Summary
Detta protokoll beskriver cefoperazon musmodell av Clostridium difficile-infektion (CDI) med en kliniskt relevant och genetiskt foglig stam, R20291. Betoning på klinisk övervakning sjukdom, C. difficile bakteriell uppräkning, toxin cytotoxicitet och histopatologiska förändringar under CDI i en musmodell beskrivs i protokollet.
Introduction
Clostridium difficile är en anaerob, grampositiv, sporbildande bakterie som orsakar livshotande diarré 1. C. difficile-infektion (CDI) är associerad med ökad mänsklig morbiditet och mortalitet och resulterar i mer än $ 4,8 miljarder sjukvårdskostnader per år 1-4. 2013, de Centers for Disease Control and Prevention kategoriseras C. difficile som en brådskande antibiotikaresistens risk, vilket indikerar att det utgör ett akut hot mot folkhälsan en. För närvarande är antibiotikabehandling med vankomycin och metronidazol anses normen av omsorg för CDI 5. Olyckligtvis är återkommande CDI efter framgångsrik behandling med antibiotika hög, förekommer i 20-30% av patienterna 2,5-7. Därför är det nödvändigt att upptäckten av nya läkemedel mot denna enter patogen. För att utvärdera terapeutika mot C. difficile, en djurmodell som approximerar den mänskliga sjukdomen i acbehövs linically relevanta stammen.
Inledningsvis var Kochs postulat fastställts för C. difficile 1977 med hjälp av en klindamycin behandlad syrisk hamster modell 8. Denna modell är fortfarande används idag för att undersöka effekterna av C. difficile-toxiner på patogenes 9,10. Men CDI i hamstermodellen resulterar i hög dödlighet och inte närma kroniska lömsk sjukdom manifestationer som kan ses hos människor med CDI 10,11. Baserad på tillgänglighet och reagens tillgängligheten av murina plattformar inom forskning, är en musmodell av CDI relevanta.
Under 2008 genomfördes en robust musmodell av CDI fastställts genom att behandla möss med ett antibiotikum cocktail i dricksvatten (kanamycin, gentamicin, kolistin, metronidazol, och vankomycin) under 3 dagar följt av en intraperitoneal injektion av klindamycin 12. Detta renderade möss mottagliga för CDI och svår kolit. Beroing på ympen administrerade dosen, kan observeras en rad kliniska tecken och dödlighet med användning av denna modell. Sedan denna tid har olika antibiotiska regimer undersökts som förändrar den murina tarmfloran, minskande kolonisering motstånd mot den punkt där C. difficile kan kolonisera mag-tarmkanalen (översikt i Best et al., Och Lawley & Young) 13,14.
På senare tid har ett brett spektrum cefalosporin, cefoperazon, ges i dricksvattnet i 5 eller 10 dagar gör reproducerbart möss mottagliga för CDI 15. Eftersom administrering av tredje generationens cefalosporiner är förknippade med en ökad risk för CDI hos människor, användning av cefoperazon modellen bättre speglar naturligt förekommande sjukdomar 16. Cefoperazon-behandlade möss mottagliga för C. difficile har ifrågasatts med både C. difficile sporer och vegetativa celler av olika stammar som sträcker sig i kliniskrelevans och virulens 17. Trots vissa av de ursprungliga studier där man använt C. difficile vegetativa celler som smitt form, C. difficile sporer anses vara den stora överföringsteknik 18.
Under det senaste decenniet, C. difficile R20291, en NAP1 / BI / 027-stammen, har dykt upp, vilket epidemier av CDI 19,20. Vi försökte bestämma den kliniska sjukdomsförloppet när cefoperazon behandlade mössen med kliniskt relevant och genetiskt foglig C. difficile stam, R20291. Detta protokoll detaljer det kliniska förloppet, inklusive viktförlust, bakteriell kolonisering, toxin cytotoxicitet, och histopatologiska förändringar i mag-tarmkanalen hos möss utmanade med C. difficile R20291 sporer. Sammantaget visar denna musmodell för att vara en värdefull experimentell plattform för CDI tillnärmning mänskliga sjukdomar. Denna kännetecknas musmodell kan därför användas för att bedöma effekternaav nya läkemedel på förbättring av klinisk sjukdom och om återställande av kolonisationen motstånd mot C. difficile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiska riktlinjer:
Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) godkänt denna studie. NCSU Animal Care och använda policy gäller normer och riktlinjer som anges i djurskyddslagen och hälsoforskning Extension Act från 1985. Laboratoriedjuranläggningar vid NCSU följer riktlinjer som anges i handledningen för vård och användning av försöksdjur. Djurens hälsostatus bedömdes dagligen, och döende djur humant avlivades genom CO 2 kvävning följt av sekundära åtgärder. Utbildade djurtekniker eller en veterinär utfört djurhållning i en AAALAC-ackrediterad anläggning under denna studie.
1. Administration av antibiotikum Cefoperazon i dricksvatten för att uppnå Känslighet för C. difficile Colonization och sjukdom
OBS: 5- till 8 veckor gamla C57BL / 6 WT möss (honor och hanar)köptes och karantän i en vecka före start av antibiotikavattenförvaltningen. Efter karantän, mössen inrymda med autoklaveras mat, sängkläder, och vatten. Cage förändringar genomfördes i veckan genom laboratoriepersonal i ett laminärt flöde huva.
