Summary
Este protocolo se describe el modelo de ratón cefoperazona de la infección por Clostridium difficile (CDI), utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, C. difficile enumeración bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y los cambios histopatológicos en todo CDI en un modelo de ratón se detalla en el protocolo.
Introduction
Clostridium difficile es un anaerobio,, Bacillus formador de esporas gram-positiva que causa diarrea que amenaza la vida 1. Infección por C. difficile (CDI) se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad humana y los resultados en más de $ 4.8 mil millones en costos de salud por año 1-4. En 2013, los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades clasifican C. difficile como un riesgo de resistencia a antibióticos urgente, lo que indica que presenta una amenaza inmediata para la salud pública 1. Actualmente, el tratamiento antibiótico con vancomicina y metronidazol se consideran el estándar de cuidado para CDI 5. Desafortunadamente, la recurrencia de CDI después del tratamiento exitoso con antibióticos es alta, se produce en 20 - 30% de los pacientes 2,5-7. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevas terapias contra este patógeno entérico es necesario. Para evaluar la terapéutica frente a C. difficile, un modelo animal que se aproxima la enfermedad humana en corriente alternaSe necesita cepa linically relevantes.
Inicialmente, se establecieron los postulados de Koch para C. difficile en 1977, utilizando un modelo de hámster sirio clindamicina tratados con 8. Este modelo todavía se utiliza hoy en día para investigar los efectos de toxinas de C. difficile en la patogénesis 9,10. Sin embargo, el CDI en el modelo de hámster se traduce en altas tasas de mortalidad y no se aproxima a las manifestaciones de la enfermedad insidiosa crónicas que se pueden ver en los seres humanos con CDI 10,11. Sobre la base de la disponibilidad y accesibilidad de reactivo de plataformas murinas en investigación, un modelo de ratón de CDI es relevante.
En 2008, un modelo sólido ratón de CDI se estableció mediante el tratamiento de ratones con un cóctel de antibióticos en el agua potable (kanamicina, gentamicina, colistina, metronidazol y vancomicina) durante 3 días, seguido de una inyección intraperitoneal de clindamicina 12. Este ratones que son más susceptibles a la colitis CDI y severa. Dependering de la dosis de inóculo administrado, una amplia gama de signos clínicos y la letalidad se puede observar utilizando este modelo. Desde entonces, varios regímenes de antibióticos se han investigado que alteran la microbiota intestinal murino, disminuyendo la resistencia a la colonización hasta el punto en C. difficile puede colonizar el tracto gastrointestinal (revisado en Best et al. Y Lawley & Young) 13,14.
Más recientemente, un amplio espectro de cefalosporina, cefoperazona, dada en el agua de bebida durante 5 o 10 días reproducible hace ratones susceptibles a CDI 15. Puesto que la administración de cefalosporinas de tercera generación están asociados con un mayor riesgo de CDI en los seres humanos, el uso del modelo de cefoperazona refleja con mayor precisión la enfermedad 16 de origen natural. Cefoperazona tratados con ratones susceptibles a C. difficile han sido desafiados con las dos esporas de C. difficile y células vegetativas de una variedad de cepas que van de clínicarelevancia y la virulencia 17. A pesar de algunos de los estudios originales que utilizan C. difficile células vegetativas como la forma infecciosa, esporas de C. difficile se consideran el principal modo de transmisión 18.
En la última década, C. difficile R20291, a / BI / 027 NAP1, ha surgido, causando epidemias de CDI 19,20. Hemos tratado de determinar la evolución clínica de la enfermedad, cuando los ratones tratados con cefoperazona fueron desafiados con la cepa de C. difficile clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Este protocolo se detalla el curso clínico, incluyendo pérdida de peso, la colonización bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y cambios histopatológicos en el tracto gastrointestinal de los ratones desafiados con esporas de C. difficile R20291. En general, este modelo de ratón demuestra ser una plataforma experimental valioso para CDI aproximación de la enfermedad humana. Este modelo de ratón caracterizado por lo tanto se puede utilizar para evaluar los efectosde nuevas terapias en la mejora de la enfermedad clínica y en la restauración de la resistencia a la colonización contra C. difficile.
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Protocol
Declaración de ética:
El Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) en Carolina del Norte Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal (NCSU) aprobó este estudio. El Cuidado de Animales NCSU y usar la directiva aplica las normas y directrices establecidas en la Ley de Ley y Extensión Investigación en Salud Animal Welfare de 1985. Las instalaciones de los animales de laboratorio en la NCSU adherirse a las directrices establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Estados de salud de los animales se evaluaron diariamente y animales moribundos fueron sacrificados humanitariamente por asfixia con CO2 seguida de medidas secundarias. técnicos en animales entrenados o por un veterinario a cabo la cría de animales en una instalación acreditada por la AAALAC durante este estudio.
1. Administración del antibiótico cefoperazona en el agua potable para lograr la susceptibilidad a C. difficile La colonización y la enfermedad
NOTAS: / 6 ratones WT 5 a 8 semanas de edad C57BL (hembras y machos)fueron comprados y puestos en cuarentena durante 1 semana antes de iniciar la administración de antibióticos agua. Después de la cuarentena, los animales fueron alojados en autoclave con alimentos, ropa de cama, y agua. cambios de jaula se realizaron semanalmente por el personal del laboratorio en una campana de flujo laminar.
- Preparar cefoperazona (0,5 mg / ml) en agua destilada estéril 7 días antes del día específica de desafío (Figura 1).
