Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Cefoperazone behandlet musemodell for klinisk relevante doi: 10.3791/54850 Published: December 10, 2016

Summary

Denne protokollen beskriver cefoperazone musemodell for Clostridium difficile infeksjon (CDI) med en klinisk relevant og genetisk medgjørlig stamme, R20291. Vekt på klinisk sykdom overvåking, C. difficile bakteriell telling, toksin cytotoksisitet, og histopatologiske endringer gjennom CDI i en musemodell er beskrevet i protokollen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Clostridium difficile er en anaerob, gram-positive, sporedannende Bacillus som forårsaker livstruende diaré 1. C. difficile infeksjon (CDI) er assosiert med økt menneskelig sykelighet og dødelighet og resultater i løpet av $ 4.8 milliarder i helsekostnader per år 1-4. I 2013, Centers for Disease Control and Prevention kategorisert C. difficile som et presserende antibiotikaresistens risiko, noe som indikerer at det utgjør en presserende trussel mot folkehelsen en. Foreløpig er antibiotikabehandling med vancomycin og metronidazol regnes som standard vare for CDI 5. Dessverre er tilbakefall av CDI etter vellykket behandling med antibiotika høy, som forekommer hos 20 - 30% av pasientene 2,5-7. Derfor er det nødvendig oppdagelsen av nye behandlingsformer mot denne ente patogen. For å evaluere legemiddel mot C. difficile, en dyremodell tilnærmet menneskelig sykdom i aclinically-relevant belastning er nødvendig.

I utgangspunktet Kochs postulater ble etablert for C. difficile i 1977 ved hjelp av en klindamycin behandlet syrisk hamster modell 8. Denne modellen er fortsatt brukes i dag for å undersøke effektene av C. difficile toksiner på patogenesen 9,10. Men CDI i hamster-modellen resulterer i høy dødelighet og ikke omtrentlige kroniske lumske sykdommen manifestasjoner som kan sees hos mennesker med CDI 10,11. Basert på tilgjengelighet og reagenser tilgjengeligheten av murine plattformer i forskning, er en musemodell for CDI relevant.

I 2008 ble en robust musemodell for CDI etablert ved å behandle mus med et antibiotikum cocktail i drikkevann (kanamycin, gentamicin, colistin, metronidazol, og vancomycin) i 3 dager etterfulgt av en intraperitoneal injeksjon av klindamycin 12. Dette gjengitt mus utsatt for CDI og alvorlig kolitt. Avhengeing på pode dose gis, kan en rekke kliniske tegn og dødelighet observeres ved hjelp av denne modellen. Siden denne tid har en rekke antibiotika regimer blitt undersøkt som endrer den murine tarmfloraen, mink kolonisering motstand til et punkt hvor C. difficile kan kolonisere mage-tarmkanalen (oversikt i beste et al., Og Lawley & Young) 13,14.

Mer nylig har et bredt spektrum cefalosporin, cefoperazon, gis i drikkevannet til 5 eller 10 dager reproduserbart gjengir mus utsatt for CDI 15. Siden administrasjon av tredje generasjons cefalosporiner er assosiert med økt risiko for CDI hos mennesker, bruk av cefoperazone modellen reflekterer mer nøyaktig naturlig forekommende sykdom 16. Cefoperazon-behandlede mus utsatt for C. difficile har blitt utfordret med begge C. difficile sporer og vegetative celler fra en rekke stammer som strekker seg i kliniskrelevans og virulens 17. Til tross for noen av de opprinnelige studier med C. difficile vegetative celler som den smittsomme skjema C. difficile sporer regnes som hovedmodus for overføring 18.

I det siste tiåret, C. difficile R20291, en NAP1 / BI / 027-stammen, har dukket opp, forårsaker epidemier av CDI 19,20. Vi ønsket å finne ut det kliniske forløpet av sykdommen når cefoperazone-behandlede mus ble utfordret med klinisk relevant og genetisk medgjørlig C. difficile-stamme, R20291. Denne protokollen beskriver kliniske forløpet, herunder vekttap, bakteriell kolonisering, toksin cytotoksisitet, og histopatologiske forandringer i mage-tarmkanalen hos mus utfordret med C. difficile R20291 sporer. Samlet sett viser denne musemodell for å være en verdifull eksperimentell plattform for CDI tilnærmet menneskelig sykdom. Dette karakteriserte musemodell kan dermed brukes til å vurdere virkningeneav nye therapeutics på forbedring av klinisk sykdom og om restaureringen av kolonisering motstand mot C. difficile.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etisk Uttalelse:
Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) godkjent denne studien. NCSU Animal Care og Bruk policy gjelder standarder og retningslinjer som er fastsatt i dyrevernloven og helseforsknings Extension Act of 1985. Forsøksdyr fasiliteter på NCSU følger retningslinjer fastsatt i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Dyrenes helsetilstand ble vurdert daglig, og døende dyr ble humant avlivet av CO 2 kvelning fulgt av sekundære tiltak. Utdannede røktere eller en veterinær utført husdyrhold i en AAALAC akkreditert anlegget i løpet av denne studien.

1. Administrasjon av antibiotika Cefoperazone i drikkevann for å oppnå Mottakelighet for C. difficile Kolonisering og sykdom

MERKNADER: 5- til 8 uker gamle C57BL / 6 WT mus (kvinner og menn)ble kjøpt og satt i karantene i en uke før du starter antibiotika vann administrasjon. Etter karantene, ble musene plassert med autoklavert mat, sengetøy og vann. Cage endringer ble utført ukentlig av laboratoriepersonell i en laminær hette.