- Förbered cefoperazon (0,5 mg / ml) i sterilt destillerat vatten 7 dagar före den riktade dag utmaning (Figur 1).
- Fyll autoklaveras vattenflaskor med cefoperazon vatten (0,5 mg / ml) och placera dem i varje mus bur.
OBS: nyframställd cefoperazon vatten bör göras och ändras ut varje 2 dagar under en 5-dagars period, som betecknas i steg 1.1 och 1.2. Korrekt omhändertagande av cefoperazon vatten efter institutionella riktlinjer för hälsa och säkerhet miljö rekommenderas. - Efter 5 dagar på cefoperazon vatten, ersätta flaskorna med autoklavevattenflaskor fyllda med sterilt destillerat vatten. Ge möss denna dricksvatten under hela experimentet.
2. Beredning av C. difficile Spore Inokulat och oral sondmatning av möss
OBS: Innan du börjar, se till att följande föremål placeras i den anaeroba kammaren under minst 24 timmar: 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, se Material), taurocholat cykloserin cefoxitin fruktos agar (TCCFA) plattor (se Material och kompletterande fil ), och en steril L-formad spridare.
OBS: mössen med C. difficile sporer bör hållas i en biosäkerhetsnivå 2 djuranläggning.
- Erhålla en C. difficile spor lager av den önskade stammen (i detta fall, R20291), som framställdes tidigare och lagrades vid 4 ° C i sterilt vatten 21,22. Bestämma uppräkning av detta spor lager före användning.
- Baserat på den kända koncentrationen (sporer / ml) av den spor lager, beräkna den önskade utspädningen för att erhålla 10 5 sporer per 25 pl. Se till att inokulatet volymen är tillräcklig för att ympa allamöss i experimentet (25 ^ per mus), för att utföra räkning av inokulum (ca 30 | j, l), och ta hänsyn till pipettering fel.
- Vortex den ursprungliga C. difficile sporer lager. Sedan resuspendera den beräknade volymen (från steg 2,2) av den ursprungliga C. difficile sporer lager i sterilt vatten i en skruvkork mikrocentrifugrör. Utför detta aerobt i ett laminärt flöde huva. Identifiera denna utspädda blandningen som "spor inokulat."
- Placera spor inokulum i en 65 ° C vattenbad och värm under 20 minuter.
OBS: Detta steg kommer att säkerställa att endast aktiva C. difficile sporer kvar efter värmebehandlingen. - Inom laminärt flöde huva, ta 50 pl uppvärmd spore inokulum, placera den i en steril mikrocentrifugrör, och för in den anaeroba kammaren 23. Använd detta prov för spor uppräkning.
- Inom laminärt flöde huva, ladda återstående uppvärmda spor inokulat intoa 1 ml spruta fäst till en steril glödlampa spets magsond nål. Använda en manuell spruta steg för att säkerställa korrekt och snabb upprepad dosering mellan möss. Se till att sondmatning nålen är fylld med den uppvärmda spor inokulatet före användning.
OBS: En ny steril sondmatning nål för varje mus är inte nödvändig. Men om olika doser av C. difficile sporer administreras, är en ny sondmatning nålen som rekommenderas för varje dos.
OBS: C. difficile sporer är mycket resistenta mot traditionella desinfektionsmedel. Därför, är det nödvändigt att använda en sporicidal desinfektionsmedel, såsom # 62 Perisept sporicid Desinfektionsmedel. Tillverkaren rekommenderar en 2-min kontakttid för att förstöra C. difficile sporer. - Sondmatning varje mus med 25 pl av spor inokulat. Hålla tillbaka varje mus försiktigt genom att fatta tag i animaliska den lösa huden på nacken och ryggen för att immobilisera huvudet. Använda pekfingret ytterligare immobilisera djurets huvud ochelongate matstrupen. Se till att djuret inte artikulera eller visa andra tecken på ångest under återhållsamhet.
OBS: Den totala volymen som ges till möss genom sondmatning bör inte överstiga 10 ml / kg kroppsvikt (0,1 ml / 10 g). - Upprätthålla musen i upprätt, vertikalt läge och försiktigt passera sondmatning nålen i sidan av munnen. Rikta sondmatning nålen längs taket i munnen och sakta föra sondmatning nålen i matstrupen.
OBS: Om motstånd uppstår, sondmatning nål kan komma in i luftstrupen och bör därför inte vara avancerade, utan snarare bort och flyttas omedelbart. - Efter sondmatning nålen är ungefär halvvägs in i matstrupen, injicera 25 pl av den uppvärmda spore inokulatet och försiktigt dra tillbaka sondmatning nålen från matstrupen.
OBS: Kraftfull frammatning av sondmatning nålen kan leda till bristningar i matstrupen eller magen. Därför, om motstånd märks vid framflyttning av sondmatning nål, Är det bäst att omedelbart ta bort och flytta sondmatning nål. - Tillbaka djuret till sin bur och observera det för någon hosta eller tecken på andnöd, eftersom detta kan tyda på oavsiktlig trakeal administration eller aspiration av den uppvärmda spor inokulat.