- Llenar las botellas de agua tratadas en autoclave con agua cefoperazona (0,5 mg / ml) y colocarlos en cada jaula del ratón.
NOTA: agua cefoperazona recién preparada se debe hacer y cambió a cabo cada 2 días durante un período de 5 días, como se indica en los pasos 1.1 y 1.2. Se recomienda la eliminación adecuada de agua cefoperazona siguiendo las directrices de salud y seguridad ambiental institucionales. - Después de 5 días en el agua cefoperazona, vuelva a colocar las botellas con botellas de agua tratado al autoclave llenas de agua destilada estéril. Dar ratones este agua potable para la duración del experimento.
2. Preparación de la C. difficile inóculo de esporas y la sonda oral de los ratones
NOTA: Antes de empezar, asegúrese de que los siguientes elementos se colocan en la cámara anaeróbica durante al menos 24 horas: 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS; véase Materiales), cicloserina taurocolato cefoxitina fructosa agar (TCCFA) placas (ver Materiales y el archivo suplementario ), y un esparcidor en forma de L estéril.
NOTA: Los ratones inoculados con esporas de C. difficile deben ser alojados en una instalación para animales de bioseguridad de nivel 2.
- Obtener una C. difficile esporas balance de la cepa deseada (en este caso, R20291) que se preparó anteriormente y se almacena a 4 ° C en agua estéril 21,22. Determinar la enumeración de esta espora de stock antes de su uso.
- Basado en la concentración conocida (esporas / ml) de la población de esporas, calcular la dilución deseada para obtener 10 5 esporas por 25 l. Asegúrese de que el volumen de inóculo es adecuada para inocular todoratones en el experimento (25 l por ratón), para llevar a cabo la enumeración del inóculo (aproximadamente 30 l), y para tener en cuenta errores de pipeteo.
- Vórtice del C. difficile esporas población original. A continuación, volver a suspender el volumen calculado (del paso 2.2) de la C. difficile esporas población original en agua estéril dentro de un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca. Realice este aeróbicamente en una campana de flujo laminar. Identificar esta mezcla diluida como el "inóculo de esporas."
- Coloque el inóculo de esporas en un baño de agua 65 ° C y se calienta durante 20 min.
NOTA: Este paso se asegurará de que solo se activan esporas de C. difficile permanecen después del tratamiento térmico. - Dentro de la campana de flujo laminar, tomar 50 l de inóculo de esporas climatizada, colocarlo en un tubo de microcentrífuga estéril, e introducir en la cámara anaeróbica 23. Utilice esta muestra para el recuento de esporas.
- Dentro de la campana de flujo laminar, cargar el resto de esporas climatizada inóculo intOA jeringa de 1 ml unida a una aguja de sonda gástrica bulbo con punta estéril. Utilizar una jeringa manual paso a paso para garantizar la repetición exacta y rápida administración de dosis entre los ratones. Asegúrese de que la aguja de sonda se llena con el inóculo de esporas se calienta antes de su uso.
NOTA: Una nueva aguja de sonda estéril para cada ratón no es necesario. Sin embargo, si se administran varias dosis de esporas de C. difficile, se recomienda una nueva aguja de sonda para cada dosis.
NOTA: esporas de C. difficile son altamente resistentes a los desinfectantes tradicionales. Por lo tanto, el uso de un desinfectante esporicida, tal como # 62 Perisept esporicida Desinfectante, es necesario. El fabricante recomienda un tiempo de contacto de 2 minutos para destruir esporas de C. difficile. - Gavage cada ratón con 25 l de inóculo de esporas. Restringir cada ratón suavemente agarrando al animal por la piel suelta del cuello y la espalda con el fin de inmovilizar la cabeza. Con el dedo índice de inmovilizar aún más la cabeza del animal y paraalargar el esófago. Asegúrese de que el animal no vocalizar o mostrar otros signos de angustia durante moderación.
Nota: El volumen total dada a los ratones mediante sonda no debe exceder de 10 ml / kg de peso corporal (0,1 ml / 10 g). - Mantener el ratón en una posición vertical, vertical y pasar suavemente la aguja de sonda en el lado de la boca. Dirigir la aguja de sonda a lo largo del techo de la boca y avanzar lentamente la aguja de sonda en el esófago.
NOTA: Si se encuentra alguna resistencia, la aguja de sonda puede estar entrando en la tráquea y por lo tanto no debe ser avanzado, pero en lugar retirado y colocado de nuevo inmediatamente. - Después de que la aguja de sonda es aproximadamente a mitad de camino en el esófago, inyectar 25 l de inóculo de esporas climatizada y retirar suavemente la aguja de sonda desde el esófago.
NOTA: Contundente avance de la aguja de sonda puede conducir a la ruptura del esófago o el estómago. Por lo tanto, si se percibe una resistencia al avance de la aguja de sonda, Lo mejor es quitar y volver a colocar la aguja de sonda inmediatamente. - Devolver el animal a su jaula y observarlo para cualquier tos o signos de dificultad respiratoria, ya que esto puede indicar la administración traqueal accidental o aspiración del inóculo de esporas climatizada.
NOTA: Los ratones son extremadamente susceptibles a C. difficile después del tratamiento con antibióticos; Por lo tanto, las precauciones para evitar la contaminación cruzada entre las jaulas es esencial. Esto es especialmente importante en la gestión de los ratones tratados con antibióticos pero no impugnados como controles. - Después de la inoculación de todos los ratones, colocar el resto de inóculo de esporas se calienta en un tubo estéril de microcentrífuga y pasarlo en la cámara anaeróbica para la enumeración de esporas.