  1. Forbered cefoperazon (0,5 mg / ml) i sterilt destillert vann 7 dager før den målrettede dag av utfordring (figur 1).
  2. Fyll autoklaveres vannflasker med cefoperazone vann (0,5 mg / ml) og plassere dem i hver mus bur.
    MERK: Fersk forberedt cefoperazone vann bør gjøres og endret ut hver 2 dager i løpet av en 5-dagers periode, som angitt i trinn 1.1 og 1.2. Riktig avhending av cefoperazone vann etter institusjonelle miljø helse- og sikkerhetsretningslinjer anbefales.
  3. Etter 5 dager på cefoperazone vann, bytt flaskene med autoklaveres vannflasker fylt med sterilt destillert vann. Gi mus denne drikkevann for varigheten av forsøket.

2. Utarbeidelse av C. difficile Spore Inoculum og oralt inntak av Mus

MERK: Før du begynner, må du kontrollere at følgende elementer er plassert i den anaerobe kammeret i minst 24 timer: 1x fosfatbufret saltvann (PBS, se Materials), taurocholat cycloserine cefoxitin fruktose agar (TCCFA) plater (se Materialer og tilleggsfilen ), og en steril L-formet sprederen.

MERK: Mus utfordret med C. difficile sporer bør være plassert i et biosikkerhetsnivå 2 Dyreavdelingen.

  1. Oppnå en C. difficile spore lager av den ønskede stamme (i dette tilfellet, R20291), som ble fremstilt tidligere og lagret ved 4 ° C i sterilt vann 21,22. Bestem bestemmelse av denne spore lager før bruk.
  2. Basert på den kjente konsentrasjonen (sporer / ml) av spore lager, beregner den ønskede fortynning for å oppnå 10 5 sporer per 25 pl. Sikre inokulumet volum er tilstrekkelig til å inokulere allemus i forsøket (25 ul per mus), for å utføre telling av pode (ca. 30 ul), og å ta hensyn til pipetteringsfeil.
  3. Vortex den opprinnelige C. difficile spore lager. Deretter, resuspender den beregnede volum (fra trinn 2.2) av den opprinnelige spore C. difficile lager i sterilt vann i en med skrulokk mikrosentrifugerør. Utfør denne aerobt i en laminær hette. Identifisere denne fortynnede blanding som "sporepodestoff».
  4. Plasser sporepodestoff inn i et 65 ° C vannbad og varmer den i 20 min.
    MERK: Dette trinnet vil sikre at bare aktive C. difficile sporer fortsatt etter varmebehandling.
  5. Innenfor laminær hette, ta 50 ul oppvarmet sporepodestoff, plassere den i et sterilt mikrosentrifugerør, og sende det inn i anaerob kammer 23. Bruk denne prøven for spore telling.
  6. Innenfor laminær hette, legger de resterende oppvarmet sporepodestoff intoa 1-ml sprøyte festet til en steril pære-tipped gastrisk sonde nål. Bruk en manuell sprøyte stepper for å sikre nøyaktig og rask gjenta dosering mellom mus. Kontroller at sonde nålen er fylt med oppvarmet sporepodestoff før bruk.
    MERK: En ny steril sonde nål for hver mus er ikke påkrevd. Imidlertid, hvis forskjellige doser av C. difficile sporer blir administrert, blir en ny sonde nål anbefales for hver dose.
    MERK: C. difficile sporer er svært motstandsdyktig mot tradisjonelle desinfeksjonsmidler. Derfor er det nødvendig å bruke en sporicidal desinfeksjonsmiddel, for eksempel # 62 Perisept sporedrepende desinfiserende. Produsenten anbefaler en 2-minutters kontakttid å ødelegge C. difficile sporer.
  7. Gavage hver mus med 25 ul av den sporepodestoff. Beherske hver mus forsiktig ved å ta tak i dyret av løs hud i nakke og rygg for å immobilisere hodet. Ved hjelp av pekefingeren ytterligere immobilisere dyrets hode og tillangstrakte spiserøret. Pass på at dyret ikke vocalize eller viser andre tegn på ubehag under tvang.
    NB: Det totale volumet gitt til mus via magesonde bør ikke overskride 10 ml / kg kroppsvekt (0,1 ml / 10 g).
  8. Opprettholde mus i oppreist, vertikal stilling og forsiktig passere gavage nålen inn i siden av munnen. Rett sonde nål langs taket av munnen og sakte fremme sonde nål inn i spiserøret.
    MERK: Hvis det oppstår noen motstand, sonde nål kan være på vei inn i luftrøret og dermed bør ikke være avansert, men heller fjernes og flyttes umiddelbart.
  9. Etter sonde nål er omtrent halvveis inn i spiserøret, injiserer 25 ul av det oppvarmede sporepodestoff og forsiktig trekke sonde nål fra spiserøret.
    MERK: Kraftig utvikling av den tvangsforing nålen kan føre til brudd i spiserøret eller i magesekken. Derfor, når en motstand når fremme sonde nålEr det best å umiddelbart fjerne og flytte sonde nål.
  10. Gå tilbake dyret til buret sitt og observere det for noen hoste eller tegn til åndenød, da dette kan indikere utilsiktet tracheal administrasjon eller aspirasjon av det oppvarmede sporepodestoff.
    MERK: Mus er svært utsatt for C. difficile etter antibiotikabehandling; derfor forholdsregler for å hindre kryssforurensning mellom merder er viktig. Dette er spesielt viktig når håndtere antibiotika-behandlet, men uimotsagt mus som kontroller.
  11. Etter inokulering alle mus, plasserer de rester oppvarmet sporepodestoff i en steril mikrosentrifugerør og sende den inn i anaerob kammer for spore telling.
  12. For bestemmelse av den oppvarmede sporepodestoff (fra trinn 2.4) og den gjenværende gavaged oppvarmet sporepodestoff, må 1:10 serielle fortynninger av hvert inokulum i 1 x PBS. Det anbefales å gjøre og plate 4 - 5 fortynninger (dvs. 10 -1 gjennom10 -5).
  13. Ved hjelp av aseptisk teknikk, overføre 100 ul av hver seriefortynning på en individuell TCCFA plate.
  14. Ved hjelp av en steril L-formet spreder, jevnt fordelt fortynningen anvendt til mediet på tvers av platen. Selv spredning av den fortynnede inokulum er viktig for nøyaktig telling av sporer.
  15. Inkuber platene anaerobt i 24 timer ved 37 ° C. Etter 24 timer kan C. difficile kolonidannende enheter (CFU) være nummerert for å få infeksiøs dose administrert til mus i 25 ul (0,025 ml) volum (se supplerende file "eksempel beregninger"). C. difficile kolonier er flat og blek gul og har uregelmessige kanter og en slipt glass utseende 24.
    MERK: Deteksjonsgrensen for bakteriell telling er 10 2 CFU.

