Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Summary

Dit protocol beschrijft hoe de expressie van een groot scala van genen op het klonale niveau te beoordelen. Single-cell RT-qPCR levert zeer betrouwbare resultaten met een sterke gevoeligheid voor honderden monsters en genen.

Abstract

Genexpressie heterogeniteit is een interessante functie om te onderzoeken in lymfoïde populaties. Genexpressie in deze cellen varieert gedurende celactivering, stress of stimulatie. Eencellige multiplex genexpressie gelijktijdige beoordeling van tientallen genen ^{1, 2, 3.} Bij de single-cell niveau, multiplex genexpressie bepaalt bevolking heterogeniteit ^{4, 5.} Het maakt het onderscheid van de bevolking door heterogeniteit om zowel de waarschijnlijke precursor mengsel van verschillende stadia bij rijpe cellen en ook de diversiteit van cel responsen op stimuli.

Aangeboren lymfoïde cellen (ILC) zijn recent beschreven als een populatie van aangeboren effectoren van het immuunrespons ^{6, 7.} In dit protocol, cel heterogeniteit van de ILC hijpatic compartiment is onderzocht tijdens homeostase.

Momenteel is de meest gebruikte techniek om genexpressie te beoordelen is RT-qPCR. Deze methode maatregelen genexpressie slechts één gen per keer. Bovendien kan deze methode niet inschatten heterogeniteit van genexpressie, aangezien meerdere cellen zijn nodig voor één test. Dit leidt tot de meting van de gemiddelde genexpressie van de bevolking. Bij de beoordeling van een groot aantal genen, RT-qPCR wordt een tijd-, reagens- en-sample in beslag methode. Vandaar dat de trade-offs beperking van het aantal genen of celpopulaties die kunnen worden geëvalueerd, waardoor het risico van het missen van de globale beeld.

Dit manuscript beschrijft hoe ééncellige multiplex RT-qPCR kan worden gebruikt om deze beperkingen te overwinnen. Deze techniek heeft geprofiteerd van de recente technologische vooruitgang microfluidics ^{1, 2.} Reacties die zich in multiplex RT-qPCR chips niet exceed de nanoliter-niveau. Derhalve eencellige genexpressie, en gelijktijdige meervoudige genexpressie, kan worden uitgevoerd in een reagens-, bemonster- en kosteneffectieve manier. Het is mogelijk om cellen genen profiel heterogeniteit testen op klonale niveau tussen celsubsets binnen een populatie in verschillende ontwikkelingsstadia of onder verschillende omstandigheden ^{4, 5.} Aan zeldzame populaties met een groot aantal omstandigheden op de single-cell niveau niet langer een beperking.

Introduction

In de afgelopen jaren, aangeboren lymfoïde cellen (ILC) in toenemende mate onderzocht. Ondanks het ontbreken van antigeen-specifieke receptoren, zij behoren tot de lymfoïde afstamming en vormen belangrijke wachters voor weefsel homeostase en ontsteking. ILC's worden momenteel onderverdeeld in drie groepen op basis van hun expressie van specifieke transcriptiefactor en combinaties van hun vermogen om cytokinen ^{6, 7} produceren.

ILC tot talrijke homeostatische en pathofysiologische situaties in diverse organen via specifieke cytokineproductie ^{8, 9.} Om de rol van deze cellen te begrijpen, is het belangrijk om de verschillende subpopulaties ILC per orgaan bepalen en hun ontwikkeling relaties aan te geven. Bovendien zijn verschijnselen plasticiteit tussen de verschillende subgroepen gerelateerd. Door het bestuderen van de heterogeniteitvan de onderhavige in een orgaan cellen, is het mogelijk om het stadium van rijping te bepalen en hun specifieke functies te onderscheiden.

Om de techniek van single-cell multiplex RT-qPCR te illustreren, werden de lever ILC gekozen, met een bijzondere nadruk op de heterogeniteit binnen dezelfde ILC groep (type 1 ILC) ^10. Enerzijds door middel van flowcytometrie, werden drie verschillende populaties ILC kenmerk in de lever. Groep 1 ILC vertegenwoordigt ongeveer 80% van het aangeboren effectoren, terwijl de twee andere populaties zeldzame hepatische ILC populatie (minder dan 5% van het aangeboren effectoren). Die populaties werden gesorteerd met behulp van algemeen voor het celoppervlak markers van ILC populaties. Hierdoor gesorteerd ILC populaties in de lever kijken grote lijnen gelijk aan elkaar.

Eencellige multiplex RT-qPCR heeft ontpopt als een van de beste technieken om onmiddellijk een onderzoek in de heterogeniteit van deze populaties ¹¹

Vervolgens sorteert alle cellen met een globaal ILC fenotype, een breed overzicht van de meervoudige genexpressie van de lever ILC populaties wordt verkregen, hoewel ze vertegenwoordigen uiterst zeldzaam populaties. A-microfluïdische gebaseerde chip maakt het mogelijk experimenteren met nogeen kleine hoeveelheid celmateriaal. Bijgevolg kan de genexpressieprofielen van zeldzame celpopulaties worden verkregen. Met behulp van online gen handtekening analyse software, mobiele bevolking clusters en potentiële cel relaties kunnen worden onderzocht. Bijgevolg kunnen functionele tests worden uitgevoerd om de clustering gegevens op in vivo niveau valideren.