- Para la enumeración de inóculo de esporas climatizada (del paso 2.4) y el restante gavaged inóculo de esporas calentado, hacer diluciones 1:10 en serie de cada inóculo en 1 x PBS. Se recomienda hacer y la placa 4 - 5 diluciones (es decir, 10 -1 a través10 -5).
- Utilizando una técnica aséptica, la transferencia de 100 l de cada dilución en serie sobre una placa individuo TCCFA.
- El uso de un esparcidor estéril en forma de L, distribuida uniformemente la dilución aplicada al medio de toda la placa. Incluso propagación del inóculo diluida es esencial para el recuento preciso de esporas.
- Incubar las placas en condiciones anaerobias durante 24 horas a 37 ° C. Después de 24 horas, C. difficile unidades formadoras de colonias (UFC) se pueden enumerar para obtener la dosis infectiva se administró a ratones en los 25 l (0.025 ml) de volumen (ver el archivo complementario "Ejemplo de cálculos"). C. difficile colonias son planas y de color amarillo pálido y tienen bordes irregulares y una apariencia de vidrio esmerilado 24.
NOTA: El límite de detección para el recuento bacteriano es 10 2 UFC.
3. Seguimiento de la pérdida de peso del ratón y clínicas Signos de la enfermedad a lo largo de infección por C. difficile
- Pesar unanimals antes y después del tratamiento con antibióticos 5-día cefoperazona, después de la recuperación 2-días fuera de antibióticos (día 0) y, a continuación durante la duración del experimento.
NOTA: Obtener pesos a la vez consistente cada día. Pesos obtenidos el día de la exposición (día 0) se debe utilizar como el peso de línea de base inicial para la comparación a lo largo de la infección por C. difficile. - Coloque una balanza digital en una cabina de bioseguridad. Coloque un vaso de precipitados de plástico estéril a la báscula y tarar el peso del vaso de precipitados de plástico. Luego, suavemente recoger el ratón por la base de la cola y colocarlo en el vaso de plástico.
- Poner el vaso de nuevo en la escala. Asomar una mano sobre la parte superior del vaso para asegurar que el ratón no se escape. Puede tomar 2 - 3 segundos para obtener un peso estable. A continuación, coloque suavemente el ratón de nuevo en su jaula. Registre este peso y repetir el proceso para cada ratón en esa jaula.
NOTA: Es imprescindible que se tomen precauciones para evitar cruzada Contaminación entre las jaulas en la obtención de pesos. Cada jaula de los ratones debería tener su propio vaso de plástico para pesar. Los vasos de plástico deben ser desinfectados con un agente esporicida entre cada uso y cubiertos con papel de aluminio estéril.
- Poner el vaso de nuevo en la escala. Asomar una mano sobre la parte superior del vaso para asegurar que el ratón no se escape. Puede tomar 2 - 3 segundos para obtener un peso estable. A continuación, coloque suavemente el ratón de nuevo en su jaula. Registre este peso y repetir el proceso para cada ratón en esa jaula.
- Monitorear los animales estimulados dos veces al día (como mínimo) para detectar signos de infección difficile clínicamente severa C., incluyendo letargo, pérdida de apetito, diarrea y postura encorvada.
- Humanitariamente la eutanasia a los animales que pierden el 20% de su peso corporal inicial de la línea de base y / o desarrollar signos clínicos graves de infección por C. difficile (que aparece en el paso 3.3).
NOTA: Los ratones que muestran signos clínicos de infección por C. difficile se deben pesar como sea necesario durante el experimento para asegurarse de que no han perdido el 20% de su peso corporal inicial de referencia. Durante los momentos iniciales del experimento, esto podría significar mediciones dos veces al día.
4. Enumeración bacteriana de C. difficileAlfombrilla de heces y contenido cecal
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de que los siguientes elementos se colocan en la cámara anaeróbica durante al menos 24 horas: 1x PBS (ver Materiales), placas TCCFA (ver Materiales), un difusor en forma de L estéril y tubos de microcentrífuga estériles y / o placas de PCR para diluciones.
- La obtención de muestras para C. difficile Enumeración
NOTA: Antes de obtener las heces o contenido cecal, pesar tubos de microcentrífuga estériles en una balanza analítica. Anotar el peso del tubo en el lado del tubo, el redondeo con cuatro decimales (por ejemplo, 0,9864 g). Denotar este peso como el "peso del tubo." Cada muestra recogida debe ser colocado en un tubo de microcentrífuga estéril, se pesó.- colección estéril de las heces de ratones
- frenar suavemente cada ratón agarrando al animal por la piel suelta del cuello y la espalda con el fin de inmovilizar la cabeza. Usa el dedo meñique para frenar suavemente la cola del animal, tHus exponiendo el ano. Asegúrese de que el animal no vocalizar o mostrar otros signos de angustia durante moderación.
- Mantenga un tubo de microcentrífuga estéril, se pesó directamente bajo el ano del animal. Es imperativo que el tubo no entre en contacto directo con el ratón.
- Como el animal defeca, recoger el sedimento fecal en el tubo. Mantenga el tubo a temperatura ambiente hasta que se recogen todas las muestras fecales. Puede tomar varios minutos para que un ratón para defecar, necesitando por lo tanto los intentos de repetición para recoger las heces.