OBS: Möss är extremt känsliga för C. difficile efter antibiotikabehandling; därför försiktighetsåtgärder förhindra korskontaminering mellan burar är viktigt. Detta är särskilt viktigt vid hanteringen av antibiotika-behandlade men obestridda möss som kontroller. - Efter inokulering alla möss, placera den återstående uppvärmda spor inokulum i en steril mikrocentrifugrör och för in den anaeroba kammaren för spor uppräkning.
- För räkning av det upphettade spore inokulat (från steg 2,4) och den kvarvarande sondmatades upphettades spor inokulum, gör 1:10 seriella spädningar av varje inokulum i 1x PBS. Det rekommenderas att göra och plattan 4 - 5 utspädningar (dvs 10 -1 till10 -5).
- Med hjälp av aseptisk teknik, överföra 100 pl av varje serieutspädning på en enskild TCCFA platta.
- Med användning av en steril L-formad spridare, jämnt fördelade utspädnings appliceras till mediet över plattan. Jämn spridning av den utspädda inokulatet är väsentlig för korrekt räkning av sporer.
- Inkubera plattorna anaerobt under 24 h vid 37 ° C. Efter 24 timmar, kan C. difficile kolonibildande enheter (CFU) räknas upp för att få smittsam dos administrerades till möss i 25 ^ (0,025 ml) volym (se kompletterande filen "Exempel Beräkningar"). C. difficile kolonier är platta och blekgul och har oregelbundna kanter och en slipad glas utseende 24.
OBS: Detektionsgränsen för bakteriell räkning är 10 2 CFU.
3. Övervakning Mouse viktminskning och kliniska tecken på sjukdom under C. difficile infektion
- Väg ennimals före och efter fem dagars cefoperazon antibiotikabehandling, efter två dagars återhämtning av antibiotika (dag 0), och sedan under hela experimentet.
OBS: Skaffa vikter på ett konsekvent tidpunkt varje dag. Vikter erhålls dagen av utmaning (dag 0) bör användas som det initiala utgångsvikt för jämförelse hela C. difficile infektion. - Placera en digital skala till en biosäkerhet skåp. Placera en steril plastbägare på vågen och tarera vikten av den plastbägare. Sedan försiktigt plocka upp musen genom basen av svansen och placera den i plastbägare.
- Placera bägaren tillbaka på skalan. Sväva en hand över toppen av bägaren för att säkerställa att musen inte fly. Det kan ta 2-3 sek för att erhålla en stabil vikt. Sedan försiktigt placera musen tillbaka i sin bur. Spela denna vikt och upprepa processen för varje mus i buren.
OBS: Det är viktigt att åtgärder vidtas för att förhindra kors contamination mellan burar när få vikter. Varje bur av möss bör ha en egen plastbägare för vägning. Plast bägare ska desinficeras med en sporicid medel mellan varje användning och täckt med sterilt aluminiumfolie.
- Placera bägaren tillbaka på skalan. Sväva en hand över toppen av bägaren för att säkerställa att musen inte fly. Det kan ta 2-3 sek för att erhålla en stabil vikt. Sedan försiktigt placera musen tillbaka i sin bur. Spela denna vikt och upprepa processen för varje mus i buren.
- Övervaka utmanade djuren två gånger dagligen (minst) för tecken på kliniskt svår C. difficile infektion, inklusive letargi, aptitlöshet, diarré, och krökt kroppshållning.
- Humant avliva djur som förlorar 20% av sin ursprungliga baslinje kroppsvikt och / eller utveckla allvarliga kliniska tecken på C. difficile-infektion (som anges i steg 3,3).
OBS: Möss som visar kliniska tecken på C. difficile infektion ska vägas vid behov under experimentet för att säkerställa att de inte har förlorat 20% av sin ursprungliga baslinjen kroppsvikt. Under tidiga tidpunkter i försöket, kan detta innebära två gånger dagliga mätningar.
4. Bakteriell Räkning av C. difficilefrån mus avföring och cecal innehåll
OBS: Innan du börjar, se till att följande föremål placeras i den anaeroba kammaren under minst 24 timmar: 1x PBS (se Material), TCCFA plattor (se Material), en steril L-formad spridare, och sterila mikrocentrifugrör och / eller PCR-plattor för utspädningar.
- Erhålla prover för C. difficile uppräkning
OBS: Innan få avföring eller cecal innehåll, väger sterila mikrocentrifugrör på en analytisk skala. Spela in röret vikten på den sida av röret, avrundning till fyra decimaler (t.ex., 0,9864 g). Beteckna denna vikt som "röret vikten." Varje prov som tagits bör placeras i en steril, vägde mikrocentrifugrör.- Steril samlingen av mus avföring
- hålla försiktigt varje mus genom att ta tag i animaliska den lösa huden på nacken och ryggen för att immobilisera huvudet. Använd lillfingret för att försiktigt hålla djurets svans, tHus exponera anus. Se till att djuret inte artikulera eller visa andra tecken på ångest under återhållsamhet.
- Hålla en steril, vägde mikrocentrifugrör direkt under djurets anus. Det är absolut nödvändigt att röret inte kommer i direkt kontakt med musen.
- Som djuret defecates, samla det fekala pelleten i röret. Håll röret vid rumstemperatur tills alla fekala prover samlas in. Det kan ta flera minuter för en mus för att uträtta sina behov, vilket kräver upprepade försök att samla avföring.
- Väg rören innehållande avföring på analytisk skala. Spela röret vikt, avrundning till fyra decimaler (t.ex. 1,0021 g). Beteckna den erhållna vikt som "slutliga tuben vikt."