3. Overvåking Mouse Vekttap og kliniske tegn på sykdom i hele C. difficile infeksjon

  1. veienimals før og etter 5 dagers cefoperazon antibiotikabehandling, etter at to-dagers utvinning av antibiotika (dag 0), og deretter for varigheten av forsøket.
    MERK: Skaff vekter på en konsistent tid hver dag. Vekter erholdt dagen for utfordring (dag 0) brukes som den første grunnlinjevekten for sammenligning hele C. difficile infeksjon.
  2. Plasser en digital skala til en biosikkerhet skap. Plasser en steril plastbeger på vekten og tarere vekten av det plastbeger. Deretter forsiktig plukke opp musen ved haleroten og plasser den i plastbeger.
    1. Plasser begerglasset tilbake på skalaen. Sveve hånd over toppen av begeret for å sikre at musen ikke slipper ut. Det kan ta 2 - 3 sekunder for å oppnå en stabil vekt. Deretter plasserer forsiktig musen tilbake i buret sitt. Spill denne vekten og gjenta prosessen for hver mus i det buret.
      MERK: Det er viktig at forholdsregler tas for å unngå kryss-Contaminasjon mellom bur når skaffe vekter. Hvert bur av mus bør ha sin egen plastbeger for veiing. De plast kanner bør desinfiseres med en sporicidal middel mellom hver bruk og dekket med sterile aluminiumsfolie.
  3. Overvåke utfordret dyr to ganger daglig (minst) for tegn på klinisk-alvorlig C. difficile infeksjon, inkludert slapphet, tap av appetitt, diaré, og krum holdning.
  4. Humant avlive dyr som mister 20% av sin opprinnelige baseline kroppsvekt og / eller utvikle alvorlige kliniske tegn på C. difficile infeksjon (oppført i trinn 3.3).
    MERK: Mus som viser kliniske tegn på C. difficile infeksjon bør veies etter behov i løpet av eksperimentet for å sikre at de ikke har mistet 20% av sin opprinnelige baseline kroppsvekt. I løpet av tidlige tidspunkter i forsøket, kan dette bety to ganger daglig målinger.

4. Bakteriell opplisting av C. difficilefra Muse Avføring og cecal innhold

MERK: Før du begynner, må du kontrollere at følgende elementer er plassert i anaerob kammeret i minst 24 timer: 1x PBS (se Materials), TCCFA plater (se Materials), en steril L-formet spreder, og sterile mikrosentrifugerør og / eller PCR-plater for fortynninger.