- Pesar los tubos que contienen las heces en la escala analítica. Anotar el peso del tubo, redondeando al cuarto decimal (por ejemplo, 1,0021 g). Denotar el peso obtenido como el "peso final del tubo".
- Pasar las muestras fecales en la cámara anaeróbica para la enumeración de bacterias directamente después de la recogida de heces.
- colección estéril del contenido cecal del ratón en el momento de la necropsia
- Después de la eutanasia por asfixia con CO2 seguida de medidas secundarias, lleve a cabo una necropsia para obtener el ciego 25. El ciego es la sección grande, en forma de coma del tracto gastrointestinal.
- Coloque el ciego en una placa de petri de plástico estéril. Use un no desechable, estéril. 10 hoja de bisturí para cortar el ciego abierto desde el extremo ciego de la bolsa para exponer el contenido cecal.
- extraer suavemente el contenido cecal aplicando una ligera presión con la hoja de bisturí y barriendo los contenidos hacia la parte incisa del ciego.
NOTA: Se debe tener cuidado de no destruir el tejido cecal, que será presentado para su examen histopatológico.
- extraer suavemente el contenido cecal aplicando una ligera presión con la hoja de bisturí y barriendo los contenidos hacia la parte incisa del ciego.
- Coloque el contenido cecal en un tubo estéril de microcentrífuga pesó inmediatamente después de la recogida. Sólo se requiere alrededor de 10 mg de contenido cecal para el recuento bacteriano.
- Pesar los tubos que contienen el contenido cecal en el análisis fiscalmi. Anotar el peso del tubo, redondeando al cuarto decimal (por ejemplo, 1,0021 g). Denotar el peso obtenido como el "peso final del tubo".
- Pasar las muestras de contenido cecal en la cámara anaeróbica para la enumeración de bacterias.
- colección estéril de las heces de ratones
- Enumeración de bacterias de C. difficile
- Calcular el peso final de los contenidos (heces o cecales) que se enumeran por C. difficile. Realizada esta restando el "peso tubo final" del "peso del tubo."
- Calcula una dilución 1:10 de los contenidos en 1X PBS y resuspender en consecuencia. Para bolitas fecales, utilice la punta de la pipeta para romper suavemente el sedimento en la solución (consulte el archivo complementario "Ejemplo de cálculos").
- Anaerobio incubar estas muestras se resuspendieron a temperatura ambiente durante 30 min, permitiendo que el contenido se asienten.
- Hacer diluciones seriadas de cada muestra con PBS 1x para la enumeraciónración de la UFC por g de contenido (o heces) cecal. Realice esta forma anaeróbica.
- Utilizando una técnica aséptica, la transferencia de 100 l de cada dilución en serie de placas TCCFA. El uso de un esparcidor estéril en forma de L, se extendió la dilución aplicada a los medios de comunicación para difundir de manera uniforme a través de la placa. Incluso la difusión de la dilución es esencial para la enumeración precisa de colonias.
- Incubar las placas en condiciones anaerobias durante 24 horas a 37 ° C. En este momento, enumerar colonias de C. difficile para obtener el UFC por g de contenido (heces o cecal). C. difficile colonias son planas y de color amarillo pálido y tienen bordes irregulares y una apariencia de vidrio esmerilado 24.
NOTA: Este protocolo se puede utilizar para enumerar C. difficile del resto del contenido GI murino, incluyendo ileal y el contenido del colon. placas de PCR se pueden utilizar para hacer diluciones en serie.
5. Vero Cell citotoxicidad ensayo para cuantificar la toxina de C. difficile Cytotoxiciudad
NOTA: Se recomienda que este ensayo se lleva a cabo después de la finalización del modelo de ratón con muestras tomadas en la necropsia y se almacenaron a -80 ° C. técnicas de cultivo celular asépticas son esenciales para evitar la contaminación de células Vero durante este ensayo. Este protocolo tiene 2 días para llevar a cabo. Todas las heces y el contenido intestinal utilizada en este ensayo se deben almacenar en un tubo estéril de microcentrífuga pesó (denotado con el "peso tubo", ver la sección anterior). El peso final del tubo (incluido el contenido) se mide a través de una escala analítica a los cuatro decimales más próximos (véase la sección anterior). El uso de una pipeta de múltiples canales se recomienda para este ensayo.
NOTA: Antes de empezar, asegúrese de que los siguientes artículos están disponibles: Las células Vero, la modificación de Dulbecco del medio Eagle 1x (DMEM) con suero al 10% inactivado por calor bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / media estreptomicina (denotado como "DMEM 1x medios de comunicación; "ver Materiales y el archivo suplementario), 0,25%Tripsina-EDTA, 1x PBS, 0,4% de azul de tripano, una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano, una placa de filtro de 96 pocillos, la toxina de Clostridium difficile A (la alícuota en 3 l a 1 g / l en agua ultra-pura y almacenar a -80 ° C), antitoxina de Clostridium difficile, una hoja de cálculo (para los cálculos y mapas de placas; ver archivos adicionales).
NOTA: Se debe tener cuidado durante este ensayo para la exposición del personal a C. difficile y sus toxinas.
- La división de las células Vero (Día 1)
- Precalentar el medio DMEM 1x, 0,25% de tripsina-EDTA y 1x PBS en un baño de agua a 37 ° C.