- Passera avföringsprov i den anaeroba kammaren för bakteriell uppräkning direkt efter avföring samling.
- Steril samling av mus cecal innehåll vid tidpunkten för obduktion
- Efter humana dödshjälp av CO 2 kvävning följt av sekundära åtgärder, utföra en obduktion för att få blindtarmen 25. Blindtarmen är den stora, kommaformad sektion av mag-tarmkanalen.
- Placera blindtarmen på en steril petriskål av plast. Använd en engångs steril nr. 10 skalpellblad för att skära blindtarmen öppen från den blinda änden av påsen för att exponera cecal innehållet.
- extrahera försiktigt cecal innehållet genom att trycka lätt med skalpellblad och sopa innehållet mot den snittade delen av blindtarmen.
OBS: Försiktighet bör vidtas för att inte störa den cecal vävnad, som kommer att läggas fram för histopatologisk undersökning.
- extrahera försiktigt cecal innehållet genom att trycka lätt med skalpellblad och sopa innehållet mot den snittade delen av blindtarmen.
- Placera cecal innehållet i en steril, vägde mikrocentrifugrör omedelbart efter samlingen. Endast cirka 10 mg cecal innehåll krävs för bakteriell uppräkning.
- Väg rören innehåller cecal innehåll på den analytiska scale. Spela röret vikt, avrundning till fyra decimaler (t.ex. 1,0021 g). Beteckna den erhållna vikt som "slutliga tuben vikt."
- Passera cecal innehåll proven i anaerob kammare för bakteriell uppräkning.
- Steril samlingen av mus avföring
- Bakteriell Räkning av C. difficile
- Beräkna den slutliga vikten av innehållet (avföring eller cekala) som kommer att räknas upp med avseende på C. difficile. Utfört detta genom att subtrahera "slutliga tuben vikt" från "röret vikten."
- Beräkna en 1:10 spädning av innehållet i 1X PBS och återsuspendera i enlighet därmed. För fekal pellets, använda pipettspetsen att försiktigt störa pelleten i lösning (se kompletterande filen "Exempel Beräkningar").
- Anaerobt inkubera dessa återsuspenderade proverna vid rumstemperatur i 30 minuter, vilket gör att innehållet att lösa.
- Gör seriespäd för varje prov i 1x PBS för enumbete av CFU per g innehåll (avföring eller cecal). Utför denna anaerobt.
- Med användning av aseptisk teknik, överföra 100 fil av varje serieutspädning till TCCFA plattor. Med hjälp av en steril L-formad spridare, sprida utspädning appliceras på media för att jämnt sprida den över plattan. Jämn spridning av utspädningen är väsentligt för noggrann räkning av kolonier.
- Inkubera plattorna anaerobt under 24 h vid 37 ° C. Vid denna tid, enumerate C. difficile kolonier för att erhålla den CFU per g Innehåll (feces eller cecal). C. difficile kolonier är platta och blekgul och har oregelbundna kanter och en slipad glas utseende 24.
OBS: Detta protokoll kan användas för att räkna C. difficile från andra murina GI innehåll, inklusive ileal och kolon innehåll. PCR-plattor kan användas för att göra serieutspädningar.
5. Vero cellcytotoxicitet Assay för att kvantifiera C. difficile Toxin Cytotoxistad
OBS: Det rekommenderas att denna analys utföras efter fullbordande av musmodell på prov som tagits vid obduktion och lagrades vid -80 ° C. Aseptiska cellodlingstekniker är väsentlig för att förhindra kontaminering av Vero-celler under denna analys. Detta protokoll tar 2 dagar att utföra. Alla avföring och tarminnehåll som utnyttjas i denna analys måste lagras i en vägd, sterilt mikrocentrifugrör (betecknas med "tube vikt," se avsnittet ovan). Den slutliga tuben vikt (inklusive innehållet) mäts via en analytisk skala till närmaste fyra decimaler (se avsnittet ovan). Användning av en flerkanalig pipett rekommenderas för denna analys.
OBS: Innan du börjar, se till att följande artiklar är tillgängliga: Vero-celler, Dulbeccos modifiering av Eagles medium (DMEM) 1x med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin media (betecknad som "DMEM 1x media, "se Material och kompletterande fil), 0,25%Trypsin-EDTA, 1 x PBS, 0,4% trypanblått, en 96-brunnars cellodlingsflatbottnad platta, en 96-brunnars filterplatta, Clostridium difficile Toxin A (alikvot i 3 | il vid 1 ug / ul i ultrarent vatten och förvara vid -80 ° C), Clostridium difficile antitoxin, ett kalkylblad (för beräkningar och platt kartor, se kompletterande filer).
OBS: Försiktighet bör iakttas under denna analys för personal exponering för C. difficile och dess toxin.
- Att dela upp de Vero-celler (dag 1)
- Förvärma DMEM 1x media, 0,25% Trypsin-EDTA och 1 x PBS i en 37 ° C vattenbad.
- Skaffa en kolv med Vero-celler från cellodlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2) och placera den i den sterila cellodlings laminärt flöde huva. Använd 70% etanol för att torka av huven och utrustning före användning. Med hjälp av en serologisk pipett, aspirera media från vävnadskultur kolv för att ta bort den från Vero-celler och kasta den i en avfalls container.