  1. Innhenting Prøver for C. difficile Enumeration
    MERK: Før få avføring eller cecal innhold, veie sterile mikrosentrifugerør på en analytisk skala. Spill røret vekt på siden av røret, avrunding til fire desimaler (f.eks 0,9864 g). Betegne denne vekten som "tube vekt." Hver prøve oppsamlet bør plasseres i en steril, veid mikrosentrifugerør.
    1. Steril samling av mus avføring
      1. beherske hver mus forsiktig ved å ta tak i dyret av løs hud i nakke og rygg for å immobilisere hodet. Bruk pinky finger for å forsiktig holde dyrets hale, thus utsette anus. Pass på at dyret ikke vocalize eller viser andre tegn på ubehag under tvang.
      2. Holder en steril, veid mikrosentrifugerør direkte under dyrets anus. Det er viktig at slangen ikke kommer i direkte kontakt med musen.
        1. Som dyret defecates, samle fecal pellet inn i røret. Hold røret ved romtemperatur inntil alle fekale prøver blir oppsamlet. Det kan ta flere minutter for en mus å gjøre sitt fornødne, og dermed nødvendig gjentatte forsøk på å samle avføring.
      3. Veie rør som inneholder avføring på analytisk skala. Spill røret vekt, avrunding til fire desimaler (f.eks 1,0021 g). Betegne innhentet vekt som den "endelige tube vekt."
      4. Før de fekale prøvene inn i anaerob kammer for bakteriell telling direkte etter avføring samling.
    2. Sterilt samling av mus cekale innhold på tidspunktet for nekropsi
      1. Etter human avlivning av CO 2 kvelning fulgt av sekundære tiltak, utføre en obduksjon for å få cecum 25. Cecum er det store, kommaformede delen av mage-tarmkanalen.
      2. Plasser cecum på en steril plast petriskål. Bruke en engangs steril no. 10 skalpellblad for å skjære den åpen cecum fra den blinde ende av posen for å avdekke de coecale innhold.
        1. Forsiktig pakke ut coecale innholdet ved å trykke lett med skalpell blad og feiende innholdet mot radert delen av cecum.
          MERK: Det må utvises forsiktighet for å ikke forstyrre cecal vev, som vil bli sendt til histopatologisk undersøkelse.
      3. Plasser coecale innholdet i en steril, veid mikrosentrifugerør umiddelbart etter samlingen. Bare ca 10 mg cecal innhold er nødvendig for bakteriell telling.
      4. Veie rør inneholdende cecal innhold på analytiske scale. Spill røret vekt, avrunding til fire desimaler (f.eks 1,0021 g). Betegne innhentet vekt som den "endelige tube vekt."
      5. Før de coecale innhold prøvene inn i anaerob kammer for bakteriell telling.
  2. Bakteriell opplisting av C. difficile
    1. Beregn den endelige vekten av innholdet (avføring eller coecale) som vil bli oppregnet for C. difficile. Utførte dette ved å trekke den "endelige tube vekt" fra "rør vekt."
    2. Beregne en 1:10 fortynning av innholdet i 1 x PBS og resuspender tilsvarende. For ekskrementpelletene bruk spissen av pipetten forsiktig forstyrre pelleten inn i løsningen (se supplerende file "eksempel beregninger").
    3. Anaerobt inkuber disse prøvene resuspendert ved romtemperatur i 30 minutter, slik at innholdet til å slå seg ned.
    4. Lage serielle fortynninger av hver prøve i 1 x PBS i enumnen av CFU per g innhold (avføring eller cecal). Utfør denne anaerobt.
    5. Bruk aseptisk teknikk, overføre 100 ul av hver serie fortynning til TCCFA plater. Ved hjelp av en steril L-formet spreader, spre fortynning brukes til media for å jevnt spre den over platen. Selv spredning av fortynning er nødvendig for nøyaktig telling av kolonier.
    6. Inkuber platene anaerobt i 24 timer ved 37 ° C. På denne tiden, nummerere C. difficile koloniene for å oppnå den CFU per g av innholds (avføring eller cecal). C. difficile kolonier er flat og blek gul og har uregelmessige kanter og en slipt glass utseende 24.
      MERK: Denne protokollen kan brukes til å nummerere C. difficile fra andre murine GI innhold, inkludert ileal og colonic innhold. PCR-plater kan benyttes for å lage seriefortynninger.

5. Vero Cell Cvtotoksisitetsmålinq å kvantifisere C. difficile gift Cytotoxiby

NB: Det anbefales at dette assay bli utført etter fullføring av musemodell på prøver samlet ved obduksjon og lagret ved -80 ° C. Aseptiske cellekulturteknikker er avgjørende for å hindre forurensning av Vero-celler i denne analysen. Denne protokollen tar 2 dager å utføre. All avføring og tarminnhold benyttes i denne analyse må lagres i et veid, sterile mikrosentrifugerør (betegnet med "tube vekt», se avsnittet ovenfor). Den endelige tube vekt (inkludert innholdet) blir målt via en analytisk skala til de nærmeste fire desimaler (se ovenfor). Anvendelse av en flerkanals pipette anbefales for denne analysen.

MERK: Før du begynner, må du kontrollere at følgende elementer er tilgjengelige: Vero-celler, Dulbeccos modifikasjon av Eagle medium (DMEM) 1x med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin media (betegnet som "DMEM 1x media; "se Materialer og supplerende fil), 0,25%Trypsin-EDTA, 1 x PBS, 0,4% trypanblått, en 96-brønn cellekultur flatbunnet plate, en 96-brønners filterplate, Clostridium difficile Toksin A (aliquot på 3 mikroliter ved 1 pg / pl i ultrarent vann og butikken ved -80 ° C), Clostridium difficile antitoxin, et regneark (for beregninger og plate kart, se tilleggsfiler).

MERK: Forsiktighet bør tas i løpet av denne analysen for personell eksponering mot C. difficile og dens toksin.