- Obtener un frasco de células Vero de la incubadora de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO 2) y colocarlo en el cultivo celular campana de flujo laminar estéril. Utilizar etanol al 70% para limpiar el capó y el equipo antes de su uso. Con una pipeta serológica, aspirar los medios de comunicación del matraz de cultivo de tejidos para eliminarlo de las células Vero y desechar los residuos en un container.
- Enjuagar las células Vero con 5 ml de 1x PBS (precalentado) en el matraz de cultivo de tejidos. Aspirar el PBS y desecharlo en un recipiente de residuos.
- Añadir 5 ml de 0,25% de tripsina-EDTA al matraz de cultivo de tejidos. Permitir un tiempo de contacto de 2 - 3 min. Durante este tiempo, observan las células comienzan a salir de la superficie del matraz. Agite suavemente el lado frasco de cultivo de tejidos a lado para aflojar las células Vero.
- Después de un tiempo de contacto con tripsina-EDTA, añadir inmediatamente 5 ml de medio DMEM 1x en el matraz de cultivo de tejidos. Esto neutralizar la tripsina-EDTA. Utilice esta solución para lavar suavemente las células Vero no unidas de la parte posterior del matraz. A continuación, utilizar una pipeta serológica para transferir esta mezcla en un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar las células Vero en el tubo cónico durante 5 min a 180 xg y 25 ° C. Asegúrese de que la centrífuga esté bien equilibrado. Después de centrifugar, observar un sedimento visible de células Vero en la parte inferior del tubo cónico. Tenga cuidado de no DISRUPT este pellet. Aspirar el sobrenadante del tubo cónico y lo descarta.
- Resuspender las células Vero en 3 ml de medio DMEM 1x.
- Contando las células Vero
- Añadir 100 l de la suspensión de células Vero (hecho en el paso 5.1.7) a 100 l de 0,4% de azul de tripano. Mezclar suavemente con la pipeta la solución de arriba a abajo.
- Añadir 10 l de esta mezcla a cada cámara de un hemocitómetro.
- Contar el número de células viables dentro de los cuatro cuadrantes del hemocitómetro. Las células Vero muertos tendrá el azul tripán y por lo tanto se encuentran en azul (estas células no se deben contar). Anote estos números en la "Hoja de células Vero," proporcionado.
- Suma el número total de células Vero viables en los cuatro cuadrantes y calcular la media. Se multiplica por el factor de dilución, que es 2 desde 100 l de células se encuentran en un total de 200 l de líquido.
- Se multiplica por el factor de corrección para obtener el "; número de células / ml "Cuando utilizando un hemocitómetro, el factor de corrección es siempre 10 4 Multiplicar por el volumen total para dar el." número total de células "..
- Determinación del número de pozos requeridos para cada experimento
NOTA: Una sola muestra de heces (ya sean o contenido intestinal) requiere 24 pocillos separados para ser realizados por duplicado. Se requiere una concentración de 10 5 células Vero por pocillo (volumen total de 90 l).
NOTA: Si se desea se incuban las placas de 96 pocillos de células Vero durante la noche a 37 ° C, una concentración de 10 3 células Vero por pocillo se recomienda para tener en cuenta el tiempo de incubación prolongado. Los cálculos dentro de la celda de hoja Vero tendrían que ser ajustado para tener en cuenta este cambio.- Determinar el número de pozos que pueden ser utilizados en base a la cantidad de células Vero disponibles (de la etapa 5.2, el uso de la hoja de trabajo de células Vero, se proporciona).
- Determinar el volumen desuspensión de células Vero necesario para llenar el número de pozos deseados (en función del número de muestras que se probó). Asegúrese de que cualquier volumen adicional se añade a la cuenta de error de pipeteo (utilice la Hoja de trabajo de la célula Vero proporcionado).
- Diluir la suspensión de células Vero (obtenido en el paso 5.1.7) en medios DMEM 1x para obtener el volumen requerido para el experimento.
- Siembra de células Vero en una placa de 96 pocillos de cultivo celular
- Uso de la resuspensión de células Vero de la Etapa 5.3.2, utilizar una pipeta multicanal para añadir 90 l de la suspensión de células Vero a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano.
- Se incuba la placa con las células Vero en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2 durante un mínimo de 4 horas antes de añadir la toxina (muestras) a los pocillos. Este tiempo de incubación permitirá que las células Vero se adhieran a la parte inferior de cada pocillo.
- Creación de archivo Las soluciones de las muestras (heces oContenido intestinal)
NOTA: Todas las muestras deben tener el "peso del tubo" y "peso final del tubo", medida a través de una balanza analítica. Utilice la hoja de la célula Vero para los cálculos.- Calcular el peso de los contenidos. Convertir g a mg, a continuación mg a l. Calcular el número total final de l de solución necesarios para hacer una dilución 1:10 en PBS 1x. Calcular la cantidad total de PBS 1x para añadir a la muestra.
- Añadir el volumen total de 1x PBS (calculado anteriormente) a la muestra. Realice este aeróbicamente, y utilizando una técnica aséptica. Para bolitas fecales, utilice la punta de la pipeta para romper suavemente el sedimento en la solución.
- Vortex las muestras y centrifugar ellos en 3522 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que la centrífuga esté bien equilibrado. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento y volver a suspender la muestra en solución.
