はプレート（DP＃2）（ベロ細胞のワークシート上のDP＃2レイアウトを参照）、正および負の対照を含む各サンプルについて6ウェルの2車線が必要になります。- 各サンプルのための彼らの希釈（10 -1〜10 -6）でウェルにラベルを付け、陽性および陰性対照を示している（DP＃2レイアウトを参照してください）。 （「サンプルウェル」と表記）サンプル名または（「抗毒素井戸」と表記）抗毒素とサンプル名でウェルにラベルを付けます。
- このアッセイのために必要な抗毒素の量を計算します。注：抗毒素は25倍在庫あり1×PBSで1:25に希釈する必要がある溶液。氷上で調製した抗毒素1xのソリューションを配置します。
- そのサンプルのすべての希釈（10 -1〜10 -6）のために各ウェルに1×PBS20μlのを追加」、サンプルウェル」のため。そのサンプルのすべての希釈（10 -1 6〜10）のために各ウェルに1×抗毒素の20μlを添加」、抗毒素井戸」のため。
- 6と行7 - - 行1のためのDP＃2上の指定ウェルにDP＃1からのウェル中の転送希釈した20μlのサンプルを12（Vero細胞のワークシート上のDP＃2レイアウトを参照してください）。ピペッティングにより溶液を穏やかに混合します。
- 透明なプラスチックの接着シールでDP＃2を覆い、室温でのインキュベーションの40分を可能にします。このインキュベーションは、抗毒素が結合し、したがって不活性化し、 クロストリジウム・ディフィシル毒素を中和することを可能にすることです。
- インキュベーションの後、DP＃2から適切なVero細胞ウェルに混合物の10μlを添加する（V上のベロセルプレートのレイアウトを参照してください。エロセルワークシート）。静かにピペッティング、ウェルの底表面に付着されたベロ細胞を破壊しないように注意を取ることによって溶液を混合。
- 37℃で細胞培養インキュベーター中で一晩Vero細胞プレートをインキュベートし、5％CO 2。
- 光学顕微鏡を使用して丸めためのVero細胞を評価する（2日目）
注：Vero細胞プレートに試料混合物を追加する場合（ 例えば、10 -3は今10 -4である）10倍に希釈係数が変化することを思い出してください。現在の抗毒素を持つウェルズはありませんVero細胞の丸めに少し注意が必要です。 Vero細胞の丸め（細胞毒性）は、C。ディフィシル毒素を含むサンプルに記載されます。細胞傷害活性は、サンプルと抗毒素を含む希釈液中で中和されている場合は、ベロ細胞毒性をもたらすC.ディフィシル毒素の存在が確認されました。- ガーゼを使用したVero細胞の丸めのために調べ200Xの倍率でトン顕微鏡。 （ポジティブコントロールを含む）のサンプルウェルについて、指摘80％Vero細胞の丸みを持っている最後のものであるウェルの希釈を記録。
- 試料1g当たり80％ベロ細胞丸めを生成最高希釈の逆数として定義されている細胞毒性力価を計算します。最高希釈が10 -5である場合、例えば、次に希釈因子は、このサンプルの10 -6です。したがって、ログ[最終希釈率は] /サンプルのグラムは、6の逆数力価が得られる[10 6]を 、ログに記録されることになります。
注： -前に、このアッセイ26におけるそれらの使用に4継代なし30以上の継代Vero細胞は、少なくとも3を受けている必要があります。
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Representative Results
代表的な研究の間、5週齢のC57BL / 6 WTマウスは、5日間、飲料水（0.5 mg / mlで）でセフォペラゾンで前処理し、2日間は、通常の飲料水で洗い流すせました。マウスを、0日目に強制経口投与を介して、 クロストリジウム・ディフィシル R20291の10 5胞子（ 図1A）で攻撃しました。マウスは、14日間のCDIの体重減少および臨床的徴候（嗜眠、食欲不振、下痢、および猫背の姿勢）をモニターしました。 C.ディフィシル R20291胞子とC57BL / 6 WTマウスの課題は、24時間および48時間後にチャレンジ（ 図1B）内に有意な体重減少の中に下痢になりました。この実験では観察されなかったが、C。ディフィシル R20291の高用量でチャレンジしたマウスは、重症になったり、48で20％以上の体重減少を持つことができます- 72時間チャレンジ後、このように人道的な安楽死を必要とします。したがって、マウスは1日2回の最小値を必要としますC.ディフィシレ胞子とチャレンジ後の監視。