Tientallen genexpressies kunnen gelijktijdig worden beoordeeld op honderden of meerdere elementaire cellen op dezelfde chip ^{3, 11, 12.} Uitvoering van de test is het langste en belangrijkste deel van het experiment. De bepaling van de genen voor de hypothese relevant beproeven essentieel om relevante resultaten te verkrijgen. Ten tweede, interne controle (zoals bekend oppervlaktemerkers gebruikt voor sorteren) en specifieke controles nodig. Dit is belangrijk om de primer amplificatie specificiteit, de efficiëntie van de amplificatie en t testenHij afwezigheid van primer concurrentie. Daarom werken met eencellige multiplex RT-qPCR is een tijdbesparende techniek als meervoudige genexpressie van een cel wordt beoordeeld tegelijkertijd.

Met dezelfde chip en mengeling van reagentia voor alle cellen beperkt de mogelijke fouten van manipulatie en maakt reproduceerbaarheid tussen monsters. Geheel, de verschillende aspecten van eencellige multiplex RT-qPCR maakt de productie van zeer betrouwbare resultaten op klonale niveau met een grote mate van gevoeligheid voor diverse monsters en genen. De behaalde resultaten bieden krachtige en betrouwbare gegevens voor biostatistical testen.

Dit kan worden bereikt door de microfluïdische aspect van de methode, waarmee het werk aan zeer kleine hoeveelheden materiaal en leidt tot uitgebreide gegevens. Bovendien zullen, met online software, is het mogelijk om de gewenste populaties vergelijken.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Pasteur Instituut commissie Veiligheid in overeenstemming met het Franse Ministerie van Landbouw en de EU-richtlijnen.

1. Maak een 96-well Single-cell sorteren Plate

1. Bereid voorversterking mix in een 1,5 ml buis door het toevoegen van 5,0 pi specifieke retro-transcriptie buffer, 1,3 pl lage ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) TE-buffer (10 mM TE, pH 8, en 0,1 mM EDTA oplossing, 0,2 uM gefiltreerd ) en 0,2 pi Taq DNA polymerase per putje (figuur 1a).
2. Op een 96-well plaat, verdelen 6,5 ul voorversterking mengsel in elk putje (maximaal 48 putjes). Deze plaat is de 96-well eencellige sorteren plaat.
   OPMERKING: Met behulp van een elektronische pipet wordt aanbevolen voor dit protocol. Het zorgt voor nauwkeurige en reproduceerbare volumemetingen en bespaart tijd.

(A) In de 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat, wordt de pre-amplificatie mengsel eerst verdeeld, gevolgd door 0,2 x analysemengsel. (B) Het verslag van elke single-cell positie moet op een spreadsheet worden gehouden. Een goed zonder cel een "geen invoer" goed genoemd en kan worden gebruikt als een controle. Twee rijen kunnen worden gespaard om primer efficiëntie cDNA verdunning (sequentieel één op de tien verdunningen van het equivalent van 10 ⁵ cellen tot één cel) te controleren. (C) Op de 96-well assay plaat, wordt de test laden reagens eerst verdeeld, gevolgd door de toevoeging van de primers. Vergeet niet om een ​​lay-out van elke primer positie te houden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bereid een 0,2 x testmengsel in een 1,5 ml buis door het toevoegen van 1,4 pi van elke primer (primers 20x, maximaal 48 verschillende probes; zie Tabel 1). Pas het uiteindelijke volume tot 140 ul met lage EDTA TE-buffer.
4. Verdeel 2,5 ui van het 0,2x analysemengsel de 48 putjes in 96-well enkelvoudige celsortering plaat met de voorversterking mix.
   Opmerking: Het eindvolume in elk putje van de 96-well plaat monster moet 9 pl.
5. Seal de plaat met een cover film. Vortex de plaat en draai het neer op 280 xg gedurende 45 sec. Bewaar de 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat bij -20 ° C en gebruik ze onmiddellijk.