  1. Splitte Vero-celler (Dag 1)
    1. Forvarm DMEM 1x media, 0,25% Trypsin-EDTA, og 1 x PBS i et 37 ° C vannbad.
    2. Skaff en kolbe Vero-celler fra cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO 2) og plasser den i sterile cellekultur laminær hette. Bruk 70% etanol for å tørke ned panseret og utstyr før bruk. Ved hjelp av en serologisk pipette, aspirer media fra vevet kultur kolbe å fjerne den fra Vero-celler og kast den i en avfalls container.
    3. Skyll Vero-celler med 5 ml av 1 x PBS (forvarmet) i vevskulturkolbe. Aspirer PBS og kast den i en avfallsbeholder.
    4. Tilsett 5 ml av 0,25% Trypsin-EDTA til vevskulturkolbe. Gi en kontakttid på 2 - 3 min. I løpet av denne tiden observere cellene begynner å komme utenfor kolben overflate. Rist vevdyrkningskolbe side til side for å løsne Vero celler.
    5. Etter kontakt tid med Trypsin-EDTA, umiddelbart legge til 5 ml DMEM 1x media inn i vev kultur kolbe. Dette vil nøytralisere Trypsin-EDTA. Bruk av denne løsning for å vaske forsiktig eventuelle ufestede Vero-celler på baksiden av kolben. Deretter bruker du en serologisk pipette til å overføre denne blandingen i en 15-ml konisk tube.
    6. Sentrifuger Vero-celler i det koniske rør i 5 minutter ved 180 xg og 25 ° C. Pass på at sentrifugen er riktig balansert. Etter sentrifugering observere en synlig pellet av Vero-celler på bunnen av det koniske rør. Vær forsiktig med å DISRUPT dette pellet. Aspirer av supernatanten fra konisk rør og kast den.
    7. Suspender Vero-celler i 3 ml DMEM 1x medier.
  2. Telle Vero-celler
    1. Tilsett 100 ul av den Vero cellesuspensjon (fremstilt i trinn 5.1.7) til 100 ul av 0,4% trypanblått. Bland forsiktig ved å pipettere løsningen opp og ned.
    2. Tilsett 10 pl av denne blanding til hvert kammer av et hemocytometer.
    3. Tell antall levedyktige celler i løpet av de fire kvadranter av hemocytometer. Døde Vero-celler tar opp trypanblått og dermed vil bli farget blå (disse cellene skal ikke telles). Spill disse tallene i "Vero Cell regneark," gitt.
    4. Sum det totale antall levedyktige Vero-celler i alle fire kvadranter og beregne gjennomsnittet. Multipliseres med fortynningsfaktoren, som er to, siden 100 ul av celler er i totalt 200 pl væske.
    5. Multipliser med korreksjonsfaktoren for å gi "; antall celler / ml "Ved bruk av et hemocytometer, er korreksjonsfaktoren alltid 10 4 Multipliser med det totale volum for å gi den." totale antall celler "..
  3. Bestemme antall brønner som trengs for hvert forsøk
    MERK: En enkelt prøve (enten avføring eller tarminnhold) krever 24 separate brønner som skal utføres i to eksemplarer. En konsentrasjon på 10 5 Vero-celler per brønn (totalt volum på 90 ul) er påkrevd.
    MERK: Hvis man ønsker å inkubere de Vero celle 96-brønners plater over natten ved 37 ° C, en konsentrasjon på 10 3 Vero-celler per brønn anbefales å ta hensyn til den lengre inkubasjonstid. Beregninger innenfor Vero Cell regneark måtte justeres for å ta hensyn til denne endringen.
    1. Bestem antall brønner som kan benyttes basert på mengden av Vero-celler tilgjengelig (fra trinn 5.2, bruker Vero Cell regneark, følger med).
    2. Bestemme volumet avVero cellesuspensjon nødvendig for å fylle det ønskede antall brønner (basert på det antall prøver som ble testet). Sørg for at noen ekstra volum legges på kontoen for pipetteringsfeil (bruker den medfølgende Vero Cell-regneark).
    3. Fortynn Vero cellesuspensjonen (oppnådd i Trinn 5.1.7) i DMEM 1x media for å oppnå det volum som er nødvendig for forsøket.
  4. Seeding Vero-celler i en 96-brønners cellekulturplate
    1. Ved hjelp av Vero celle resuspensjon fra trinn 5.3.2, bruke en flerkanals pipette for å legge til 90 mL av Vero cellesuspensjon til hver brønn i en 96-brønn cellekultur flatbunnet plate.
    2. Inkuber platen med Vero-celler i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i minst 4 timer før tilsetning av toksin (prøver) til brønnene. Denne inkubasjonstid vil tillate Vero-celler til å følge bunnen av hver brønn.
  5. Opprette stamløsninger fra prøvene (Avføring ellerTarm innhold)
    MERK: Alle prøver skal ha "tube vekt" og "endelig tube vekt" målt via en analytisk skala. Bruk Vero Cell regneark for beregninger.
    1. Beregn vekten av innholdet. Konverter g til mg, deretter mg til ul. Beregn den endelige totale antall ul løsning som trengs for å lage en 1:10 fortynning i 1 x PBS. Beregn den totale mengden av 1x PBS for å legge til prøven.
    2. Legge til det totale volum av 1 x PBS (beregnet ovenfor) til prøven. Utfør denne aerobt, og ved bruk av aseptisk teknikk. For ekskrementpelletene bruk spissen av pipetten forsiktig forstyrre pelleten inn i løsningen.
    3. Vortex prøvene og deretter sentrifuger dem ved 3522 xg i 5 min ved romtemperatur. Pass på at sentrifugen er riktig balansert. Vær forsiktig med å forstyrre pellet og resuspender prøven i løsningen.
      MERK: Under Trinn 5.5.3, hvis bare noen få eksempler blir behandlet, innholdet kan steriliseres vedå føre dem gjennom et enkelt-0,22 um filter i stedet for å bruke en 96-brønns filterplate. Noen eksempler kan kreve flere filtre for å sterilisere hele volumet innhold ved hjelp av denne teknikken.
    4. Sterilprøve / PBS-blandingen ved å ta 150 ul supernatant og plassere den i separate brønner på en 96-brønns filterplate. Plasser filterplaten sikkert på toppen av en 96-brønn cellekultur-flat bunnplate, slik at innholdet vil filtrere inn i denne plate.