- Skölj de Vero-celler med 5 ml 1 x PBS (förvärmd) i vävnadsodlingskolv. Aspirera PBS och kassera den i en avfallsbehållare.
- Tillsätt 5 ml 0,25% trypsin-EDTA till vävnadsodlingskolv. Tillåta en kontakttid av 2 - 3 min. Under denna tid, observera cellerna börjar lossna kolvytan. Skaka vävnadskultur kolv sida till sida för att lossa Vero-celler.
- Efter kontakt tid med trypsin-EDTA, omedelbart tillsätt 5 ml DMEM 1x media i vävnadskultur kolv. Detta kommer att neutralisera Trypsin-EDTA. Använd denna lösning för att försiktigt tvätta alla obundna Vero-celler på baksidan av kolven. Använd sedan en serologisk pipett för att överföra denna blandning i en 15-ml koniska rör.
- Centrifugera Vero-celler i det koniska röret under 5 minuter vid 180 x g och 25 ° C. Se till att centrifugen är balanserad. Efter centrifugering, observera en synlig pellet av Vero-celler i botten av det koniska röret. Var noga med att inte DISRUPT denna pellet. Sug bort supernatanten från den koniska röret och kassera den.
- Resuspendera Vero-celler i 3 ml DMEM 1x medier.
- Räknar Vero-celler
- Tillsätt 100 pl av Vero cellsuspensionen (gjord i steg 5.1.7) till 100 | j, l av 0,4% trypanblått. Blanda försiktigt genom att pipettera lösningen upp och ner.
- Tillsätt 10 pl av denna blandning till varje kammare av en hemocytometer.
- Räkna antalet viabla celler inom de fyra kvadranter av hemocytometer. Döda Vero-celler tar upp trypanblått och därmed kommer att färgas blå (dessa celler ska inte räknas). Registrera dessa nummer i "Vero Cell Blad," under förutsättning.
- Summera det totala antalet livsdugliga Vero-celler i alla fyra kvadranter och beräkna genomsnittet. Multiplicera med spädningsfaktorn, vilket är 2 sedan 100 | il av celler är i totalt 200 | il av vätska.
- Multiplicera med korrektionsfaktorn för att ge "; antal celler / ml "När du använder en hemocytometer, är alltid 10 4 korrektionsfaktorn Multiplicera med den totala volymen för att ge." totala antalet celler "..
- Bestämmande av antalet brunnar som behövs för varje experiment
OBS: Ett enda prov (antingen avföring eller tarminnehåll) kräver 24 separata brunnar som ska utföras i två exemplar. En koncentration av 10 5 Vero-celler per brunn (total volym av 90 | j, l) krävs.
OBS: Om man önskar inkubera Vero cell 96-brunnars plattor över natten vid 37 ° C, en koncentration av 10 3 Vero-celler per brunn rekommenderas att ta hänsyn till den förlängda inkubationstiden. Beräkningar inom Vero Cell Blad skulle behöva justeras för att ta hänsyn till denna förändring.- Bestäm antalet brunnar som kan användas baserat på mängden av Vero-celler tillgängliga (från steg 5,2, använd Vero Cell Blad, förutsatt).
- Bestämma volymen avVero cellsuspensionen behövs för att fylla önskat antal brunnar (baserat på antalet prover som testas). Se till att alla extra volym läggs in på kontot för pipettering fel (använd den medföljande Vero Cell Blad).
- Späd Vero-cellsuspension (erhållen i Steg 5.1.7) i DMEM 1x media för att erhålla den volym som krävs för experimentet.
- Ympning Vero-celler i en 96-brunnars cellkulturplatta
- Med användning av Vero-cell resuspension från steg 5.3.2, använd en multikanalpipett för att lägga till 90 | il av den Vero cellsuspension till varje brunn i en 96-brunnars cellodlingsflatbottnad platta.
- Inkubera plattan med Vero-celler i en cellkultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 under ett minimum av 4 h före tillsats av toxin (prov) till brunnarna. Denna inkubationstid kommer att tillåta de Vero-celler att vidhäfta till botten av varje brunn.
- Skapa stamlösningar från Samples (Avföring ellerTarminnehållet)
OBS: Alla prover ska ha "rör vikt" och "slutliga tuben vikt" mäts via en analytisk skala. Använd Vero Cell Blad för beräkningar.- Beräkna vikten av innehållet. Konvertera g till mg, sedan mg till mikroliter. Beräkna det slutliga totala antalet il lösning behövs för att göra en 1:10 utspädning i 1x PBS. Beräkna den totala mängden 1x PBS för att lägga till provet.
- Lägga den totala volymen av 1 x PBS (beräknad ovan) till provet. Utför detta aerobt, och med hjälp av aseptisk teknik. För fekal pellets, använda spetsen på pipetten för att försiktigt störa pelleten i lösningen.
- Vortexa proverna och sedan centrifugera dem vid 3522 xg under 5 min vid rumstemperatur. Se till att centrifugen är balanserad. Var noga med att inte störa pelleten och återsuspendera provet i lösning.
OBS: Under steg 5.5.3, om endast ett fåtal prover bearbetas, innehåll kan steriliseras genompasserar dem genom en enda 0,22-pm filter istället för att använda en 96-brunnars filterplatta. Vissa prover kan kräva flera filter för att sterilisera hela volymen innehåll med denna teknik. - Sterilisera prov / PBS blandningen genom att ta 150 | il av supernatanten och placera den i separata brunnar på en 96-brunnars filterplatta. Placera filterplattan säkert på toppen av en 96-brunnars cellodlingsflatbottnad platta så att innehållet kommer att filtrera in i denna platta.
- Centrifugera filterplattan / cellodlingsplattstapel vid 431 xg under 5 min vid rumstemperatur. Se till att centrifugen är balanserad och att filterplattan / cellodlingsplatta stapeln tätt linje och kommer inte att flyttas under centrifugering.
OBS: Dessa filtrerade innehållet är 10 -1 lager som kommer att utnyttjas i utspädningsplattorna. - Placera plattan med filtrerade prover på is.
- Skapa Utspädnings Plate # 1
OBS: Späd Plate # 1 (DP # 1) kommer att kräva 6 brunnar per prov, inklusive positiva (C. difficile toxin A) och negativa (1x PBS) kontroller (se DP # 1 layout på Vero Cell Blad).- För att framställa den positiva kontrollen (C. difficile Toxin A) för denna analys, erhålla 3-l alikvoter (1 | ig / | il) från -80 ° C och tillsätt 297 | il av ultrarent vatten, vilket gav en slutlig koncentration av 0,01 ug / ul. Placera på is.
- Märk brunnarna med sina utspädningar (10 -1 till 10 -6) för varje prov och ange de positiva och negativa kontroller (se DP # 1 layout).
- Lägg lämpliga mängder 1x PBS till varje brunn. I 10 -1 brunnarna, lägger NO PBS. För 10 -2 till 10 -6 brunnar, tillsätt 90 pl 1 x PBS.
- Lägg lämpliga mängder av proverna till varje brunn. I de 10 -1 brunnarna, tillsätt 100 | il av 10 -1 lager för varje prov (se steg 5.5.7 från filter plate). För 10 -2 till 10 -6 brunnar, göra serieutspädningar; börja med att ta 10 ul från 10 -1 väl och lägga till den i 10 -2 väl. Fortsätta de serieutspädningar ut till 10 -6 utspädning.
- Täck DP # 1 platta med en klar plast självhäftande försegling och placera den på is.
- Skapa Späd Plate # 2
OBS: Späd Plate (DP # 2) kommer att kräva 2 körfält 6 brunnar för varje prov, inklusive positiva och negativa kontroller (se DP # 2 layout på Vero Cell Blad).- Märk brunnarna med sina utspädningar (10 -1 till 10 -6) för varje prov och ange de positiva och negativa kontroller (se DP # 2 layout). Märk brunnarna med provnamnet (betecknad som "provbrunnar") eller den kända ta prov med antitoxin (betecknad som "antitoxin brunnar").
- Beräkna mängden antitoxin som krävs för denna analys. OBS! Antitoxin är en 25x lagerlösning som måste spädas 1:25 i 1 x PBS. Placera beredd antitoxin 1x lösningen på is.
- För "provbrunnar," tillsätt 20 pl 1X PBS till varje brunn för alla utspädningar (10 -1 till 10 -6) i detta prov. För "antitoxin brunnar," tillsätt 20 pl 1x antitoxin till varje brunn för alla utspädningar (10 -1 till 10 6) av det provet.
- Transfer 20 pl av det utspädda provet i brunnar från DP # 1 i de utsedda brunnarna på DP # 2 för raderna 1 - 6 och raderna 7 - 12 (se DP # 2 layout på Vero Cell Blad). Blanda lösningen försiktigt genom pipettering upp och ned.
- Täcka DP # 2 med en klar plast självhäftande försegling och tillåta 40 min av inkubation vid rumstemperatur. Denna inkubation är att tillåta antitoxin för att binda och därigenom inaktivera och neutralisera C. difficile-toxin.
- Efter inkubation, tillsätt 10 pl blandning från DP # 2 till lämpliga Vero cellbrunnar (se Vero cellplattan layout på Vero Cell Blad). Blanda försiktigt lösningen genom att pipettera upp och ned, var noga med att inte störa de Vero-celler som är vidhäftade till den undre ytan av brunnarna.
- Inkubera Vero cellplattan över natten i en cellkultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Bedöm Vero celler för Avrundning använder ett ljusmikroskop (dag 2)
OBS: Minns att utspädningsfaktorn ändras med en faktor på 10 vid tillsats provblandningar till Vero-cellplattan (t.ex., 10 -3 är nu 10 -4). Brunnar som har antitoxin närvarande bör ha liten eller ingen Vero cell avrundning noterades. Vero cell avrundning (cytotoxicitet) kommer att noteras i prover som innehåller C. difficile-toxin. Om den cytotoxiska aktiviteten neutraliseras i en utspädning innehållande provet och antitoxin, är närvaron av C. difficile-toxin resulterade i Vero cellcytotoxicitet bekräftas.- Undersök för Vero cell avrundning med hjälp av en light mikroskop vid 200 gångers förstoring. För provbrunnar (inklusive den positiva kontrollen), spela utspädning av den brunn som är den sista att ha 80% Vero cell avrundning noterades.
- Beräkna cytotoxiska titer, som definieras som det reciproka värdet av den högsta utspädning som producerade 80% Vero cell avrundning per g prov. Till exempel, om den högsta utspädningen är 10 -5, då utspädningsfaktorn skulle vara 10 -6 för detta prov. Således, log [slutliga utspädningsfaktor] / g prov skulle log [10 6], vilket ger en ömsesidig titer av sex.
OBS: Vero-celler måste ha genomgått minst tre - 4 passager och högst 30 passager innan deras användning i denna analys 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under en representativ studie var 5 veckor gamla C57BL / 6 WT möss förbehandlade med cefoperazon i sitt dricksvatten (0,5 mg / ml) under 5 dagar och fick en 2-dagars tvätta ur med regelbunden dricksvatten. Möss utmanades med 10 5 sporer av C. difficile R20291 via oral sondmatning på dag 0 (Figur 1A). Möss övervakades för viktminskning och kliniska tecken (letargi, aptitlöshet, diarré, och krökt kroppshållning) av CDI under 14 dagar. Utmaningen av C57BL / 6 WT möss med C. difficile R20291 sporer ledde till diarré inom 24 timmar och betydande viktminskning inom 48 timmar efter utmaning (Figur 1B). Även om det inte observerats i detta experiment, kan möss utmanade med en högre dos av C. difficile R20291 bli allvarligt sjuka eller har större än 20% viktförlust efter 48-72 h efter utmaning, vilket sålunda nödvändiggör humana eutanasi. Därför möss kräver ett minimum av två gånger dagligenövervakning efter utmaning med C. difficile sporer.
I detta representativa studie var en betydande mängd av viktförlust och kliniska sjukdomstecken i möss observeras även på dagarna 2-7 efter utmaning (Figur 1B). Vid 7 dagar efter utmaning, började mössen att gå upp i vikt, och kliniska tecken på sjukdom avtagit. Genom den sista veckan av försöket visade mössen kliniskt normala, utan tecken på de kliniska tecknen på CDI, inklusive diarré.
Fekala pellets samlades före utmaningen med C. difficile sporer och varje 48 timmar efter utmaning (Figur 1C). Före antibiotikabehandling, möss inte koloniserats med C. difficile. Inom 24 timmar efter utmaning med C. difficile sporer möss koloniserade med 10 7 CFU av C. difficile per g av avföring (Figur 1C </ Strong>). Möss förblev ständigt koloniserade med C. difficile hela experimentet, trots inga tecken på viktminskning eller kliniska tecken på CDI under de senaste 7 dagarna av försöket.
Figur 1: cefoperazon behandlade mössen med C. difficile R20291 Exhibit viktminskning och koloniserade med C. difficile. A) 5-veckor gamla C57BL / 6 WT JAX möss (n = 3M / 3F per grupp) förbehandlades med cefoperazon i sitt dricksvatten (0,5 mg / ml) under 5 dagar och fick en 2-dagars tvätta ur med regelbunden drickande vatten. Möss utmanades med 10 5 sporer av C. difficile R20291 via oral sondmatning dag 0. Mössen övervakades för viktminskning och kliniska tecken (letargi, aptitlöshet, diarré, och krökt kroppshållning) av CDI under 14 dagar. Avföring samlades och användes för bakteriell uppräkning före start cefoperazon, omedelbart after efterbehandling antibiotikumet, och på dagarna 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, och 14 under hela infektion. Obduktion utfördes på dag 0, 2, 4, 7 och 14. B) Mössen förlorade en betydande del av sin baseline vikt efter utmaning med C. difficile R20291. Den genomsnittliga kroppsvikt av möss mättes dagligen från dag 0. Betydande viktminskning sågs på dagar 2 till och med 7 i jämförelse med dag 0, baslinjen vikt. C) C. difficile R20291 bakteriehalten i avföringen efter utmaningen. Inom 24 timmar efter utmaningen med C. difficile sporer har alla möss koloniserade med 10 7 CFU (kolonibildande enheter) per gram avföring. Inga signifikanta skillnader i dessa parametrar sågs mellan honor och hanar. Signifikans bestämdes genom icke-parametriska Kruskal-Wallis envägs-ANOVA-test följt av Dunns posttest (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001; ****, p Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fyra möss (2 hanar och 2 honor) var humant avlivades och bereddes för nekropsi på dag 0, före infektion, för att tjäna som oinfekterade kontroller. Dessutom var en mus från varje bur humant avlivades och preparerades för nekropsi på dag 2, 4, 7 och 14 efter utmaning (Figur 1A). Räkning av C. difficile i cecal innehåll utfördes vid varje obduktion. I överensstämmelse med fekal uppräkning, ingen C. difficile detekteras i cecal innehållet i möss före utmaningen med C. difficile. Vid 48 h efter utmaning möss koloniserade med ca 10 8 CFU av C. difficile per g cecal innehåll (Figur2A). Alla möss förblev envist koloniserat hela experimentet.
Cecal innehåll bedömdes också genom hela infektionen med avseende på närvaron av C. difficile-toxin med användning av Vero-cell cytotoxicitetsanalysen. Inga tecken på C. difficile toxin cytotoxicitet upptäcktes i cekala innehåll före utmaningen (Figur 2B). C. difficile-cytotoxicitet detekterades 2 dagar efter utmaning med C. difficile-sporer och kvarstod under hela infektionen. Trots tämligen likformig kolonisering med C. difficile, är variationen i nivåerna av C. difficile cytotoxisk aktivitet uppenbar i individuella möss (Figur 2B).
Majoriteten av mus cecal innehåll neutraliserades med C. difficile antitoxin under Vero cell cytotoxicitet och hade inga tecken på cytotoxicitet (Vero cell avrundning) i späd utförda. Men några enskilda möss, trots att testa om, hade bevis på 50-100% cytotoxicitet i 10 -1 utspädning (utspädning där provet är mest koncentrerade), utan några tecken på Vero cell avrundning på de andra utspädningar. Den antitoxin som används i denna analys är en neutraliserande polyklonal antikropp mot C. difficile-toxin, framställd i getter 27. Därför kan denna antitoxin inte neutralisera C. difficile binära toxin som produceras av stammen R20291. Emellertid är C. difficile binära toxin inte vara cytotoxiskt 10. Överdriven C. difficile toxin inte neutraliseras av antitoxin eller närvaron av andra cytotoxiska läkemedel andra än C. difficile toxin skulle kunna bidra till detta konstaterande. Denna observation påverkade inte bestämningen av cytotoxicitet titern för dessa prover, eftersom varje provs sista utspädningen med 80% Vero cell avrundning hadeinga tecken på cytotoxicitet när de kombineras med antitoxin vid den angivna utspädningen.
Figur 2: Kolonisering av blindtarmen och Cytotoxicitet under Infektion med C. difficile R20291. A) Möss ceca förblev ständigt koloniserade med C. difficile hela experimentet, trots att de kliniska tecknen och observerade viktökning. Samtliga möss koloniserade med större än 10 8 CFU per g av cekala innehåll när bedöms vid 2 dagar efter utmaning. B) Vero-cells cytotoxicitetsanalysen från cecal innehåll hela infektion med C. difficile R20291. Efter utmaning med C. difficile sporer möss hade betydande nivåer av cytotoxicitet, mätt i log 10 reciprok utspädning av toxin per g cecal innehåll på dagarna 2, 4 och 7 efter utmaning jämfört med dag 0 (medianer represented av linjen). Signifikans bestämdes genom icke-parametriska Kruskal-Wallis envägs-ANOVA-test följt av Dunns posttest (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001 ). Felstaplar representerar standardavvikelser från medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det rekommenderas att histologisk utvärdering utförs av en styrelse-certifierad veterinär patolog på en blindad sätt. För vävnads poäng, bör en 0-4 numerisk poängsystem användas för att separat bedöma ödem, inflammatorisk cellinfiltration, och epitelcellskada i ileum, blindtarmen och tjocktarmen baserad på en tidigare publicerad scoring system 17.
Upon blindad histopatologiska tentaaminering av den murina ileum, blindtarmen och kolon efter utmaning med C. difficile R20291, var de mest signifikanta patologiska förändringar noterades i blindtarmen (Figur 3). De totala cekala histologiska poäng var signifikant mellan dag 0 och dag 2 och 4 efter utmaning. Inga signifikanta skador noterades i ileum genom infektion (Figur 3). Mildare lesioner noterades i tjocktarmen. De totala colonic histologiska poäng var signifikant olika mellan dag 0 och dag 2 och 7 efter utmaning (fig 3).
Representant H & E delar av ileum, blindtarmen och tjocktarmen hela infektion finns i figur 4. Varje bild har sin respektive total histologiska poäng och poängen för epitelial skada, inflammation och ödem, som bestäms av en blindad styrelse-certifierad veterinär patolog ( SAM).
Figur 3: Histologisk Scoring av Murina ileum, blindtarmen och kolon under infektion med C. difficile R20291. Totalt histologiska poäng beräknades genom att lägga alla tre poäng från de parametrar som bedöms: epitelskada, inflammation och ödem. Inga väsentliga histopatologiska förändringar noterades i ileum hela infektionen. Cecal vävnad innehöll de viktigaste histologiska lesioner under CDI. De totala cekala histologiska poäng var signifikant skilda från dag 0 på dag 2 och 4 efter utmaning. Mildare lesioner noterades i tjocktarmen. De totala colonic histologiska poäng var signifikant skilda från dag 0 på dag 2 och 7 efter utmaning. Signifikans bestämdes genom icke-parametriska Kruskal-Wallis envägs-ANOVA-test följt av Dunns posttest (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p804; 0,001; ****, P ≤ 0,0001). Felstaplar representerar standardavvikelser från medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histopatologi Under Infektion med C. difficile R20291. Denna panel innehåller representativa H & E delar av ileum, blindtarmen och tjocktarmen hela infektion med C. difficile R20291. De totala histologiska poäng är inom parentes () för motsvarande dag och vävnad listan: för ileum dag 0 (0), dag 2 (1), dag 4 (0), dag 7 (0) och dag 14 (0) ; för blindtarmen dag 0 (0), dag 2 (5), dag 4 (4), dag 7 (3), och dag 14 (3); och för kolon dag 0 (0), dag 2 (4), dag 4 (1), dag 7 (4), och dag 14 (2). Mikrofotografier erhölls på en ljus mikroskope med en 5 megapixelkamera och dess medföljande programvara (skalan stapeln representerar 200 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| 1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
- Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
- Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
- Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
- Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
- Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
- Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
- Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
- Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
- Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
- Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
- Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
- Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
- He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
- Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
- Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
- Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
- Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
- Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
- Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
- Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).