7チャレンジ後（ 図1B） -この代表的な研究では、マウスにおいて体重減少および疾患の臨床徴候の有意な量も日2で観察されました。 7日チャレンジ後に、マウスは体重が増加し始め、疾患の臨床症状がおさまりました。実験の最後の週では、マウスは下痢などのCDIの臨床徴候の証拠がないと、臨床的に正常に見えました。
糞は前クロストリジウム・ディフィシル胞子でのチャレンジと48時間毎、攻撃後（ 図1C）に採取しました。抗生物質治療の前に、マウスを、 クロストリジウム・ディフィシルが定着していませんでした。 クロストリジウム・ディフィシル胞子と24時間後の挑戦の中で、マウスは糞便1g当たりC.ディフィシル （ 図1C <の10 7 CFUのが定着しました。/強いです>）。マウスは、永続的に、実験の最後の7日間の体重減少またはCDIの臨床徴候の証拠にもかかわらず、実験を通してクロストリジウム・ディフィシルが定着したままでした。
図1：C。ディフィシル R20291展示減量にチャレンジし、 クロストリジウム・ディフィシルを保菌しているセフォペラゾン処置マウス。 A）5週齢のC57BL / 6 WT JAXマウス（1群あたりN = 3M / 3F）5日間、飲料水（0.5 mg / mlで）でセフォペラゾンで前処理し、2日間は、通常の飲用で洗い流すせました水。マウスを日に強制経口投与を介して、 クロストリジウム・ディフィシル R20291の10 5胞子をチャレンジした0マウスは、体重減少と14日間CDIの臨床徴候（無気力、食欲不振、下痢、および猫背の姿勢）をモニターしました。糞便は直ちにAFTE、前セフォペラゾンを開始するまでに収集し、細菌計数のために使用されましたR抗生物質を終了し、0日、1、2、3、4、5、7、9、11、13に、そして感染を通して14。剖検は、マウスがC.ディフィシル R20291でのチャレンジ後にベースライン体重のかなりの量を失った）日0、2、4、7日に行われ、14 Bました。マウスの平均体重は、0日目、ベースライン量と比較した場合、有意な体重減少が7を介して日2に見られた0日目から毎日測定しました。チャレンジ後の糞便中のC）C.ディフィシル R20291細菌負荷。 クロストリジウム・ディフィシル胞子での攻撃後24時間以内に、すべてのマウスは、糞便1g当たり10 7 CFUを（コロニー形成単位）が定着しました。これらのパラメータに有意差は、女性と男性の間で見られませんでした。意義は、ダンの事後テストに続いて、ノンパラメトリッククラスカル-ウォリス一方向ANOVA検定（*、P≤0.05によって決定した; **、P≤0.01; ***はp≤0.001; ****、P この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
4匹のマウス（雄2匹と雌2匹）は人道的などの非感染のコントロールを提供するために、感染前に、0日目に安楽死させ、剖検のために調製しました。また、各ケージから1マウスを人道的に安楽死させ、剖検のために準備日2に、4、7、14、攻撃後（ 図1A）。盲腸内容物中のクロストリジウム・ディフィシレの列挙は、各剖検で行いました。糞便列挙との一致では、何のクロストリジウム・ディフィシルは、前のC.ディフィシルでのチャレンジにマウスの盲腸内容物は検出されませんでした。 48時間チャレンジ後に、マウスは、盲腸内容物のグラムあたりのクロストリジウム・ディフィシルの約10 8 CFUのが定着した（ 図図2（a））。全てのマウスは、永続的に、実験を通して植民地化したままでした。
盲腸内容はまた、ベロ細胞毒性アッセイを用いてC.ディフィシル毒素の存在を感染を通して評価しました。 C.ディフィシル毒素の細胞毒性の証拠は、チャレンジ（ 図2B）の前に盲腸内容物中に検出されませんでした。 C.ディフィシル細胞毒性は、 クロストリジウム・ディフィシルの胞子で2日間のチャレンジ後に検出し、感染を通じて持続しました。 クロストリジウム・ディフィシルとかなり均一な植民地にもかかわらず、 クロストリジウム・ディフィシル細胞傷害活性のレベルの変化は個々のマウス（ 図2B）で明らかです。
Vero細胞の細胞毒性アッセイ中にクロストリジウム・ディフィシル抗毒素で中和マウス盲腸内容物の大部分および細胞毒性の証拠はなかった（ベロCE行っ希釈で）丸めてしまう。他の希釈で丸めVero細胞の証拠で、10 -1希釈（サンプルが最も集中している希釈）で100％の細胞毒性-しかし、いくつかの個々のマウスは、再試験にもかかわらず、50の証拠を持っていました。このアッセイで利用抗毒素はヤギ27で製造した、C。ディフィシル毒素に対する中和ポリクローナル抗体です。したがって、この抗毒素は菌株R20291によって生成されたC.ディフィシルバイナリ毒素を中和しないことがあります。しかし、C。ディフィシルバイナリ毒素は、10細胞傷害性であるとは考えられません。抗毒素またはC.ディフィシル毒素がこの発見に貢献することができた以外の他の細胞毒性剤の存在により中和することができない過度のC.ディフィシル毒素 。 80％Vero細胞の丸めと各サンプルの最後の希釈は持っていたので、この観察は、これらのサンプルについての細胞毒性力価の決意に影響を及ぼしませんでした指定された希釈率で抗毒素と組み合わせた細胞毒性の証拠はありません。