    5. Sentrifuger filterplaten / cellekultur-platestabelen ved 431 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Pass på at sentrifugen er riktig balansert og at filterplaten / cellekultur platestabelen er tett justert og vil ikke skifte under sentrifugering.
      MERK: Disse filtrerte innholdet er det 10 -1 lager som vil bli benyttet i utvannings plater.
    6. Plasser platen med filtrert prøvene på is.
  6. Opprette fortynning Plate # 1
    MERK: Fortynning Plate # 1 (DP 1 #) vil kreve 6 brønner per prøve, inkludert positive (C. difficile toksin A) og negative (1x PBS) kontroller (se DP # 1 layout på Vero Cell-regneark).
    1. For å fremstille den positive kontroll (C. difficile toksin A) for denne analysen, oppnå 3-ul aliquoter (1 pg / pl) fra -80 ° C og tilsett 297 ul av ultrarent vann, hvilket ga en sluttkonsentrasjon på 0,01 ug / ul. Plasser på is.
    2. Etikett brønnene med deres fortynninger (10 -1 til 10 -6) for hver prøve og indikerer de positive og negative kontroller (se DP-1 layout).
    3. Legg passende mengder av 1 x PBS til hver brønn. I de 10 -1 brønner, legger NO PBS. For de 10 -2 til 10 -6 brønner, tilsett 90 mL av 1x PBS.
    4. Legg passende mengder av prøvene til hver brønn. I de 10 brønnene -1, tilsett 100 pl av 10 -1 lager for hver prøve (se trinn 5.5.7 fra filteret plate). For de 10 -2 til 10 -6 brønner, lage serielle fortynninger; starte med å ta 10 ul fra 10 -1 godt og legger den til 10 -2 godt. Fortsett serie fortynninger ut til 10 -6 fortynning.
    5. Dekk til DP # 1 plate med en klar plast selvklebende forsegling og plassere den på is.
  7. Opprette Fortynning Plate # 2
    MERK: Fortynning Plate (DP # 2) vil kreve 2 baner av 6 brønner for hver prøve, inkludert positive og negative kontroller (se DP # 2 layout på Vero Cell-regneark).
    1. Etikett brønnene med deres fortynninger (10 -1 til 10 -6) for hver prøve og indikerer de positive og negative kontroller (se DP # 2 layout). Merk brønnene med prøvenavnet (betegnet som "prøvebrønner") eller prøvenavnet med motgiften (betegnet som "antitoksin brønner").
    2. Beregne mengden av antitoksin som kreves for denne analysen. MERK: motgiften er en 25x lagerLøsningen som må fortynnes 1:25 i 1 x PBS. Plasser forberedt antitoxin 1x løsning på is.
    3. For "prøvebrønner," legge til 20 mL 1x PBS til hver brønn for alle fortynninger (10 -1 til 10 -6) på den prøven. For "antitoksin brønner," legge til 20 mL av 1x antitoxin til hver brønn for alle fortynninger (10 -1 til 10 6) i denne prøven.
    4. Overfør 20 mL av den fortynnede prøven i brønner fra DP # 1 i egne brønner på DP # 2 for rader 1 - 6 og rader 7 - 12 (se DP # 2 layout på Vero Cell-regneark). Bland løsningen forsiktig ved å pipettere opp og ned.
    5. Dekk DP # 2 med en klar plast klebe tetningen og tillate 40 min inkubering ved romtemperatur. Denne inkubasjonen er å tillate antitoksin til å binde og derved inaktivere og nøytralisere C. difficile toksin.
    6. Etter inkuberingen, tilsett 10 ul av blandingen fra DP # 2 til de passende Vero-celle brønner (se Vero celleplaten layout på Vero Cell-regneark). Bland forsiktig oppløsningen ved å pipettere opp og ned, ta vare å ikke forstyrre Vero-celler som er festet til bunnflaten av brønnene.
    7. Inkuber Vero celleplaten over natten i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  8. Vurdere Vero-celler for avrunding ved hjelp av et lysmikroskop (dag 2)
    MERK: Husk at fortynningsfaktoren endres med en faktor på 10 når du legger prøveblandinger til Vero celleplaten (f.eks er 10 -3 nå 10 -4). Brønner som har antitoksin til stede bør ha liten eller ingen Vero celle avrunding notert. Vero celle avrunding (cytotoksisitet) vil bli lagt merke til i prøver som inneholder C. difficile toksin. Dersom den cytotoksiske aktivitet nøytraliseres i en fortynning som inneholdt prøven og antitoxin, er tilstedeværelsen av C. difficile toksin resulterer i Vero-celle cytotoksisitet bekreftet.
    1. Undersøk for Vero celle avrunding ved hjelp av en light mikroskop med 200X forstørrelse. For prøvebrønner (inkludert positiv kontroll), registrere fortynning av brønnen som er den siste til å ha 80% Vero celle avrunding notert.
    2. Beregn den cytotoksiske titer, som er definert som den resiproke verdi av den høyeste fortynning som ga 80% Vero celle avrunding per g prøve. For eksempel, hvis den høyeste fortynningen er 10 -5, deretter fortynningsfaktoren ville være 10 -6 for denne prøven. Dermed blir log [endelige fortynningsfaktor] / g prøve ville bli log [10 6], noe som gir en gjensidig titer av seks.
      MERK: Vero-celler må ha gjennomgått minst 3 - 4 passasjer og ikke mer enn 30 passeringer før bruk i denne analysen 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I løpet av en representativ studie ble 5 uker gamle C57BL / 6 WT mus forbehandlet med cefoperazon i drikkevannet (0,5 mg / ml) i 5 dager, og tillot en 2-dagers vaske ut med vanlig drikkevann. Mus ble utfordret med 10 5 sporer av C. difficile R20291 via oral sonde på dag 0 (figur 1A). Musene ble overvåket for vekttap og kliniske tegn (slapphet, manglende appetitt, diaré, og krum holdning) av CDI i 14 dager. Utfordringen med C57BL / 6 WT mus med C. difficile R20291 sporer resulterte i diaré innen 24 timer og betydelig vekttap i løpet av 48 timer etter utfordring (figur 1B). Selv om det ikke observert i dette forsøk, kan mus utfordret med en høyere dose av C. difficile R20291 bli alvorlig syke eller har større enn 20% vekttap ved 48-72 timer etter utfordring, og således nødvendiggjør human avliving. Derfor mus krever et minimum på to ganger dagligovervåking etter utfordring med C. difficile sporer.