NOTA: Durante el Paso 5.5.3, si se procesan sólo unas pocas muestras, los contenidos se pueden esterilizar porpasar a través de un único filtro de 0,22 micras en lugar de utilizar una placa de filtro de 96 pocillos. Algunas muestras pueden requerir varios filtros para esterilizar todo el contenido de volumen utilizando esta técnica. - Esterilizar la mezcla de muestra / PBS mediante la adopción de 150 l de sobrenadante y colocándolo en pocillos separados en una placa de filtro de 96 pocillos. Coloque la placa de filtro de forma segura en la parte superior de una placa de fondo plano de cultivo celular de 96 pocillos para que el contenido se filtrarán en esta placa.
- Centrifugar la pila placa de cultivo de placa de filtro / celular a 431 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que la centrífuga esté bien equilibrado y que el / célula pila placa de cultivo de placa de filtro están estrechamente alineados y no se desplazará durante la centrifugación.
NOTA: Estos contenidos filtrados son la población de 10 -1 que se utiliza en las placas de dilución. - Coloque la placa con muestras filtradas sobre hielo.
- Creación de dilución en placa # 1
NOTA: Dilución PlaTE # 1 (DP # 1) requerirá 6 pocillos por muestra, incluyendo positivo (C. difficile toxina A) y negativo (1x PBS) controles (ver el DP # 1 en el diseño de la hoja de trabajo de la célula Vero).- Para preparar el control positivo (la toxina de C. difficile A) para este ensayo, obtener 3-mu l alícuotas (1 mg / l) de -80 ° C y añadir 297 l de agua ultrapura, produciendo una concentración final de 0,01 mg / l. Colocar sobre hielo.
- Etiqueta de los pozos con sus diluciones (10 -1 a 10 -6) para cada muestra y se indican los controles positivos y negativos (véase la DP # 1 diseño).
- Añadir cantidades apropiadas de 1x PBS a cada pocillo. En los 10 pozos -1, añadir NO PBS. A los 10 -2 a 10 -6 pozos, añadir 90 l de PBS 1x.
- Añadir cantidades apropiadas de las muestras a cada pocillo. En los 10 pozos -1, añadir 100 l de la población de 10 -1 para cada muestra (véase el paso 5.5.7 de la plataforma de filtromi). A los 10 -2 a 10 -6 pozos, hacer diluciones seriadas; comenzar por tomar 10 l del pozo 10 -1 y agregarlo a la 10 -2 bien. Continuar las diluciones seriadas a la dilución 10 -6.
- Cubrir la placa # 1 DP con un sello adhesivo de plástico transparente y colocarlo en hielo.
- Creación de dilución en placa # 2
NOTA: La placa de dilución (DP # 2) requerirá 2 carriles de 6 pocillos para cada muestra, incluidos los controles positivos y negativos (véase la disposición DP # 2 en la celda de hoja Vero).- Etiqueta de los pozos con sus diluciones (10 -1 a 10 -6) para cada muestra y se indican los controles positivos y negativos (véase el # 2 diseño DP). Etiquetar los pozos con el nombre de la muestra (denotado como "pozos de muestra") o el nombre de la muestra con la antitoxina (denotado como "pozos de antitoxina").
- Calcular la cantidad de antitoxina necesario para este ensayo. NOTA: La antitoxina es una acción 25xsolución que necesita ser diluido 1:25 en 1X PBS. Coloque la solución preparada antitoxina 1x en hielo.
- Para los "pocillos de muestra", añadir 20 l de 1x PBS a cada pocillo para todas las diluciones (10 -1 a 10 -6) de esa muestra. Para los "pozos de antitoxina," añadir 20 l de 1x antitoxina a cada pocillo para todas las diluciones (10 -1 a 10 6) de esa muestra.
- Transferencia de 20 l de la muestra diluida en los pozos de DP # 1 en los pocillos designados en DP # 2 para las filas 1 - 6 y 7 filas - 12 (véase la disposición DP # 2 en la celda de hoja Vero). Mezclar la solución suavemente pipeteando arriba y abajo.
- Cubrir DP # 2 con una lámina adhesiva de plástico transparente y permitir 40 minutos de incubación a temperatura ambiente. Esta incubación es permitir la antitoxina para unirse y, por tanto inactivar y neutralizar la toxina de C. difficile.
- Después de la incubación, añadir 10 l de mezcla de DP # 2 a los pocillos apropiados de células Vero (véase la disposición de la placa de células Vero en el VCelda de hoja de ERO). Mezclar suavemente la solución pipeteando arriba y hacia abajo, teniendo cuidado de no romper las células Vero que se adhieren a la superficie inferior de los pocillos.
- Incubar la placa de células Vero durante la noche en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Evaluar las células Vero para el redondeo utilizando un microscopio de luz (día 2)
NOTA: Recuerde que el factor de dilución cambios en un factor de 10 cuando la adición de las mezclas de muestras a la placa de células Vero (por ejemplo, 10 -3 es ahora 10 -4). Los pozos que tienen la antitoxina presentes deben tener poco o ningún redondeo de células Vero señaló. Redondeo de células Vero (citotoxicidad) se observó en las muestras que contienen la toxina de C. difficile. Si la actividad citotóxica se neutraliza en una dilución que contiene la muestra y la antitoxina, se confirmó la presencia de la toxina de C. difficile que resulta en la citotoxicidad de células Vero.- Examinar para el redondeo de células Vero usando un light microscopio a 200X aumentos. Para los pozos de muestras (incluyendo el control positivo), grabar la dilución del bien que es la última que el 80% de redondeo de células Vero señalado.