図2：Cでの感染時の盲腸および細胞毒性の植民地。ディフィシル R20291。 A）マウスの盲腸は永続的に臨床徴候の解像度および観察された体重増加にもかかわらず、実験を通してクロストリジウム・ディフィシルが定着したままでした。 2日後の課題で評価した場合、すべてのマウスは、盲腸内容物のグラム当たり10を超える8 CFUのが定着しました。 Cでの感染を通して盲腸内容物からB）ベロ細胞毒性アッセイ。ディフィシル R20291。 C.ディフィシレ胞子とチャレンジ後0日目に比べて2日目、4上のログ10盲腸内容物のグラムあたりの毒素の逆数希釈で測定されるように、マウスは、細胞毒性の有意なレベルを持っていた、と7攻撃後（中央値のrepresenteラインからD）。 **はp≤0.01; ***はp≤0.001; ****、P≤0.0001意義はダンの事後テスト（*、P≤0.05に続くノンパラメトリッククラスカル-ウォリス一方向ANOVA検定によって決定しました）。エラーバーは平均からの標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
組織学的評価は盲検法でボード認定の獣医病理学者によって行われることをお勧めします。組織のスコアリングのために、0-4の数値スコアリングシステムは、個別に、以前に公開されたスコアリングスキーム17に基づいて、回腸、盲腸および結腸に浮腫、炎症性細胞浸潤、及び上皮細胞の損傷を評価するために使用すべきです。
盲検病理組織学的検査時にC.ディフィシル R20291とネズミ回腸、盲腸および結腸次の挑戦のネーションは、最も重要な病理学的変化は盲腸（ 図3）で認められました。総盲腸組織学的スコアは、0日目と2日目と4攻撃後の間で有意に異なっていました。有意な病変は、感染を通して、回腸（ 図3）で認められませんでした。より軽度の病変は結腸において認められました。総結腸組織学的スコアは、0日目と2日目と7、チャレンジ後（ 図3）との間に有意差が認められました。
感染を通じて回腸、盲腸および結腸の代表的なH＆E切片は盲検ボード認定の獣医病理学者によって決定される各画像は、そのそれぞれの合計組織学的スコアおよび上皮損傷、炎症、および浮腫のための個々のスコアを持っている、図4で利用可能です（ SAM）。
Cでの感染の間にネズミ回腸、盲腸の組織学的スコアリング、およびコロン：図3。ディフィシル R20291。上皮損傷、炎症、および浮腫総組織学スコアを評価パラメータのすべての3つのスコアを加算することにより算出しました。有意な組織病理学的変化は、感染を通して回腸に認められませんでした。盲腸組織は、CDIの際に最も重要な組織学的病変を含んでいました。総盲腸組織学的スコアは、2日目と4攻撃後に0日目から有意に異なっていました。より軽度の病変は結腸において認められました。総結腸組織学的スコアは、2日目と7攻撃後に0日目から有意に異なっていました。意義は、ダンの事後テストに続いて、ノンパラメトリッククラスカル-ウォリス一方向ANOVA検定（*、P≤0.05によって決定した; **、P≤0.01; ***はp804; 0.001; ****、P≤0.0001）。エラーバーは平均からの標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：Cでの感染の間に組織病理学。ディフィシル R20291。このパネルには、C。ディフィシル R20291での感染を通じて回腸、盲腸および結腸の代表的なH＆Eセクションが含まれています。総組織学的スコアは、対応する日と記載されている組織のための括弧（）内にある：回腸日0（0）、2日目（1）、4日（0）、7日目（0）、および14日目（0） ;盲腸日の0（0）、2日目（5）、4日目（4）、7日目（3）、及び14日目（3）。結腸日0（0）、2日目（4）、4日目（1）、7日目（4）、及び14日目（2）。顕微鏡写真は、光顕微鏡で得られました5メガピクセルのデジタルカメラとそれに付随するソフトウェアと電子（スケールバーは200μmで表します）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
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