I dette representative studien ble en betydelig mengde av vekttap og kliniske tegn på sykdom i mus også observert på dagene 2 - 7 etter smitte (figur 1B). Ved 7 dager etter smitte, mus begynte å få vekt og kliniske tegn på sykdom sunket. Ved den siste uken av forsøket, musene viste klinisk normal, med ingen bevis for kliniske tegn på CDI, inkludert diaré.

Ekskrementpelletene ble samlet før utfordringen med C. difficile sporer og hver 48 timer etter utfordring (figur 1C). Før antibiotikabehandling, ble musene ikke kolonisert med C. difficile. Innen 24 timer etter utfordring med C. difficile sporer, ble musene kolonisert med 10 7 CFU av C. difficile per g av avføring (figur 1C </ Strong>). Mus forble vedvarende kolonisert med C. difficile gjennom hele forsøket, til tross for ingen bevis for vekttap eller kliniske tegn på CDI for de siste 7 dagene av forsøket.

Figur 1
Figur 1: Cefoperazone behandlede mus utfordret med C. difficile R20291 Exhibit Vekttap og er Kolonis med C. difficile. A) 5-uker gamle C57BL / 6 WT JAX mus (n = 3 M / 3F pr gruppe) ble forbehandlet med cefoperazon i drikkevannet (0,5 mg / ml) i 5 dager, og den tillatte maksimums en 2-dagers vaske ut med vanlig drikkevann vann. Mus ble utfordret med 10 5 sporer av C. difficile R20291 via oral sonde på dag 0. Musene ble overvåket for vekttap og kliniske tegn (slapphet, manglende appetitt, diaré, og krum holdning) av CDI i 14 dager. Avføring ble samlet inn og brukt for bakteriell telling før start cefoperazone, umiddelbart after behandling antibiotikumet, og på dagene 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, og 14 i hele infeksjon. Obduksjon ble utført på dagene 0, 2, 4, 7 og 14. B) Musene mistet en betydelig del av sin grunnlinjevekten etter utfordring med C. difficile R20291. Den gjennomsnittlige kroppsvekten til musene ble målt daglig fra dag 0. betydelig vekttap ble observert på dagene 2 til og med 7 sammenlignet med dag 0, den grunnlinjevekten. C) C. difficile R20291 bakteriemengde i avføringen etter utfordring. Innen 24 timer etter utfordringen med C. difficile-sporer, ble alle musene kolonisert med 10 7 CFU (kolonidannende enheter) pr g avføring. Ingen signifikante forskjeller i disse parametrene ble sett mellom kvinner og menn. Signifikans ble bestemt av den ikke-parametrisk Kruskal-Wallis enveis ANOVA test etterfulgt av Dunns posttest (*, p ≤ 0,05, **, p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001; ****, p Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fire mus (2 hanner og 2 hunner) ble humant avlivet, og forberedt for nekropsi på dag 0, før infeksjon, for å tjene som ikke-infiserte kontroller. I tillegg ble en mus fra hver merd humant avlivet og preparert for nekropsi på dag 2, 4, 7 og 14 etter utfordring (figur 1A). Opplisting av C. difficile i cecal innholdet ble utført ved hver nekropsi. I samsvar med fekal opplisting, ble ingen C. difficile detektert i cecal innholdet av mus før utfordringen med C. difficile. På 48 timer etter utfordring, ble musene kolonisert med ca 10 8 CFU av C. difficile per g cecal innhold (Figur2A). Alle mus forble vedvarende kolonisert gjennom hele eksperimentet.

Cecal Innholdet ble også vurdert i løpet av infeksjonen med hensyn til nærvær av C. difficile toksin ved hjelp av Vero celle cytotoksisitet assay. Ingen bevis for C. difficile toksin cytotoksisitet ble oppdaget i coecale innholdet før utfordringen (figur 2B). C. difficile cytotoksisitet ble detektert 2 dager etter utfordringen med C. difficile sporer og vedvarte gjennom hele infeksjon. Til tross for ganske ensartet kolonisering med C. difficile, er variasjoner i nivåene av C. difficile cytotoksisk aktivitet tydelig i individuelle mus (figur 2B).