- Calcular el título citotóxica, que se define como el recíproco de la dilución más alta que produjo 80% de redondeo de células Vero por g de muestra. Por ejemplo, si la dilución más alta es 10 -5, entonces el factor de dilución sería 10 -6 para esta muestra. Por lo tanto, el log [factor de dilución final] / g de muestra sería log [10 6], que produce un título recíproco de 6.
NOTA: Las células Vero tienen que haber sido objeto de al menos 3 - 4 pases y no más de 30 pasajes antes de su uso en este ensayo 26.
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Representative Results
Durante un estudio representativo, 5 semanas de edad C57BL / 6 ratones WT fueron pretratados con cefoperazona en su agua potable (0,5 mg / ml) durante 5 días y se dejaron a 2 días a lavar con agua potable regular. Los ratones fueron retados con 10 5 esporas de C. difficile R20291 mediante sonda oral en el día 0 (Figura 1A). Los ratones se controlaron para la pérdida de peso y los signos clínicos (letargo, inapetencia, diarrea, y la postura encorvada) de CDI durante 14 días. El reto de C57BL / 6 ratones WT con esporas de C. difficile R20291 dio lugar a la diarrea dentro de las 24 horas y la pérdida de peso significativa dentro de las 48 horas después de la estimulación (Figura 1B). Aunque no se ha observado en este experimento, los ratones expuestos a una dosis más alta de C. difficile R20291 pueden enfermar gravemente o incluso tener más de un 20% de pérdida de peso en un 48 - 72 horas después de la exposición, y necesitan de la eutanasia humanitaria. Por lo tanto, los ratones requieren un mínimo de dos veces al díael seguimiento después del desafío con esporas de C. difficile.
En este estudio representativo, una cantidad significativa de pérdida de peso y los signos clínicos de la enfermedad en los ratones también se observaron en los días 2-7 después de la estimulación (Figura 1B). A los 7 días después de la exposición, los ratones comenzaron a aumentar de peso, y los signos clínicos de la enfermedad se calmaron. Por la última semana del experimento, los ratones parecían clínicamente normal, sin evidencia de los signos clínicos de CDI, incluyendo la diarrea.
Bolitas fecales se recogieron antes de la exposición con esporas de C. difficile y cada 48 horas después de la estimulación (Figura 1C). Antes del tratamiento con antibióticos, los ratones no fueron colonizados con C. difficile. Dentro de las 24 horas después de la inoculación con esporas de C. difficile, los ratones fueron colonizados con 10 7 UFC de C. difficile por gramo de heces (Figura 1C </ Strong>). Los ratones permaneció persistentemente colonizados con C. difficile durante todo el experimento, a pesar de evidencia de pérdida de peso o signos clínicos de CDI para los últimos 7 días del experimento.
Figura 1: Los ratones tratados cefoperazona retados con C. difficile R20291 Pérdida de peso y de exposiciones están colonizadas con C. difficile. A) 5 semanas de edad C57BL / 6 ratones WT JAX (n = 3 M / 3F por grupo) fueron pretratadas con cefoperazona en su agua potable (0,5 mg / ml) durante 5 días y se dejó a 2 días a lavar con consumo habitual agua. Los ratones fueron retados con 10 5 esporas de C. difficile R20291 mediante sonda oral en el día 0. Los ratones se controlaron para la pérdida de peso y los signos clínicos (letargo, inapetencia, diarrea, y la postura encorvada) de CDI durante 14 días. Las heces se recogen y se utilizan para la enumeración de bacterias antes de iniciar la cefoperazona, inmediatamente faetr terminar el antibiótico, y en los días 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, y 14 a lo largo de la infección. La necropsia se realizó en los días 0, 2, 4, 7 y 14. B) Los ratones perdió una cantidad significativa de su peso inicial después de la estimulación con C. difficile R20291. El peso corporal medio de los ratones se midió diariamente desde el día 0. pérdida de peso significativa se observó en los días 2 a 7, en comparación con el día 0, el peso de referencia. Carga bacteriana C) C. difficile en las heces R20291 después del desafío. Dentro de 24 horas después del desafío con esporas de C. difficile, todos los ratones fueron colonizados con 10 7 UFC (unidades formadoras de colonias) por g de heces. No se observaron diferencias significativas en estos parámetros entre hembras y machos. La significación se determina por la sola vía test no paramétrico ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de post-test de Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001; ****, p Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Cuatro ratones (2 machos y 2 hembras) fueron sacrificados humanitariamente y se prepararon para la necropsia el día 0, antes de la infección, para servir como controles no infectados. Además, un ratón de cada jaula se humanamente sacrificados y se preparó para la necropsia el día 2, 4, 7 y 14 después de la estimulación (Figura 1A). Enumeración de C. difficile en el contenido cecal se realizó en cada necropsia. En concordancia con la enumeración fecal, no se detectó C. difficile en el contenido cecal de los ratones antes de la estimulación con C. difficile. A las 48 horas después de la exposición, los ratones fueron colonizados con aproximadamente 10 8 UFC de C. difficile por gramo de contenido cecal (Figura2A). Todos los ratones se mantuvieron persistentemente colonizados durante todo el experimento.
Contenido cecal también se evaluó a lo largo de la infección por la presencia de toxina de C. difficile usando el ensayo de citotoxicidad de las células Vero. No se detectó ninguna evidencia de citotoxicidad C. difficile en el contenido cecal antes de la exposición (Figura 2B). Se detectó C. difficile citotoxicidad 2 días después del reto con esporas de C. difficile y persistió a lo largo de la infección. A pesar de la colonización bastante uniforme con C. difficile, la variación en los niveles de C. difficile actividad citotóxica es evidente en los ratones individuales (Figura 2B).
La mayoría del contenido cecal ratón neutralizado con C. difficile antitoxina durante el ensayo de citotoxicidad en células Vero y no tenía signos de citotoxicidad (Vero cell redondeo) en la dilución realizados. Sin embargo, algunos ratones individuales, a pesar de volver a probar, tenían evidencia de 50 - 100% de citotoxicidad en la dilución 10 -1 (dilución donde la muestra es más concentrada), sin evidencia de células Vero de redondeo en las otras diluciones. La antitoxina utilizado en este ensayo es un anticuerpo policlonal neutralizante de la toxina de C. difficile, preparado en cabras 27. Por lo tanto, esta antitoxina no puede neutralizar la toxina de C. difficile binario que se produce por la cepa R20291. Sin embargo, la toxina de C. difficile binario no se considera que es citotóxico 10. El exceso de la toxina de C. difficile no puede ser neutralizada por la antitoxina o la presencia de otro agente citotóxico que no sea la toxina de C. difficile podría estar contribuyendo a este hallazgo. Esta observación no afecta a la determinación del título de citotoxicidad para estas muestras, desde la última dilución de cada muestra con el redondeo de células Vero 80% teníanno hay pruebas de citotoxicidad cuando se combina con la antitoxina a la dilución especificada.
Figura 2: La colonización del ciego y la citotoxicidad durante la infección con C. R20291 difficile. A) ceca Los ratones se mantuvo persistentemente colonizados con C. difficile durante todo el experimento, a pesar de la resolución de los signos clínicos y la ganancia de peso observada. Todos los ratones fueron colonizados con mayor de 10 8 UFC por g de contenidos cecales cuando se evaluó a los 2 días después de la estimulación. B) ensayo de citotoxicidad en células Vero a partir del contenido cecal lo largo de la infección por C. R20291 difficile. Tras el reto con esporas de C. difficile, los ratones tenían niveles significativos de citotoxicidad, tal como se mide en el registro de 10 dilución recíproca de la toxina por g de contenido cecal en los días 2, 4 y 7 después de la estimulación en comparación con el día 0 (medianas Représented hacia la línea). La significación se determina por la sola vía test no paramétrico ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de post-test de Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001 ). Las barras de error representan las desviaciones estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se recomienda que la evaluación histológica se llevó a cabo por un patólogo veterinario certificado por el consejo en una forma ciega. Para la puntuación de tejidos, un sistema de puntuación numérica 0-4 debe ser empleado para evaluar por separado edema, infiltración de células inflamatorias, y el daño de las células epiteliales en el íleon, ciego y colon basado en un sistema de puntuación previamente publicado-17.
Al examen histopatológico ciegominación de la murino íleon, el ciego y el colon después de la estimulación con C. difficile R20291, los cambios patológicos más significativos se observaron en el ciego (Figura 3). Las puntuaciones histológicas cecales totales fueron significativamente diferentes entre los días 0 y día 2 y 4 después de la estimulación. No hay lesiones significativas se observaron en el íleon lo largo de la infección (Figura 3). Las lesiones más leves se observaron en el colon. Los resultados histológicos del colon totales fueron significativamente diferentes entre el día 0 y los días 2 y 7 después de la estimulación (Figura 3).
Secciones representante de H & E del íleon, el ciego y el colon a través de la infección están disponibles en la Figura 4. Cada imagen tiene su respectivo registro histológico total y las puntuaciones individuales de daño epitelial, inflamación y edema, según lo determinado por un patólogo veterinario certificado por el consejo ciego ( SAM).
Figura 3: La puntuación histológica del Murino íleon, ciego y colon durante la infección con C. R20291 difficile. resultados histológicos totales se calculan sumando las tres puntuaciones de los parámetros evaluados: el daño epitelial, inflamación y edema. No hay cambios histopatológicos significativos se observaron en el íleon en toda infección. tejido cecal contenía las lesiones histológicas más significativos durante CDI. Los resultados histológicos cecal totales fueron significativamente diferentes desde el día 0 en los días 2 y 4 después de la estimulación. Las lesiones más leves se observaron en el colon. Los resultados histológicos del colon totales fueron significativamente diferentes desde el día 0 en los días 2 y 7 después de la exposición. La significación se determina por la sola vía test no paramétrico ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de post-test de Dunn (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p804; 0.001; ****, P ≤ 0,0001). Las barras de error representan las desviaciones estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La histopatología durante la infección con C. R20291 difficile. Este panel contiene secciones representativas H & E de íleon, ciego y colon a través de la infección por C. difficile R20291. Los resultados histológicos totales están entre paréntesis () para el día correspondiente y el tejido que aparece, porque el día íleon 0 (0), el día 2 (1), el día 4 (0), el día 7 (0), y el día 14 (0) ; ciego para el día 0 (0), el día 2 (5), el día 4 (4), el día 7 (3), y el día 14 (3); y para el día de colon 0 (0), día 2 (4), día 4 (1), día 7 (4), y día 14 (2). Las microfotografías se obtuvieron en un microscop luze con una cámara digital de 5 megapíxeles y su software que lo acompaña (la barra de escala representa 200 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
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