2. Single Cell Dissociatie

1. Met een CO ₂ afgiftesysteem, euthanaseren een muis door hypoxie. Bevestig de muis op een dissectie bord en open de buikholte in de lengte met een schaar.
2. Recover ILC's uit de lever.
   1. Voorafgaand aan de lever isolement, flush het liver-circulerende cellen.
      1. Om de poortader uit te brengen, bewegen de dunne en de dikke darm naar de linkerkant van de muis; de poortader wordt de grootste ader in de peritoneale holte.
      2. Met een 10 ml spuit en 0,45 mm naald Spoel de lever met fosfaatgebufferde zoutoplossing medium (PBS) door de poortader. Om lever blozen te vergemakkelijken, snijd de maag slagader met een schaar.
      3. De galblaas, knijpt de basis van de galblaas met een tang en scheiden van de lever met een schaar.
      4. Naar de lever te isoleren, knijpt de basis van de lever met een tang en met een schaar, scheiden van de lever van de rest van de peritoneale holte.
      5. Breng de lever in een potter buis met 5 ml Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 2% foetaal kalfsserum (FCS).
3. Distantiëren de lever met een monteur dissociatie met behulp van een stamper. Breng het medium om een ​​15 ml buis. Breng het totale volumetot 14 ml met RPMI 2% FCS. Laat de celsuspensie op ijs gedurende 15-20 minuten naar de hepatocyten decanteren.
4. Herstel de supernatant (zonder hepatocyten) in een nieuwe 15 ml buis met een 1 ml pipet (12 ml supernatant kan worden verwacht). Spin neer op 120 xg gedurende 7 minuten bij 10 ° C. Verwijder het supernatant na centrifugeren.
5. Resuspendeer de pellet verkregen in stap 2.4 in 14 ml dichtheidsgradiënt medium (bijvoorbeeld 40% Percoll). Spin neer op 600 xg gedurende 20 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant door afzuigen.
6. Resuspendeer de pellet in 1 ml kaliumacetaat (ACK). Reactie bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Na 1 min, komt het totale volume op 14 ml Hank's gebalanceerde Gezouten Solution (HBSS) 2% FCS. Spin neer op 120 xg gedurende 7 minuten bij 10 ° C. Verwijder het supernatant.
7. Vlekken op de cellen.
   1. Resuspendeer de pellet in 300 pi van gebiotinyleerd antilichaam mix (zie de tabel Materials; voeg alle gebiotinyleerde antilichamen noemened) en breng de cellen in 1,5 ml buis. Laat het in het donker gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
   2. Breng het totale volume tot 1 ml met HBSS 2% FCS. Spin neer op 120 xg gedurende 7 minuten bij 10 ° C. Resuspendeer de pellet in 300 ul-fluorochroom gekoppeld antilichaam mix en fluorochroom-geconjugeerde streptavidine (zie de tabel Materials; voeg alle fluorochroom-gekoppelde antilichamen genoemd). Laat het in het donker gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
8. Breng het totale volume tot 1 ml met HBSS 2% FCS. Spin neer op 120 xg gedurende 7 minuten bij 10 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet 1 ml. Resuspendeer de pellet in 1 ml HBSS en propidiumjodide (PI; 1: 4000).
   LET OP: Bij gebruik van de algemeen voor ILC celoppervlak markers, worden 3 populaties gedefinieerd: NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, NKp46 ⁺ IL-7Rα ⁺ en NKp46 ^- IL-7Rα ^+. Alle populaties worden naargelang afkomst ^- CD3 ^- CD4 ^- CD45.2 ^+.

3. Single-cell fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)

1. Gebruik FACS om enkele cellen ¹³ sorteren.
   OPMERKING: Verschillende celtypen kunnen worden gesorteerd op dezelfde 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat (figuur 2).
   1. Gebruik FACS sorteren naar één cel per putje dat de 0,2x analysemengsel en de pre-amplificatie mengsel op 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat. Gebruik een vers bereide 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat of ontdooien indien bewaard bij -20 ° C.
      1. Zet een verzegelde 96-well plaat op de FACS plaat houder. Met een lege 96-well plaat als test. Plaats de plaat met de A1-well links en naar de experimentator.
      2. Stel de plaathouder een daling in het midden van het A1-wells met controle kralen te verkrijgen.
      3. Herhaal stap 3.1.1.2 met alle putten in lijn A.
      4. Verwijder de afdichting van de 96-putjesplaat en sorteer 100 controle korrels per putje. Controleer op dvorming rop in het midden van de putten.
      5. Bij goed afgesteld, plaatst u de 96-well eencellige sorteren plaat op de plaathouder. Teken de plaat lay-out en sorteren 1 cel per putje.
         OPMERKING: De juiste positionering van elke cel op de 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat essentieel. Een plaat lay-out moet op een spreadsheet-software worden gehouden. De plaatindeling wordt gebruikt in de volgende verschillende stappen (figuur 1b) ^14. Laat één putje met 0,2x assay mix en pre-amplificatie mix van de 96-well steekproefplaat zonder cellen. Dit wordt gebruikt en een niet-invoerbesturingselement. Laat twee rijen 6 putjes een cDNA verdunning. Deze putten worden gebruikt als controles voor primer efficiëntie (Figuur 1b).
      6. Bewaar de 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat bij -20 ° C en gebruik ze onmiddellijk.

4. Pre-amplificatie

1. Gebruik een vers of ontdooide 96-well eencellige sorteren plaat obtained in stap 3.1.1.6. Vortex de plaat en draai het naar beneden (280 g gedurende 45 sec).
2. Plaats de 96-well eencellige sorteren plaat op de thermocycler. Voeren reverse transcriptie en voorversterking volgens het genoemde programma in figuur 3 en tabel 2.

Figuur 3: Pre-amplificatie programma. Om voldoende materiaal heeft, wordt pre-amplificatie van specifieke doelgenen op gesorteerde enkele cellen vereist. De 96-well enkelvoudige celsortering plaat wordt geladen op een thermocycler voor de pre-amplificatie te volgen. De pre-amplificatieproducten worden verdund met lage EDTA TE-buffer en kan direct worden gebruikt of ingevroren bij -20 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Verdun de voorversterkerlified monsters door het toevoegen van 36 pi van lage EDTA TE buffer in elk putje.
4. Seal de plaat met een cover film. Vortex de plaat en draai het naar beneden (280 g gedurende 45 sec). Bewaar de voorversterkte, 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat bij -20 ° C en gebruik ze onmiddellijk.

5. Bereid een 96-well Sample Plate

1. Bereid 191 pi master mix door het toevoegen van 175 pi van qPCR master mix en 17,5 pl monster laden reagens.
2. Een nieuwe 96-well plaat, distribueren 3,6 pi Master Mix van elke well (maximaal 48 putjes). Dit is de 96-well plaat sample.
3. Transfer 2,9 pi pre-geamplificeerde cDNA van de 96-well monsterplaat de nieuwe 96-well plaat. Houd dezelfde positie voor elk monster tussen de 96-single celsortering plaat en de 96-well sample plaat.
4. Seal de plaat met een cover film. Vortex de plaat en draai het naar beneden (280 g gedurende 45 sec). Plaats de nieuwe 96-well plaat op ijs beschermd tegen licht. Bewaar de 96-well sruime plaat bij -20 ° C of gebruik het onmiddellijk.

6. Bereid een 96-well Assay Plate

1. Een nieuwe 96-well plaat, distribueren 3 pl assay geladen reagens in elk putje (maximaal 48 putjes). Deze plaat is de 96-well assay plaat genoemd.
2. Voeg 3 ul van primers aan elke well. Houd een indeling op een spreadsheet software (figuur 1c en Tabel 1, gebruik maken van alle primers in tabel 1 vermeld). De juiste positionering van elke primer op de 96-well assay plaat is essentieel voor de komende stappen.
   1. Indien het aantal monsters is dan 48, voeg water in plaats van primers ongebruikte wells.
3. Seal de plaat met een cover film. Vortex de plaat en draai het naar beneden (280 g gedurende 45 sec). Bewaar de 96-well assay plaat bij -20 ° C en gebruik ze onmiddellijk.
   OPMERKING: herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van de primers voor de 96-wel vermijden distribueren primers voor voorversterking en mixl testplaat tegelijk.

7. Single-cell gen-expressie Chip

1. Plaats de geïntegreerde microfluïdische schakeling (IFC) op de bank en controleer de kleppen met behulp van de afgetopte spuit. Open de spuit, plaats deze loodrecht op de klep, en druk stevig. De O-ring moet bewegen. Vul de chip met controle lijn vloeistof (0,3 ml tuberculine).
2. Herhaal stap 7.1 met de tweede klep.
   LET OP: geen vloeistof moet worden gemorst over de chip.
3. Verwijder de blauwe film van de bodem van de chip. Laad de chip in de IFC controller. Op de controller scherm IFC, selecteer "PRIME" en vervolgens op "RUN." De regeling van de microfluïdische lijnen duren 10 minuten.
4. Werp de chip en opnieuw afdichten van de blauwe folie aan de onderzijde van de chip.

Figuur 4: Single-cell multiplex genexpressie chip laden. Deze stappen vereisen great precisie, vooral tijdens de overdracht van de 96-well plaat om de eencellige multiplex genexpressie chip. Om het laden fouten en misplaatsingen te voorkomen, wordt het sterk aanbevolen om na elkaar te werken. Het volume genomen voor elke overdracht moet worden gecontroleerd tijdens het pipetteren proces. Tenslotte is het belangrijk om luchtbellen te vermijden en om ze bij formatie te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Onder toepassing van een 8-kanaals Pipetteer 5 ul van de 96-well assay plaat aan de zijde A1 (links) van de chip. Vul de linkerkant van de chip, zoals in figuur 4. Wees voorzichtig om altijd hetzelfde volume in de tips te trekken.
   1. Niet bellen creëren. Als er bellen verschijnen, verwijder ze met behulp van 10 pi tips. tips verandering voor elk putje van de chip.
6. Herhaal stap 7,5 rechts of de chip met behulp van 5 pl van de 96-well sample plaat.
7. Verwijder de blauwe film van de bodem van de chip. Laad de chip in de IFC controller. Op de controller scherm IFC, selecteer "Script" en vervolgens op "RUN." Het laden van de microfluïdische lijnen duurt 45 min.
8. Werp de chip en opnieuw afdichten van de blauwe folie aan de onderzijde van de chip.

8. Voer de Chip

1. Op de microfluïdische qPCR computer, selecteert u de "Data Collection" software. Zodra het begint, selecteer "Nieuwe Run."
2. Selecteer "uitwerpen," verwijder de blauwe film van de bodem van de chip, en laadt de chip. Plaats de chip A1 gezond worden links en naar de experimentator.
3. On "Project instelling," selecteert u "Geen" en vervolgens op "Next."
4. Selecteer "Nieuwe chip run ',' Nieuwe chip directory" (maak een map voor het experiment), en "Next."
5. On "genexpressie" te selecteren "; Passief reference = ROX '(carboxy-x-rhodamine) en' Single probe, "selecteer de juiste filter volgens de primers selecteren." Next ".
6. Selecteer "Bladeren" en selecteer het juiste programma op basis van de gebruikte primers.
   LET OP: "Default-10min-Hotstart.pcl" is de meest gebruikte programma voor het single-cell multiplex RT-qPCR.
7. Selecteer "Start Run". De reactie duurt ongeveer 90 minuten.
8. Eenmaal klaar, selecteer "Eject-Done."

9. Data Analysis

1. Open de "real-time PCR-analyse" software, selecteer "File" en "Open", zoek de map experiment, en kies "ChipRun.bml bestand."
2. Klik op "Analysis View ',' Resultaten Tabel 'en' Heat kaart;" dozen gemarkeerd met een "X" zijn onder de drempel detectie-niveau en / of had slechte versterking curves.
3. Noem de monsters. Ga naar "Sample Setup" en select "Nieuwe SBS 96." Klik op "Mapping" en selecteer "..." Kopieer en plak de steekproef lay-out ontwerp van de spreadsheet-software. Definieer de geplakte layout als "Sample Naam."
4. Noem de testen. Herhaal stap 9.3 met de primer namen in "Detector Setup." Definieer de geplakte layout als "Detector Naam."
5. Klik op "Analyse view" en "te analyseren;" het monster en primer krijgen automatisch toegekend aan de monsters en primers (Figuur 7).
6. Bereken Ct, Delta Ct en Fold Change voor elk monster. Gebruik een housekeeping gen als een interne controle (hier, GAPDH):
   ACt = Ct _sample - Ct _{interne controle}
   Vouw Change = 2 ^{- (ΔCtsample-ΔCtnegative control)}
   1. Klik op "Detector Setup" en selecteer het goed met geen input controle (gebruik de huishoud-gen als een interne controle om genexpressie te normaliseren). Selecteer "Editor, "" te definiëren referentie, "en" Update. "
   2. Selecteer alle putjes waaraan de hierboven gedefinieerde interne controle wordt toegepast. Selecteer "Editor" en "te definiëren als Test." Kies een geschikte referentie-gen en klik op "Update."
   3. Selecteer "Sample Setup" om de negatieve controle goed te selecteren. Selecteer "Editor" en definieer "Reference." Klik op "Update."
   4. Selecteer "Analysis View" en "te analyseren;" de Delta Ct en Fold Change wordt automatisch berekend.
7. De gegevens exporteren. Selecteer "File" en "Export, opslaan als" Table Resultaten, "selecteert u de doelmap en klik op" Save "en" Exit. "
8. Herhaal stap 9.7, maar in plaats van "Table Resultaten," Opslaan als "HeatMap resultaten."

Representative Results

Lymfoïde populatie weer grote diversiteit in genexpressie. In dit protocol, werd de lever ILC compartiment heterogeniteit onderzocht met behulp van single-cell multiplex RT-qPCR genexpressie. In tegenstelling tot andere genexpressie technieken eencellige multiplex RT-qPCR genexpressie laat werken op verschillende populaties, zelfs de meest zeldzame, tegelijkertijd. Deze specificiteit in combinatie met een hoge gevoeligheid op klonale niveau maakt het onderzoek van verschillen in gen handtekeningen in een populatie en tussen populaties zeldzame. Als voorbeeld werd het gen handtekeningen van 3 ILC populaties uit de lever van 4-weken oude muizen geëvalueerd. Één populatie frequent genoeg om gemakkelijk te worden geïdentificeerd, terwijl de twee andere zijn zeldzaam (minder dan 1% van lineage-negatieve cellen) in de lever.

Een 96 putjes enkelvoudige celsortering plaat en een 96-well assay plaat werden vóór lever dissectio voorbereidn en dissociatie (figuur 1). Elke mix werd opgesteld onder een steriele kap en gedistribueerd met een elektronische pipet voor volume precisie en reproduceerbaarheid. Alle reagentia werden gevortext voor pipetteren om de homogeniteit te handhaven. Na klaarmaken kan de 96-well celsortering plaat worden bevroren tot celsortering, en de 96-well cell assay plaat kan worden bevroren tot IFC laden.

Levers werden ontleed en gedissocieerd in single-cell suspensies. De cellen werden gekleurd en gesorteerd op ontdooid 96-well eencellige sorteren platen. Middels FACS, werden 3 ILC populaties gesorteerd volgens algemeen voor ILC markers (figuur 2). Na celsortering werd cDNA gesynthetiseerd en specifieke doelgenen werden geamplificeerd (Figuur 3 en Tabel 2). Na de pre-amplificatie stap werd cDNA verdund in laag EDTA TE-buffer. Primers en cDNA uit enkele cellen werden geladen op de IFC-chip (Fifiguren 4 en 5a). De verkregen resultaten (figuur 7a) werden vereenvoudigd voor een betere leesbaarheid en analyse (figuur 7b). Voorbeelden van juiste of onjuiste geplaatst chips worden getoond (Figuur 5). Een FAM figuur van een goed geladen chip (Figuur 6) met verschillende versterking signalen wordt getoond.

De resultaten tonen aan dat na een goede celsortering, voorversterking en lading, de ILC populatie lijkt heterogeen zijn voor genexpressie in de lever van volwassen wild-type muizen (Figuur 7). Met behulp van online software celspecifieke genexpressie handtekeningen (figuren 7 en 8) en celpopulatie verhoudingen (figuur 8) kan worden geïdentificeerd. Elke gesorteerde populatie een bepaald gen handtekening verrijkt in genexpressie. Bijvoorbeeld, cellen gesorteerd als NKp46 ^- IL-7Rα ⁺ hebben enriched uitdrukking van RORC, de belangrijkste transcriptiefactor van groep 3 ILC; Rora, een RORC -homologous transcriptiefactor; en Il-23R en Cxcr6, twee belangrijke receptoren van groep 3 ILC hepatische merkers in de lever. Dezelfde waarnemingen kan worden gemaakt met NKp46 ⁺ IL-7Rα ^- en NKp46 ⁺ IL-7Rα ⁺ populaties. Elke cel wordt gecontroleerd voor het huishouden genexpressie (Hprt, Act, en GAPDH) ongeldig putten uit te sluiten; ten minste twee housekeeping genen moeten worden opgegeven waarden beschouwen als geldig.

Interessant is dat deze techniek zorgt voor het definiëren van twee subpopulaties van NKp46 ⁺ IL-7Rα ^- op basis van genen handtekeningen. Verschillen tussen deze twee handtekeningen worden bevestigd door andere reeksen verschillende functionele experimenten.

Figuur 2: FACS cel strategie. Beelden zijn representatief geïsoleerde levercellen van 4-weken oude muizen. (A) FSC-A / SSC-A gating, (b) FSC-H / FSC-W doublet discriminatie (c, d en e) leven, lineage-negatieve CD45.2 ⁺ CD4 ^- CD3 ^- cellen gating. (F) Met behulp van algemeen voor ILC celoppervlak markers, definieerden we 3 populaties: NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, NKp46 ⁺ IL-7Rα ⁺ en NKp46 ^- IL-7Rα ^+. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: ROX cijfers op de juiste manier (een) En onjuist (b) geladen chips. (A) goed geladen eencellige multiplex genexpressie chip zou moeten verschijnen met rechte lijnen en rijen. Elke reactiekamer wordt gevuld en heeft dezelfde afmeting. (B) verkeerd geplaatst eencellige multiplex gen-expressie chip. Lege lijnen en rijen van reactiekamers verschijnen (groen vierkant), evenals buiglijnen (blauw vierkant). Deze functies kunnen als gevolg van onjuiste "PRIME" of "LOAD" stappen, en om resterend bellen in het IFC putjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: FAM (Fluoresceïne amidiet) figuur van een goed geladen chip. Na enkele cycli (afhankelijk van de monsters en de primer s getoetst), moeten de verschillen in reactie helderheid kamer verschijnen. Reactiekamers met een versterking signaal moet verschijnen helderder (blauw vierkant) dan reactiekamers met geen of lage versterking signalen (groen vierkant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Heat kaart verkregen vóór (a) en na (b) wijzigingen. (A) Direct heat map die u zonder analyse of wijziging van assay / sample order. (B) Gewijzigd heat map verkregen na het monster en test de naam definitie. Geen input bronnen (blauw vierkant) worden verkregen als er geen versterking plaatsvindt. Inefficiënte primers (groen vierkant). cDNA verdunning-test (paars vierkant). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Single-celpopulatie clustering. Een data-analyse software wordt gebruikt om de clustering tussen populaties bepalen. Gratis clustering software zijn online beschikbaar. Door beoordeling van de gehele expressieprofiel van een enkele cel, kan de software gen handtekeningen en celpopulatie relaties weergegeven. Elk vierkantje vertegenwoordigt een cel: blauw zijn NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, rood zijn NKp46 ⁺ IL-7Rα ^+, en groen zijn NKp46- IL-7Rα ^+. Elke populatie een specifiek gen handtekening. Binnen het NKp46 ⁺ IL-7Rα ^- de bevolking, kan twee handtekeningen te zien, waaruit blijkt dat de bevolking heterogeniteit.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

primers
ACTB	Il-23R
aes	Il-2ra
Ahr	Il-2RB
Bcl2	II-7RA
c-myc	Klr5
Cbfb	Lef1
CD27	Ncr1
Cd49a	Nfil3
Cd49b	Notch1
CXCR5	Notch2
Cxcr6	Rora
Eomes	RORC
Ets1	RUNX3
FoxO1	Tbx21
GAPDH	Tcf3
GATA3	Tcf7
GM-CSF	Tle1
Hes1	Tle3
HPRT	Tsc22d3
Id2	Tnfrsf11a
Il-12rb2	Tox
Il-18r1	Zbtb16
Il-1rl1	Zbtb7b
Il-22

Tabel 1: Primer lijst.

Tabel 2: Pre-amplificatie programma. Elke stap van het pre-amplificatie programma wordt getoond met de volledige informatie over de tijd, temperatuur en aantal cycli.

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe uitputtend genexpressie informatie op het klonale niveau te verkrijgen. Hier, onderzochten we de lever ILC compartiment heterogeniteit. Na eencellige sorteren van de verschillende ILC populaties (gebaseerd op algemeen voor ILC oppervlak markers), monsters werden voorversterkte voor specifieke vooraf geselecteerde genen. Vervolgens worden de verkregen cDNA en primers werden op een multiplex RT-qPCR microfluïdische chip. Tenslotte kregen we de expressie van 48 genen van verschillende 48 individuele cellen. Genexpressie resultaten werden geanalyseerd via een online software om gen handtekening en celpopulatie relaties te onderzoeken.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om meerdere genexpressie tegelijkertijd beoordelen. Het laat ook werk op het klonale niveau en in zeer zeldzame populaties. In tegenstelling tot conventionele RT-qPCR methoden, eencellige multiplex RT-qPCR geen middeling effect, aangezien genexpressie beoordeeld op het klonale niveau. dusHeterogeniteit binnen een populatie kan worden gedetecteerd en geanalyseerd. Single-cell RT-qPCR expressie maakt werk in zeer zeldzame bevolking, omdat slechts zeer weinig cellen nodig zijn om informatie over de hele genexpressie te verkrijgen. Bovendien kunnen verschillende populaties van cellen worden getest op dezelfde plaat. Dit maakt de detectie van verschillen in gen handtekening tussen populaties en, met online data gereedschappen, de beoordeling van de cel bevolking relaties. Deze techniek biedt andere voordelen. Eencellige multiplex RT-qPCR heeft het voordeel van de recente ontwikkelingen microfluidic. De volumes die nodig zijn in de IFC kamers niet overschrijden nanoliter-niveau. Dus lagere hoeveelheden reagentia gebruikt, minder dure experimenten. Tenslotte wordt het totale aantal pipetteerstappen verminderd, waardoor de mogelijkheid pipetteringsfouten beperken. De stappen gelijktijdig zijn voor de cellen en kan met een multichannel pipet, waardoor werken in een snelle en tijdbesparende wijze. Verkregen resultaten bijde klonale niveau reproduceerbaar, betrouwbaar en kan worden gebruikt om betrouwbare gegevens te voeren analyses.

Eencellige multiplex RT-qPCR Wel presenteren een aantal beperkingen. Ten eerste, deze techniek vereist dure en specifieke apparatuur, zoals een microfluïdische chip, een microfluïdische chip controller, en een specifiek temperatuurprogramma. In tegenstelling tot conventionele RT-qPCR methoden is deze techniek tijd- en reactieve besparen, aangezien conventionele RT-qPCR talrijke studies nodig om statistisch significante vergelijkingen verkrijgen. In dit protocol presenteren we een werkwijze om genexpressie te verkrijgen voor 48 genen. 96-96 multiplex RT-qPCR microfluïdische chips beschikbaar zijn. Deze chips kunnen genexpressie beoordelen voor 96 genen uit 96 cellen tegelijk. Tijdens celsortering, een minimum aantal uitgangscellen nodig, aangezien precisie en zuiverheid cel maximaal moet zijn. Maar zelfs met een klein aantal cellen, is het nog steeds mogelijk om te sorteren eencellige multiplex RT-qPCR gen expression (stap 3). Tenslotte eencellige multiplex RT-qPCR is een gevoelige methode. Verschillende tests moeten worden uitgevoerd vóór het begin van dergelijke experimenten. Bijvoorbeeld, voor primer doelwitspecificiteit, primers moeten worden getest op amplificatie-efficiëntie en de relatieve competitie voor het doel.

Verschillende stappen van het protocol moet worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid. De manipulaties van kleine hoeveelheden in combinatie met een groot aantal monsters en assays tegelijkertijd het risico op fouten pipetteren (stap 1, 4, 5, 6 en 7). Alle reagentia en mengsels worden gevortext vóór pipetteren om een ​​homogene oplossing te verzekeren. Verdamping tijdens de pre-amplificatie (stap 4) kan ook invloed hebben op de uiteindelijke resultaten. De platen moeten altijd goed worden afgedicht met een passende afdekfolie. Sorteren strategie moet zeer nauwkeurig (stap 3) om dode cellen of meerdere cellen in putjes in de platen te voorkomen. FACS sorteermachines zijn nu uitgerust met single-cell sortering index software die kan opnemen die specifieke cel gesorteerd was in elk putje. Dit nieuwe hulpmiddel is interessant om te bepalen of gen handtekeningen gecorreleerd aan celoppervlak marker intensiteit. Monster en test posities op chips moeten zorgvuldig worden geregeld, omdat dit essentieel is voor de proef (stap 1, 5 en 6). Tenslotte, de keuze van primers (stap 1 en 6) is een kritische stap. Elke primer moet worden gekozen op basis van eerder beschreven resultaten of verwachte resultaten. Een willekeurige keuze van primers in de set van de beoordeelde genen konden de uiteindelijke uitlezing van het experiment beïnvloeden. Voorts primers die correleren met de celoppervlak marker voor celsortering moet als controles met de huishoudelijke genen.

Beoordeling multiplex genexpressie op klonale niveau biedt een betere karakterisering van de lever ILC heterogene compartiment dan in eerder onderzoek. Deze techniek, door online software geleverd, beschrijft nauwkeuriger het dVerschillende onderdelen van ILC subsets in de lever bij homeostase dan studies met alleen celoppervlak markers. Bovendien is het mogelijk celpopulatie relaties onderzocht en differentiatie netwerken op te bouwen. Het gen handtekeningen, gebaseerd op single-cell genexpressie, zijn ook belangrijke instrumenten om celpopulatie functies te onderscheiden en om potentiële rollen te onderzoeken. Eencellige multiplex RT-qPCR is een van de technieken voor genexpressie test om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Deze gegevens zijn gemakkelijk hanteerbaar met bioinformatica software ^15. Met betrekking tot andere technieken voor genexpressie studies, micro-array of RNA sequentie, eencellige multiplex RT-qPCR biedt een hoge gevoeligheid. Andere benaderingen eencellige analyse zijn beschreven en kunnen worden gebruikt als aanvullend technieken eencellig multiplex RT-qPCR ^{15, 16.} Bovendien kan de techniek worden uitgevoerd bij elke primercombinatie, allowing gebruikers om te kijken naar gepersonaliseerde gen handtekeningen. Vele andere toepassingen kunnen worden gebruikt met deze techniek. Zo kan tijdsverloop genexpressie van cellen tijdens de ontwikkeling worden gedaan om de aanpassing van de moleculair profiel bepalen tijdens de ontwikkeling. Drug effecten op cellen kunnen worden onderzocht met geneesmiddelverdunning de drempel geneesmiddel efficiëntie genexpressie te bepalen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells Direct One Step qRT-PCR kit	Applied Biosystems	11753100	Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme.
Low TE EDTA Buffer	Affymetrix	75793 100ML
96-well plates	Thermofisher Scientific	AB 1100	96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling
Cover film	Dominique Dutscher	106570	aluminium cover film; avoid contamination and evaporation
Actb	Thermofisher Scientific	Mm00607939_s1	20x primer
Aes	Thermofisher Scientific	Mm01148854_s1	20x primer
Ahr	Thermofisher Scientific	Mm00478932_s1	20x primer
Bcl2	Thermofisher Scientific	Mm00477631_s1	20x primer
c-myc	Thermofisher Scientific	Mm00487804_s1	20x primer
Cbfb	Thermofisher Scientific	Mm01251026_s1	20x primer
Cd27	Thermofisher Scientific	Mm01185212_s1	20x primer
Cd49a	Thermofisher Scientific	Mm01306375_s1	20x primer
CD49b	Thermofisher Scientific	Mm00434371_s1	20x primer
Cxcr5	Thermofisher Scientific	Mm00432086_s1	20x primer
Cxcr6	Thermofisher Scientific	Mm02620517_s1	20x primer
Eomes	Thermofisher Scientific	Mm01351985_s1	20x primer
Ets1	Thermofisher Scientific	Mm01175819_s1	20x primer
Foxo1	Thermofisher Scientific	Mm00490672_s1	20x primer
Gapdh	Thermofisher Scientific	Mm03302249_s1	20x primer
Gata3	Thermofisher Scientific	Mm00484683_s1	20x primer
Gm-csf	Thermofisher Scientific	Mm01136644_s1	20x primer
Hes1	Thermofisher Scientific	Mm01342805_s1	20x primer
Hprt	Thermofisher Scientific	Mm00446968_s1	20x primer
Id2	Thermofisher Scientific	Mm01293217_s1	20x primer
Il-12rb2	Thermofisher Scientific	Mm00711781_s1	20x primer
Il-18r1	Thermofisher Scientific	Mm00515178_s1	20x primer
Il-1rl1	Thermofisher Scientific	Mm00434237_s1	20x primer
Il-22	Thermofisher Scientific	Mm001226722_s1	20x primer
Il-23r	Thermofisher Scientific	Mm00519943_s1	20x primer
Il-2ra	Thermofisher Scientific	Mm01340213_s1	20x primer
Il-2rb	Thermofisher Scientific	Mm01195267_s1	20x primer
IL-7r	Thermofisher Scientific	Mm00434295_s1	20x primer
Klr5	Thermofisher Scientific	Mm04207528_s1	20x primer
Lef1	Thermofisher Scientific	Mm00550265_s1	20x primer
Ncr1	Thermofisher Scientific	Mm01337324_s1	20x primer
Nfil3	Thermofisher Scientific	Mm01339838_s1	20x primer
Notch1	Thermofisher Scientific	Mm00435249_s1	20x primer
Notch2	Thermofisher Scientific	Mm00803069_s1	20x primer
Rora	Thermofisher Scientific	Mm01173766_s1	20x primer
Rorc	Thermofisher Scientific	Mm01261022_s1	20x primer
Runx3	Thermofisher Scientific	Mm00490666_s1	20x primer
Tbx21	Thermofisher Scientific	Mm01299453_s1	20x primer
Tcf3	Thermofisher Scientific	Mm01175588_s1	20x primer
Tcf7	Thermofisher Scientific	Mm00493445_s1	20x primer
Tle1	Thermofisher Scientific	Mm00495643_s1	20x primer
Tle3	Thermofisher Scientific	Mm00437097_s1	20x primer
Tsc22d3	Thermofisher Scientific	Mm01306210_s1	20x primer
Tnfrsf11a	Thermofisher Scientific	Mm00437132_s1	20x primer
Tox	Thermofisher Scientific	Mm00455231_s1	20x primer
Zbtb16	Thermofisher Scientific	Mm01176868_s1	20x primer
Zbtb7b	Thermofisher Scientific	Mm00784709_s1	20x primer
qPCR Master mix	Applied BioSystems	P/N 4304437
2x Assay Loading Reagent	Fluidigm	P/N 85000736	Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip.
2x Sample Loading Reagent	Fluidigm	P/N 85000735	Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip.
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip	Fluidigm	BMK-M-48.48	48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction
48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller	Fluidigm	89000020	48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers
mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler	Fluidigm	GE48.48	48.48 Dynamic Array IFC thermocycler
96-well plates	Thermofisher Scientific	AB 1100	96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling
C57Bl/6 mice	Janvier	C57Bl/6 miceJ@RJ
10 ml syringe	BD Biosciences	309639
PBS	Life Technologies	14040174
HBSS	Life Technologies	24020133
RPMI	Life Technologies	61870044
FCS	CVFSVF000U	Eurobio Abcys	Standard fetal calf serum
Potter tube	N/A
15 ml tube	Corning	352097
1.5 ml tube	Sigma-Aldrich	T9661-1000EA
FACS machine	N/A
centrifuge	Thermofisher Scientific	75004538
1,000 µl tips	Fisher Scientific	10313272
P1000	Gilson	F123602
Percoll	Dominique Dutscher	17-0891-01
Facs tube	Falcon	352235
anti-CD8 Biotin mouse antibody	Sony	1103520	lineage antibody
anti-CD19 Biotin mouse antibody	Sony	1177520	lineage antibody
anti-TCRab Biotin mouse antibody	BioLegend	109204	lineage antibody
anti-TCRgd Biotin mouse antibody	BD Biosciences	553176	lineage antibody
anti-Ter119 Biotin mouse antibody	BD Biosciences	553672	lineage antibody
anti-Gr1 Biotin mouse antibody	BD Biosciences	553125	lineage antibody
anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody	BioLegend	109828
anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody	ebioSciences	25-1271-82
anti-CD3 BV510 mouse antibody	BD Biosciences	563024
anti-CD4 BV786 mouse antibody	BD Biosciences	563727
anti-NKp46 PE mouse antibody	ebioSciences	12-3351-82
Streptavidin	Sony	2626025
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Electronic pipette	Eppendorf	4986000017
Combitips 0.1 ml	Eppendorf	30089405
Multichannel pipette	Rainin	L8-10XLS+
Accudrop	BD Biosciences	345249	verification beads for FACS