Størstedelen av mus cekale innhold nøytralisert med C. difficile antitoxin løpet av Vero-celle-cytotoksisitet analyse, og hadde ingen tegn på cytotoksisitet (Vero ceinneholder Tilbakestill avrunding) i fortynningene utføres. Men noen individuelle mus, til tross for ny testing, viste tegn på 50 - 100% cytotoksisitet i 10 -1 fortynning (fortynning hvor prøven er mest konsentrert), uten noen tegn på Vero celle avrunding i de andre fortynninger. Den antitoxin benyttet i denne analysen er et nøytraliserende polyklonale antistoffer til C. difficile toksin, fremstilt i geiter 27. Derfor kan dette antitoxin ikke nøytralisere C. difficile binære toksin som produseres av stammen R20291. Imidlertid er C. difficile toksin binære ikke ansett for å være cytotoksisk 10. Overdreven C. difficile toksin ikke i stand til å bli nøytralisert ved antitoxin eller tilstedeværelse av en annen cytotoksisk middel forskjellig fra C. difficile-toksin kan være medvirkende til dette funnet. Denne observasjonen har ikke betydning for bestemmelsen av den cytotoksisitet titer for disse prøver, siden hver prøve siste fortynning med 80% Vero celle avrunding haddeingen tegn på cytotoksisitet når kombinert med antitoxin ved den angitte fortynning.

Figur 2
Figur 2: Kolonisering av cecum og Cytotoksisitet under Infeksjon med C. difficile R20291. A) Mus Ceca forble vedvarende kolonisert med C. difficile gjennom hele forsøket, til tross for at kliniske tegn og observert vektøkning. Alle musene ble kolonisert med større enn 10 8 CFU per g coecale innholdet når vurdert til 2 dager etter smitte. B) Vero celle cytotoksisitet analysen fra cecal innhold gjennom infeksjon med C. difficile R20291. Etter utfordringen med C. difficile sporer, mus hadde signifikante nivåer av cytotoksisitet, som målt i log 10 resiprok fortynning av toksin pr g av cekale innhold på dagene 2, 4 og 7 etter infeksjonen sammenlignet med dag 0 (medianer represented ved hjelp av linjen). Signifikans ble bestemt av den ikke-parametrisk Kruskal-Wallis enveis ANOVA test etterfulgt av Dunns posttest (*, p ≤ 0,05, **, p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0.0001 ). Feilfelt representerer standardavvik fra gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Det anbefales at histologisk vurdering er utført av en bord-sertifisert veterinær patolog i en blindet måte. For vev score, bør en 0-4 numerisk scoring system benyttes til separat vurdere ødem, inflammatorisk celleinfiltrasjon, og epiteliale celleskader i ileum, cecum og tykktarm basert på en tidligere publisert scoring ordningen 17.

Ved blindet histopathologic eksamenination av den murine ileum, coecum og kolon etter utfordring med C. difficile R20291, ble de mest signifikante patologiske endringer noteres i cecum (figur 3). De totale coecale histologiske score var signifikant forskjellig mellom dag 0 og dag 2 og 4 post-utfordring. Ingen signifikante lesjoner ble registrert i ileum hele infeksjon (figur 3). Mildere lesjoner ble registrert i tykktarmen. De totale colonic histologiske score var signifikant forskjellig mellom dag 0 og dag 2 og 7 etter utfordring (figur 3).

Representant H & E deler av ileum, cecum og tykktarm hele infeksjon er tilgjengelig i figur 4. Hvert bilde har sin respektive total histologiske score og individuelle score for epitel skader, inflammasjon og ødem, som bestemmes av en blindet bord-sertifisert veterinær patologen ( SAM).


Figur 3: Histologisk Skårer for murine ileum, cecum og tykktarm under Infeksjon med C. difficile R20291. Totalt histologiske score ble beregnet ved å summere alle tre poengsummene fra de parametere som vurderes: epitelial skade, betennelse og ødem. Ingen signifikante histopatologiske forandringer ble registrert i ileum hele infeksjon. Cecal vev inneholdt de mest signifikante histologiske lesjoner i løpet av CDI. De totale coecale histologiske score var signifikant forskjellig fra dag 0 på dager 2 og 4 post-utfordring. Mildere lesjoner ble registrert i tykktarmen. De totale colonic histologiske score var signifikant forskjellig fra dag 0 på dager 2 og 7 post-utfordring. Signifikans ble bestemt av den ikke-parametrisk Kruskal-Wallis enveis ANOVA test etterfulgt av Dunns posttest (*, p ≤ 0,05, **, p ≤ 0,01, *** p804; 0,001; ****, P ≤ 0,0001). Feilfelt representerer standardavvik fra gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Histopatologi Under infeksjon med C. difficile R20291. Dette panelet inneholder representative H & E deler av ileum, cecum og tykktarm hele infeksjon med C. difficile R20291. De totale histologiske score er i parentes () for tilsvarende dag og vev oppført: for ileum dag 0 (0), dag 2 (1), dag 4 (0), dag 7 (0), og dag 14 (0) ; for cecum dag 0 (0), dag 2 (5), dag 4 (4), dag 7 (3), og dag 14 (3); og for kolon dag 0 (0), dag 2 (4), dag 4 (1), dag 7 (4), og dag 14 (2). Mikrofotografiene ble oppnådd på et lett mikroskope med et 5 megapixel digital kamera og tilhørende programvare (målestokken representerer 200 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1x PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1x Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  4. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
  5. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. (2016).
  6. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  7. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  8. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  9. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. (2016).
  10. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  11. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  12. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  13. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  14. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  15. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  16. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
  17. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  18. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. (2016).
  19. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  20. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  21. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  22. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
  23. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. e50787 (2013).
  24. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  25. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. Academic Press. 15-40 (2012).
  26. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. Appendix 4, Appendix 4E (2008).
  27. Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
  28. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
  29. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  30. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
  31. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  32. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  33. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
  34. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).
Cefoperazone behandlet musemodell for klinisk relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).More

Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter