Summary
La détermination de la structure en solution d'une protéine par diffusion aux petits angles des rayons X (SAXS) exige des échantillons monodispersées. Ici, nous présentons deux possibilités pour assurer un minimum de retards entre la préparation des échantillons et l'acquisition de données: chromatographie en ligne d'exclusion de taille (SEC) et la chromatographie par échange d'ions en ligne (IEC).
Abstract
Biologique petit angle diffusion des rayons X (BioSAXS) est une technique puissante en biologie moléculaire et structurale utilisée pour déterminer la structure de la solution, la taille des particules et la forme, et le rapport surface-volume de macromolécules. La technique est applicable à une très grande variété de conditions de solution couvrant une large gamme de concentrations, les valeurs de pH, forces ioniques, des additifs, des températures, etc., mais l'échantillon est nécessaire pour être monodispersés. Cette mise en garde a conduit à la mise en œuvre des systèmes de chromatographie en phase liquide sur beamlines SAXS. Ici, nous décrivons l'intégration en amont d'exclusion stérique (SEC) et Chromatographie d'échange d'ions (IEC) sur une ligne de lumière, différentes méthodes de fond optimale soustraction, et la réduction des données. A titre d'exemple, nous décrivons comment nous utilisons sec- et IEC-SAXS sur un fragment de la protéine du virus de la vaccine essentielle D5, consistant en un domaine hélicase D5N. Nous déterminons sa forme globale et le poids moléculaire, montrant la structure hexamérique de thprotéine e.
Introduction
BioSAXS est un outil puissant pour déterminer la forme des objets de taille nanométrique 1-4. La diffusion des rayons X par une solution contenant des macromolécules, de taille dans la gamme de nm, est enregistré à très faibles angles. Cette plage angulaire contient des informations sur les paramètres globaux: le rayon de giration; la distance la plus grande intraparticulaire; forme de particules; et le degré de pliage, la dénaturation, ou d'un trouble. La technique ne nécessite pas de cristaux et la macromolécule reste en solution et ne peuvent donc être conservés dans des conditions mimant certains paramètres importants de la cellule, telles que la force ionique, le pH, etc. La connaissance de ces facteurs pourrait contribuer à déterminer, par exemple, l'état oligomérique physiologiquement pertinente d'une protéine d'intérêt ou de valider un modèle proposé d'un complexe. La caractérisation des interactions protéine-protéine dans des conditions de tampon différentes, la création de modèles de domaines manquants, le raffinement des modèles d'homologie, et determinaison d'états pliée et dépliée discrets peut être effectuée rapidement et facilement 5.
Comme toute technique, BioSAXS a des faiblesses intrinsèques: des échantillons agrégés ou dénaturées, des mélanges de particules, des échantillons hétérogènes, dégâts d'irradiation, et l'inadéquation des tampons peut entraîner des données non-interprétable. Pour de nombreuses méthodes d'analyse, il est implicitement supposé que l'échantillon est monodispersée, une exigence qui est souvent difficile à obtenir en pratique. Dans de nombreux cas, la dégradation de l'échantillon est subtile et ne peut être détectée dans les données sur son propre, et toute tentative d'interpréter les données donne des résultats inexacts ou même trompeurs. Pour surmonter ces obstacles, la combinaison de chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et SAXS a été mis en œuvre sur de nombreuses lignes de lumière pour assurer la qualité des données et de rendre cette technique plus accessible pour les échantillons de plus en plus difficiles 6-11. Récemment, nous avons ajouté une nouvelle méthode pour le répertoire en développant l'échange d'ions en ligneChromatographie (IEC) -coupled SAXS 12. Les deux techniques ouvrent SAXS à un large éventail de particules biologiques autrefois impossibles à analyser. Le choix de la méthode à utiliser dépend des propriétés biophysiques des particules d'intérêt.
SEC sépare les macromolécules par leur taille, de sorte qu'au moins une différence de 10% de la masse moléculaire apparente est nécessaire pour la séparation. Les limites physiques de la colonne et les propriétés physiologiques des échantillons, comme des surfaces hydrophobes, la flexibilité et le manque de stabilité, compliquent également la collecte de données, l'analyse et l'interprétation.
Chromatographie par échange d'ions, qui sépare les molécules en fonction de leur charge et, par conséquent, leur affinité de liaison à la colonne CEI, peut être utilisé à la place ou en plus de la SEC. La charge totale peut être facilement manipulée en modifiant le pH, ou en faisant varier la concentration en sel du tampon, en fournissant un procédé relativement simple pour le contrôle elution des molécules de la colonne IEC. En utilisant la charge, la séparation des types et tailles de molécules similaires, qui seraient autrement difficiles à séparer, peut être effectuée régulièrement avec la CEI. En outre, la CEI a l'avantage d'être en mesure de traiter les échantillons dilués, permettant d'éviter les étapes de concentration, qui portent le risque potentiel de dénaturation de la protéine. Malheureusement, comme la distribution de charge est très dépendante de l' échantillon, la CEI nécessite une optimisation en ce qui concerne le pH et les concentrations en sel 13,14.
Pour de nombreuses protéines qui sont difficiles à exprimer, purifier ou les deux, que de faibles quantités d'échantillons sont disponibles pour étudier. Il est important d'être efficace et de minimiser le nombre d'étapes de purification et, par conséquent, les pertes. Pour cette raison, la dernière étape de purification est en ligne directement avant l'acquisition de données SAXS, afin d'augmenter la probabilité de la collecte d'un bon ensemble de données.
Ici, Nous présentons et comparer en ligne SEC-SAXS et IEC-SAXS. Les deux techniques ont été mises en œuvre sur la ligne de lumière BioSAXS BM29 à l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) à Grenoble, France 15. En cas de test, nous avons utilisé le domaine D5N et hélicase de la protéine du virus de la vaccine D5, qui était assez difficile à analyser structurellement en utilisant d'autres méthodes. Le virus de la vaccine est un membre de la famille des Poxviridae et 98% identique au virus de la variole, la cause de la petite vérole. En utilisant le système de la vaccine, nous étudions les mécanismes de réplication, en mettant l'accent ici sur l'essentiel D5 hélicase-primase.
D5 est une protéine de 95 kDa avec un archéo-eucaryote primase (AEP) domaine N-terminal 16 suivie d'une région de groupe de cystéine (res. 240-345) 16. Plus loin vers l'extrémité C-terminale vient un domaine D5N (rés. 340-460), qui est toujours associée à hélicases D5 type, et enfin une superfamille 3 (SF3) domaine hélicase (rés. 460-785) 17 (Figure 1A). Le domaine hélicase de D5 construit une structure en anneau hexamérique qui est nécessaire pour la liaison étanche à l'ADN. Merci aux récentes études SAXS et EM, les structures à faible résolution de la primase et les domaines d'hélicase sont maintenant connus 18.
Ici, nous montrons comment utiliser les techniques de chromatographie en ligne mis en place sur la ligne de lumière BioSAXS BM29 à l'ESRF pour obtenir un aperçu de la structure du fragment C-terminal (résidus 323-785) de D5.
Protocol
1. Description de l'Offline Préparation et Génération échantillon d'une protéine D5 délétion
NOTE: Le produit d' assemblage 323-785 D5 (figure 1A) a été clone, exprimé et purifié comme décrit 18.
- Cloner la construction dans le vecteur pProEx HTB
- Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) sur D5R en utilisant les 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 'et 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' amorces et une réaction PCR mélange avec polymérase, suivant les conseils du fabricant.
- Purifier les fragments PCR via des colonnes de centrifugation, suivant les conseils du fabricant.
- Digest les fragments PCR et le plasmide avec le Ncol et enzymes de restriction HindIII, suivant les recommandations du fabricant pour la composition du tampon et le temps d'incubation.
- Exécuter les fragments sur un gel d'agarose à 1% dans un tampon TAE 0,5 (Tris 20 mM, acide acétique 10 mM,et 0,5 mM d'EDTA), et colorer le gel avec un colorant d'ADN.
- Exposer le gel à la lumière UV.
Attention: Porter un équipement de sécurité personnelle! Découper les bandes de fragments de PCR digéré et digéré le plasmide et on purifie l'ADN en utilisant un kit de colonne de centrifugation de purification sur gel, en suivant les recommandations du fabricant. - Ligaturer les fragments PCR purifiés dans le plasmide en utilisant un kit de ligature rapide, suivant les recommandations du fabricant.
- Transformer par choc thermique du produit de la réaction de ligature dans des bactéries compétentes optimisées pour l'amplification du plasmide.
- Ajouter la moitié du produit de ligature à un flacon de bactéries.
- Incuber le tube de réaction sur de la glace pendant 20 minutes.
- Incuber le tube à 42 ° C pendant 30 s.
- Placer le tube sur de la glace pendant 2 min.
- Ajouter 1 ml de Luria Bertani (LB) Broth (Miller) sans antibiotiques et laisser les cellules se rétablissent à 37 ° C pendant 1 h.
- Isoler les cellules à 16.100 xg for 3 s dans un microtube de centrifugeuse de paillasse et éliminer la majeure partie du milieu.
- Répartir les cellules sur une plaque de gélose LB avec de l'ampicilline (50 pg / ml final) et laisser les colonies se développent à 37 ° C pendant la nuit.
- Mettez une colonie dans 3 ml de LB avec de l'ampicilline (50 pg / ml final) et faire croître la culture à 37 ° C, en agitant à 160 tours par minute pendant la nuit.
- Suivez les instructions du kit miniprep pour extraire le plasmide.
- Envoyer un échantillon du plasmide pour le séquençage et l'analyse de la séquence de l'absence de mutations et pour l'insertion correcte.
- Transformer le pProEx HTB D5 323-785 construire dans des bactéries optimisées pour l' expression des protéines (utiliser 1 pi et suivez les étapes à l' étape 1.1.7). Répartir les bactéries sur une plaque de gélose LB avec de l'ampicilline (50 pg / ml final).
- Pour créer une culture de départ, mettre une colonie dans 300 ml de LB avec ampicilline (50 pg / ml finale) et cultiver les bactéries à 37 ° C, en agitant à 160 rh pendant une nuit.
- Inoculer 12 x 1 L de LB en présence d'ampicilline (50 pg / ml final), chacun avec 20 ml de la pProEx HTB D5 323-785 bactéries starter culture à 37 ° C jusqu'à une DO600 = 0,3 soit atteint. Réduire la température à 18 ° C et à induire l' expression à une DO600 = 0,5 avec 1 mM d' IPTG. Incuber les cultures, les secousses à 160 tours par minute et 18 ° C pendant la nuit.
- Récolter les bactéries par centrifugation à 50 000 x g et à 4 ° C pendant 30 min. Remettre en suspension les culots bactériens dans environ 150 ml de tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl [pH 7], 150 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 10 mM de β-mercaptoéthanol et 10% de glycerol) avec un inhibiteur de protéase 1x et 25 unités ( U) / 10 ml de DNase. Lyse les bactéries par sonication sur la glace (sonde de 1 pouce, 50% de la puissance, de 0,5 s impulsion, 0,5 s pause, 3x 5 min).
- Charger le surnageant sur une colonne d'affinité de nickel (Ni-colonne, volume de lit 1,5 ml) et lavée avec 10 volumes de colonne (CV) de bun tampon rouver (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM de NaCl, 10 mM de β-mercaptoéthanol et 10% de glycerol) 10 CV de tampon de lavage (50 mM de Tris-HCl [pH 7], 1 M de NaCl, 10 mM de β-mercaptoéthanol et 10% de glycerol) et 10 CV de lavage d'imidazole (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM de NaCl, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% de glycerol, et 30 mM d'imidazole). Éluer la D5 323-785 (Tris-HCl 20 [pH 7], 150 mM de NaCl, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% de glycerol, et de l' imidazole 200 mM).
- Inspecter les différentes étapes de la purification par le dodécylsulfate de sodium (SDS) à une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (PAGE).
- Charge 2-20 ul de chaque étape de purification accréditive mélangé avec 1x colorant de charge (2x: 4% de SDS, 20% de glycerol, 120 mM de Tris-HCl [pH 6,8], et 0,02% en poids / volume de bleu de bromophénol) sur un 10 % SDS gel et de les exécuter à 200 V dans 1x Laemmli courant de tampon (Tris 25 mM, 0,192 M de glycine, et 0,1% de SDS).
- Colorer le gel avec une solution de bleu de Coomassie prête à l'emploi.
- Exehanger le tampon de la protéine élue avec un tampon de liaison en utilisant une colonne de dessalage selon le manuel du fabricant.
- Cliver le marqueur His en ajoutant Tobacco Etch Virus nucléaire inclusion-a endopeptidase (TEV, 1 mg / 100 mg de protéine) à la solution de protéine. Incuber à température ambiante pendant une nuit.
- Vérifiez la digestion en effectuant SDS-PAGE (voir l'étape 1.5)
- Equilibrer le Ni-colonne dans un tampon de liaison. Laissez la solution de protéines passer à travers et se laver les perles avec 2 CV de tampon de lavage imidazole tout en recueillant l'écoulement.
- Concentrer la protéine en utilisant un concentrateur centrifuge à un volume final de 0,5 ml.
- Injecter la protéine concentrée sur une colonne d'exclusion de taille équilibrée avec le tampon de filtration sur gel (20 mM Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, 10% de glycerol et 1 mM de dithiothréitol [DTT]).
- Recueillir l'écoulement dans 0,5 mL fractions.
- Vérifier la présence et la pureté de la protéine dans les échantillons de crête pareffectuer SDS-PAGE (voir l'étape 1.5).
- Combiner les fractions du pic élue de D5 323-785. Diluer l'échantillon à 25 mM de NaCl et 5% de glycerol tout en maintenant les concentrations de Tris et DTT constante (pour 5 ml de solution de protéine dans 20 mM de Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, 10% de glycerol, et DTT 1 mM, d'abord ajouter 5 ml de 20 mM Tris-HCl [pH 7] et 1 mM de DTT, puis ajouter 20 ml de 20 mM Tris-HCl [pH 7], 5% de glycérol et 1 mM de DTT).
- Chargez l'échantillon sur une colonne d'échange d'ions. Utiliser un tampon A (Tris 20 mM [pH 7], 25 mM de NaCl, 5% de glycerol, et DTT 1 mM) et du tampon B (Tris 20 mM [pH 7], 1 M de NaCl, 5% de glycerol, et DTT 1 mM) pour former un gradient de sel de 25 mM à 1 M.
- Recueillir la protéine éluée dans 1,5 mL fractions.
- Vérifiez la présence et de la pureté de la protéine dans les échantillons de pointe en effectuant SDS-PAGE (voir l' étape 1.5 et la figure 1B)
- Reconcentration de la solution de protéine dans un concentrateur centrifuge à un volume final de 0,5 ml.
- Rerun la protéine concentrée sur une colonne d'exclusion de taille dans un tampon de filtration sur gel (20 mM Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, 5% de glycerol, et DTT 1 mM; voir l'étape 1.11).
2. Collecte de données
NOTE: Demande de temps de faisceau le plus tôt possible. Pour ESRF, des lignes directrices sur les types d'accès disponibles et sur la façon de présenter une demande peuvent être trouvés à l'adresse:
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Après l'acceptation de la proposition et une invitation à l'expérience, tous les participants doivent suivre une formation de sécurité. Après validation de la formation, remplir le "A-forme" (via le portail utilisateur ESRF) de déclarer les chercheurs invités la ligne de lumière de l'expérience, ainsi que les informations de sécurité requises sur les échantillons. Contactez la personne de contact local pour discuter de l'expérience.
- La collecte de données SEC-SAXS
NOTE: Pour ONLpurification ine, utilisez le système de haute performance chromatographie en phase liquide (HPLC) installé à BM29. Le système est constitué d'un dégazeur en ligne, une pompe binaire, une vanne de sélection de tampon et de gradients, un échantillonneur automatique, un tableau photospectromètre UV-VIS, et un conductimètre. Elle est directement attaché au capillaire de l'unité d'exposition SAXS 19 accréditive.- Placer 1 ml de tampon de filtration sur gel de côté. Connecter la bouteille tampon au système SEC (la valeur par défaut est Port A).
- Choisir le débit en fonction de la colonne utilisée. Remarque: Pour la colonne d'exclusion de taille utilisée ici, le débit est de 0,1 mL / min. Définir la pression maximale pour la colonne, prendre note de la contre-pression, et réglez le temps d'acquisition d'au moins 1,2 CV.
- Rincer les pompes et les tubes en amont via la fonction "auto-purge".
- Attendez jusqu'à ce que le système est rempli avec le tampon et connecter la colonne. Equilibrer la colonne par passage d'au moins 1,5 CV.
- Interlockla huche et de mesurer le tampon mis de côté à l'étape 2.1.1, en utilisant le passeur d'échantillons pour contrôler la variation du signal en raison de dégâts d'irradiation. Seulement continuer s'il n'y a pas de dégâts de rayonnement dans la mémoire tampon.
- Mettez le système de contrôle de la ligne de lumière en mode HPLC. Faire un essai de tampon, la collecte de 200 cadres avec 1 s par image. Notez le nombre de coups donnés par le détecteur dans la parcelle d'intensité résumée.
NOTE: Le signal doit correspondre à la mémoire tampon précédemment mesurée, et l'intensité résumée au fil du temps doit rester constante. Si le signal ne correspond pas ou est pas constante, une plus équilibration du système est nécessaire. - Centrifuger l'échantillon à 13 000 x g dans une centrifugeuse de table de microtubes pendant au moins 10 min.
- Remplir l'échantillon dans un flacon de verre HPLC-compatible (fourni) et le mettre dans l'auto-injecteur. Notez la position du puits.
- Interlock la huche expérimentale utilisant la procédure standard, comme expliqué dans la formation de la sécurité de l'utilisateur.
- Connectez-vous à et créer un dossier pour le stockage de données via le logiciel de contrôle de la ligne de lumière.
- Programmer le système HPLC en utilisant le "lot rapide" caractéristique. Définissez l'emplacement de stockage pour les données UV dans le dossier créé à l'étape 2.1.10. Assurez-vous d'activer la conversion automatique ASCII des données d'UV, de stocker le fichier ASCII dans le même dossier.
- Choisissez le volume d'injection et la position du puits. Ajouter la mesure à la file d'attente en appuyant sur le bouton "Démarrer". Le logiciel vous demandera de sauver le lot. Préparez-vous à sauver, mais ne pas appuyer sur le bouton "Enregistrer", comme cela commence automatiquement la mesure.
- Définissez les paramètres de collecte de données dans le logiciel de contrôle de la ligne de lumière. Choisissez le nombre d'images de telle sorte que le temps de collecte de données total est en léger excès du temps d'acquisition définie à l'étape 2.1.2.
- Ouvrez l'obturateur de sécurité et de commencer la collecte des données SAXS en utilisant le logiciel de contrôle de la ligne de lumière. Vérifiez que les données sont correctement acquise. Comparer les données nouvellement collectées les données recueillies à l'étape 2.1.6 et vérifier que le nombre de comptes de l'intensité résumée reste constante pendant au moins 100 images et correspond à la valeur de l'étape 2.1.6.
- Démarrez la SEC exécuter en appuyant sur le bouton "Enregistrer", tel que préparé à l'étape 2.1.11, et notez le numéro d'image affiché dans le logiciel camserver lorsque l'injection est terminée et l'acquisition de données UV commence.
- Après la collecte des données, ouvrez la base de données ISPyB 20 à Ouvrez l'onglet "d'acquisition de données" et appuyez sur le bouton "Go" pour accéder à l'ensemble de données et les résultats de l'analyse automatique 21.
- La collecte de données IEC-SAXS
REMARQUE: Au lieu du gradient linéaire continue couramment appliquée dans les expériences de la CEI, utiliser un gradient par étapes dans laquelle la quantité de tampon B est augmentée dans les étapes préétablies discrètes.- Créer le programme de HPLC pour une sample-free run tampon. Programmer un gradient par étapes à partir de 0% de tampon B et l'augmentation de 5 points de pourcentage après deux CV jusqu'à 100% de tampon B est atteint.
- Mettez un peu de chaque tampon de côté. Connectez la bouteille avec le faible teneur en sel du tampon A au port A et celui avec le haut-sel tampon B au port B.
- Choisissez le débit et de rester en dessous de la limite de pression de la colonne (dans cet exemple, 1 mL / min).
- Comme à l'étape 2.1.3, rincer les pompes et la tuyauterie en amont en utilisant la fonction "auto-purge".
- Equilibrer le système en faible teneur en sel tampon A (voir l'étape 1.15) et connecter la colonne échangeuse d'ions. Attendez jusqu'à ce que la colonne est complètement équilibrée (au moins 1,5 CV).
- Utilisez le tampon mis de côté à l'étape 2.2.2 pour examiner les tampons A et B pour les dommages de rayonnement en utilisant le passeur d'échantillons, comme dans l'étape 2.1.5.
- Vérifier le tampon sortant de la colonne, comme à l'étape 2.1.6. Comparer le signal au signal de tampon A enregistrée à l'étape 2.2.6. Notez encore lanombre de coups dans la parcelle d'intensité résumée.
- Créez un dossier pour le stockage de données pour l'exécution de la mémoire tampon.
- la collecte de données Mise en place en mode système HPLC. Choisissez le nombre d'images de telle sorte que le temps de collecte de données totale est supérieure à la durée totale de la course IEC (voir étape 2.2.1).
- Ouvrez l'obturateur de sécurité et de commencer la collecte de données SAXS. Vérifiez qu'il procède correctement et double-vérifier que l'intensité résumée reste constante à la valeur notée à l'étape 2.2.7 pour au moins 100 images.
- Utilisez la fonction "Single Run" du logiciel de HPLC et démarrer le gradient par étapes programmée à l'étape 2.2.1. Pour l'injection, définissez le nombre flacon à -1 afin d'injecter aucun échantillon dans cette étape. Notez le nombre d'images acquises dans le programme démarre.
- Créer le programme de CLHP pour l'échantillon run. Programmer un gradient par étapes à partir de 0% de tampon B. Estimer le pourcentage de tampon B à chaque pic mesuré hors ligne à l'étape 1.1.5 (
- Centrifuger l'échantillon à 13 000 x g dans une centrifugeuse de table de microtubes pendant au moins 10 min.
- Diluer D5 323-785 dans la concentration saline de tampon A (25 mM) , en le mélangeant avec 20 mM de Tris-HCl [pH 7], 10% de glycerol, et DTT 1 mM.
- Chargez l'échantillon manuellement sur la colonne. Placer le tampon Un tube d'entrée dans l'échantillon dilué après une pause des pompes afin d'éviter la formation de bulles d'air. Déconnecter la colonne des détecteurs pour recueillir directement l'écoulement de la colonne.
- Lorsque le conteneur d'échantillon est presque vide, le retour du tube d'entrée dans le tampon A (pause à nouveau la pompe pendant le déplacement du tube) et remettre en marche le pompage avec du tampon A pour transférer l'échantillon du tube de la colonne. Une fois que l'ensemble de l'échantillon a étéchargé, passer 2 CV de tampon A, puis rebranchez la colonne aux détecteurs.
- Pour l'exemple d'exécution, créez un dossier pour le stockage des données.
- Ouvrez l'obturateur de sécurité et de commencer la collecte de données SAXS. Vérifiez que la collecte de données se déroule correctement et double-vérifier que l'intensité résumée reste constante à la valeur notée à l'étape 2.2.7 pour au moins 100 images.
- Utilisez la fonction "Single Run" du logiciel de HPLC pour démarrer le gradient par étapes programmée à l'étape 2.2.12. Pour l'injection, définissez le nombre flacon à -1 afin d'injecter aucun échantillon dans cette étape. Notez le nombre d'images acquises dans le programme démarre.
- "Acquisition de données" Open in ISPyB 20 et appuyez sur "Go" pour regarder l'ensemble des données et l'analyse automatique 21.
- Exporter les données UV du système HPLC au format ASCII via le logiciel "Analyse Postrun".
3.SEC-SAXS Réduction et analyse des données
- Ouvrez les données dans l'acquisition de données en ISPyB en appuyant sur le bouton "Go". Déterminer dans la liste qui encadre la collecte de données SAXS correspond au pic d'élution. Vérifiez que le rayon de giration est stable tout au long de la crête.
- Assurez-vous que la correction de la mémoire tampon automatisée a été effectuée correctement. Cadres de charge de la partie centrale du pic dans un programme qui effectue des manipulations avec les données expérimentales SAXS fichiers 22 et en moyenne eux. Ensuite, chargez le fichier tampon généré automatiquement et vérifier si les régions de haute q des trames moyennées et le match des cadres de tampons.
- Comparer les images acquises tout au long du pic quantitativement en utilisant le test CORMAP 23.
- Chargez les soustractions créés automatiquement (fichiers * _sub.dat) de cadres couvrant la région d'intérêt.
- Échelle les uns aux autres en appuyant sur le bouton "Scale".
- Compare en utilisant la fonction "Comparaison des données". Il devrait y avoir aucun changement systématique entre les cadres tout au long de la crête.
- Ouvrez tous * -_ cadres sub.dat d'intérêt, les fusionner en utilisant le bouton "Fusionner" et sauvegarder le fichier fusionné au format .dat.
- Déterminer le rayon de giration avec l'outil "Rayon de giration" dans le programme, en notant le premier point de données dans la gamme Guinier pour plus tard le recadrage des données à basse résolution.
- Déterminer la fonction de distribution paire-distance avec le "Distance Distribution" outil dans le programme et enregistrez le fichier .out résultant comme gnom.out.
4. Ab Initio Modélisation
- Sur une machine Unix, lancer un programme de reconstruction 40 x ab initio modèle sans restrictions de symétrie. Créer un nouveau dossier et copiez le fichier gnom.out à elle. Exécutez le programme comme suit:
pour ((i = 1; i <= 40; i ++)); faire dammif gnom.out -ms -p dammifp1_ $ i; réun - De manière analogue, exécuter un programme de reconstruction du modèle ab initio avec des restrictions de symétrie pour six fois la symétrie dans un second dossier:
pour ((i = 1; i <= 40; i ++)); do dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ i; terminé - Aligner tous les fichiers de sortie du programme ab de reconstruction du modèle initio (* -1.pdb). Dans les deux dossiers des étapes 4.1 et 4.2, exécutez damaver -a * -1.pdb.
- Ouvrez l'union de tous les modèles (damaver.pdb), ainsi que le modèle filtré pour le volume correct (damfilt.pdb) dans un logiciel de visualisation moléculaire approprié 26 et les comparer.
- Ouvrez le fichier damsel.log dans un éditeur de texte. Le modèle répertorié en tant que «référence» à la fin du fichier est le modèle le plus représentatif.
5. IEC-SAXS Réduction des données, l'analyse et la modélisation
- Dans le programme qui exécute la manipulation des fichiers de données expérimentales 22 SAXS, charger environ 50 SAXS trames de chaque étape de mélange dela course de la mémoire tampon, appuyez sur le bouton "MOYENNE", et enregistrer les résultats.
- D'après les résultats d'auto-traitement disponibles via ISPyB, identifier les cadres de l'expérience correspondent à l'élution de la protéine et vérifiez que le rayon (préliminaire) de giration est stable tout au long de la crête.
- Chargez les cadres dans le SAXS programme expérimental de manipulation des fichiers de données 22 et la moyenne entre eux, comme cela se fait pour les trames de tampon (voir étape 5.1). Ensuite, chargez les fichiers tampons générés à l' étape 5.1 et de comparer les régions de haute q (supérieur à 4,2 nm -1) pour trouver un tampon qui correspond à la moyenne du pic.
NOTE: Il devrait y avoir aucune décalage systématique entre la moyenne du pic et le tampon. Si la courbe de l'échantillon semble tomber entre deux courbes tampons, interpoler leurs courbes en calculant la moyenne. - Soustraire le tampon identifié comme étant le meilleur match de la courbe de dispersion moyenne de la fraction de pic et enregistrez le subtr résultantfichier agi. En outre, créer des courbes soustraites en utilisant les courbes de tampon moyennes des étapes de mélange précédent et suivant pour estimer la marge d'erreur de la soustraction.
- Répétez les étapes 5.3 et 5.4 individuellement pour les moitiés gauche et droite du pic et de comparer les résultats à ceux de l'étape 5.4 pour vérifier la stabilité du signal tout au long de la crête.
- Suivez les étapes 3.5 et 3.6 pour les trois courbes soustraites de l'étape 5.4.
- Comparez les résultats pour les trois courbes soustraites.
Note: Seuls les résultats qui restent robustes dans la marge d'erreur de soustraction peut faire confiance. - Effectuer la modélisation comme dans les étapes 4.1 et 4.2 pour la meilleure soustraction identifiée à l'étape 5.3.
- Suivez l'étape de 4,3 à 4,5 pour aligner les modèles et d'identifier le plus représentatif.
6. Comparaison des résultats
- Exécuter un programme pour superposer des structures 3D 12 sur les modèles représentatifs de la SEC (étape 4.5) undonnées d IEC-SAXS (étape 5.9) avec P6 symétrie: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb
- Importez le model_sec.pdb et l'model_iec-r.pdb dans un logiciel de visualisation moléculaire.
- Ouvrez les fichiers .fir du modelsec.pdb et l'modeliec-r.pdb dans une feuille de calcul et de créer un graphique 2D des courbes de diffusion expérimentales et calculées.
Representative Results
Les résultats de l'analyse invariante sans modèle sont listés dans le tableau 1. L'analyse des données 323-785 SEC-SAXS D5 a montré une estimation de masse moléculaire ( à partir d' une analyse Porod) de 345 kDa contre 338 kDa, observée en utilisant IEC-SAXS. Les deux sont en accord avec la masse attendue de 6 fois 53,5 kDa (321 kDa) pour un hexamère. La modélisation ab initio des deux ensembles de données a été réalisée sans symétrie imposée (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) et en utilisant C6 symétrie (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Comme les ajustements globaux pour les données de diffusion pour les reconstructions sont comparables dans les deux cas (figure 1D et E), C6 symétrie peut supposer. Ainsi, le modèle correspond à une structure en forme de cône hexagonal avec un canal central, qui apparaît partiellement obstruée (SEC: Figure 1F; IEC:
Figure 1: SAXS analyse des données et la comparaison de D5 323 -785 (figure adapté des références 12 et 18). A) structure de domaine schématique de la protéine D5 et D5 323-785. B) Hors ligne d'échange d' ions chromatogramme avec l'indication des trois pics. Orange courbe: Absorbance à 280 nm (au), courbe bleue: pourcentage de tampon B. Les pourcentages de tampon B au niveau des pics sont indiquées. C) En ligne chromatogramme d'échange d' ions. touche de couleur comme dans B. De plus, l'intensité mesurée est indiquée en vert. La dispersion expérimentale courbe ae courbe du modèle obtenu par SEC-SAXS D) et IEC E) analyse des données de D5 323-785 calculée. Modèle F) Perle de D5 323-785 sur la base des données de la SEC et les données G) IEC. H) Superposition des modèles de la SEC et de la CEI. Les panneaux F) à H) ont été créés à l' aide d' un logiciel de visualisation moléculaire 24. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Paramètres de collecte de données | |
| Instrument: | ESRF BM29 |
| Longueur d'onde (nm) | 0,99 |
| q-gamme (Å -1) | 0,0032 à 0,49 |
| Sample-détecteur Distance | 2.864 m |
| Temps d'exposition (sec) | 1 par image |
| Plage de concentration | n / a |
| Température (K) | 293 |
| Détecteur | Pilatus 1M (Dectris) |
| Flux (photons / s) | 1 × 10 12 |
| Taille du faisceau (pm 2) | 700 × 700 |
| Paramètres structurels pour D5 323-785, SEC | |
| I 0 (cm -1) [de Guinier] | 0,0237 |
| Rg (Å) [de Guinier] | 48 |
| q min R g - q max Rg utilisé pour Guinier | 0,77 à 1,24 |
| D max (nm) [P (r)] | 145 |
| q-plage utilisée pour p (r) (Å -1) | De 0,02 à 0,17 |
| Porod volume V p (Å 3) [de Scatter] | (570 ± 5) x 10 3 |
| Masse moléculaire M r (kDa) [de V p] | 345 |
| Calculé monomère M. de la séquence (kDa) | 321 |
| Paramètres structurels pour D5 323-785, IEC | |
| I 0 (cm -1) [de Guinier] | 0,386 |
| Rg (Å) [de Guinier] | 46,5 ± 0,1 |
| q min R g - q max Rg utilisé pour Guinier | 0,44 à 1,29 |
| D max (nm) [P (r)] | 120 |
| q-plage utilisée pour p (r) (Å -1) | 0,03 à 0,18 |
| Porod volume V p (& #197; 3) [de Scatter] | (577 ± 5) × 10 3 |
| Masse moléculaire M r (kDa) [de V p] | 339 |
| Calculé hexamérique M. de la séquence (kDa) | 321 |
Tableau 1: paramètres de données SAXS. Le tableau résume les paramètres d'acquisition de données SAXS et de l'analyse.
Discussion
Pour beaucoup de macromolécules, une étape de purification finale par chromatographie est nécessaire avant la collecte des données SAXS pour obtenir un bon ensemble de données de qualité. Cependant, tous les échantillons restent stables; elles peuvent être sujettes à l'agrégation ou rééquilibration à un mélange d'états d'oligomérisation. Par conséquent, une étape de purification finale en ligne sur la ligne de lumière est nécessaire pour minimiser le temps écoulé entre la purification et de collecte de données afin d'obtenir des données SAXS de la meilleure qualité. Selon les propriétés biophysiques de la protéine d'intérêt, la SEC SAXS ou IEC-SAXS peuvent être choisies de manière à obtenir une qualité optimale de l'échantillon. Ici, une construction de protéine dérivée de l'hélicase / primase D5, deux techniques sont expliquées et discutées.
Acquisition de données SEC-SAXS devient de plus en plus standardisée et est disponible sur de nombreux BioSAXS beamlines. L'analyse des données, en particulier soustraction de fond, est relativement simple et facile. Cependant, un signal de tampon stable,et la séparation suffisante des espèces macromoléculaires reste essentielle. Par conséquent, il est essentiel de prévoir suffisamment de temps pour équilibrer la colonne à fond. Échec de cette méthode peut être dû à des contaminants persistants de taille similaire à la protéine d'intérêt, de faibles concentrations, et les tampons sensibles aux rayonnements.
Dans la pratique, au départ, la SEC SAXS est susceptible d'être utilisé comme méthode de choix pour la plupart des échantillons macromoléculaires. Pourtant, de nombreux protocoles de purification nécessitent une étape CEI avant en raison de la présence de contaminants ou de l'agrégation. Étant donné que chaque étape de concentration et chromatographie est associée à des pertes d'échantillon (estimé à 30-50%) et le temps, directement IEC-SAXS est avantageux. Pour les échantillons qui ne peuvent être purifiés par la SEC, que ce soit en raison de la présence de "contaminants" de taille similaire ou parce qu'ils sévèrement global aux concentrations nécessaires, IEC-SAXS serait toujours l'approche mieux adaptée. En outre, les débits plus élevés soutenuspar de nombreuses colonnes IEC peuvent aider à réduire le temps de transit entre la purification et la mesure. Dans l'exemple présenté ici, la CEI a été utilisé avec une élution par étape, ce qui permet la séparation des pics proches de D5 323-785 de contaminants en choisissant avec soin les étapes de concentration de sel. En principe, le nombre d'étapes est illimité, mais pratiquement, au moins 1 étape par pic est nécessaire, et pas trop doit être choisi. Pour la méthode de soustraction de fond décrit ci-dessus, il est essentiel de mesurer un nombre relativement élevé de compositions tampons différents afin de trouver celui correspondant.
Un inconvénient commun de ces deux techniques est le manque d'information de la concentration de protéines précise. Pour cette raison, détermination de la masse précise basée sur la diffusion en avant est pas possible. Pour les protéines globulaires telles que D5 323-785, le volume Porod offre une alternative, quoique moins précis, une estimation de masse, mais pour des protéines hautement flexibles ou désordonnés, Cette approche ne serait pas valide.
Une variation du gradient par étapes selon la norme IEC-SAXS présentée ici est l'utilisation d'un gradient linéaire à la place. Bien qu'il soit possible de travailler avec autant d'étapes comme souhaité pour isoler les sous-pics en utilisant une élution par étapes, dans l'approche de gradient linéaire, il est nécessaire d'optimiser avec soin les conditions de gradient pour séparer les pics complètement avant de commencer l'SAXS expérience. Contexte soustraction dans cette approche pourrait être fait frame-sage et pourrait être vérifiée par la comparaison des images individuelles, mais elle nécessite une manipulation de données plus avancées, et un logiciel dédié n'existe pas encore.
Le choix d'une colonne appropriée est critique pour les deux techniques, car il détermine la séparation des espèces macromoléculaires. des colonnes d'exclusion de taille diffèrent en capacité de chargement, la gamme de taille de macromolécules séparables, et la résolution, tandis que les colonnes d'échange d'ions varie dans le genre et la densitéde leurs charges immobilisées.
Bien que le protocole présenté ici est spécifique à la ligne de lumière BM29 de l'ESRF, l'adaptation à une autre ligne de lumière SAXS est, en principe, simple. Les principales exigences sont un flux suffisamment élevé de rayons X et un détecteur approprié (idéalement un seul comptage de photons), pour acquérir des données raisonnables signal-bruit dans la gamme de secondes ou moins, et un système de chromatographie en ligne de liquide capable de créer gradients. La mise en œuvre exacte serait, bien sûr, dépendra de l'environnement de ligne de faisceau local.
Les résultats obtenus sur D5 323-785 en utilisant les deux méthodes diffèrent légèrement. Le rayon de giration est légèrement plus petite pour les données d'IEC que pour les données SEC et le minimum local de la courbe de diffusion sont décalés vers un peu plus grande dispersion des vecteurs. Cela signifie que le D5 323-785 mesuré avec IEC-SAXS est légèrement plus compact que le D5 323-785 mesuré avec SEC-SAXS. Cela pourrait be en raison de différences dans la préparation de l'échantillon, dans le temps entre la purification et de mesure (IEC est plus rapide), ou, moins probablement, à un contaminant dans l'échantillon SEC-purifié. Les modèles de perles obtenues de manière totalement indépendante avec les deux méthodes sont comparables (Figure 1 H). 323-785 D5 montre le creux, la structure attendue 18 hexamérique.
En conclusion, l' échange d' ions en ligne et de chromatographie d'exclusion stérique en ligne sont importants procédés de purification biochimiques qui peuvent être couplés directement à SAXS 6,7,9-12,25,26. La soustraction des données IEC-SAXS arrière-plan est un peu plus difficile et ambiguë que pour SEC-SAXS, mais il est néanmoins possible. Selon les propriétés biophysiques de la protéine d'intérêt, à la fois SEC et IEC-SAXS permettent l'optimisation de la séparation des espèces avec des avantages inhérents. Fournir l'esprit que les étapes de validation (comme décrit) sont correctement observés, les données résultantes peuvent être analyséesh la confiance, et les modèles peuvent être déterminées en utilisant les outils standards disponibles dans la communauté. Ensemble, les deux techniques permettent la séparation en ligne pour une large gamme de macromolécules biologiques, fournissant des données non accessibles par des mesures statiques standard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol [DTT] | Euromedex | EU0006-B | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel | Biorad | 4561033 | |
| 2x Phusion Flash PCR Master Mix | ThermoFisher scientific | F 548 | |
| acetic acid glacial | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20104.298 | |
| Agarose D-5 | Euromedex | LF45130653 | |
| Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K | Millipore Ltd | UFC903024 | |
| Ampicillin sodium salt | Euromedex | EU0400-D | |
| Benzonase | Novagene | 70750-3 | |
| bromophenol blue | MERCK | 8122 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11231400 | |
| Econo-Pac 10 DG Desalting column | Bio-rad | 732-2010 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Glycerol | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 24388.295 | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405-C | |
| HindIII | Roche | 656313 | |
| HisSelect HF Nickel Affinity Gel | Sigma | H0537 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20252.295 | |
| Imidazole | AppliChem Panreac | A1073,0500 | |
| InstantBlue | Expedeon | ISB1L | |
| LB broth Miller | Fluka Analytical | L3152 | |
| MgCl2 | ICN Biomedicals Inc. | 191421 | |
| NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
| NcoI | Fermentas | ER0571 | |
| One Shot BL21 Star (DE3) | ThermoFisher scientific | C6010-03 | |
| pProEx HTb vector | Addgene | 10711018 | |
| Primer | Eurofins mwg operon | ||
| QIAprep Spin Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAquick PCR purification kid | QIAGEN | 28106 | |
| SDS | Sigma | 75746 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen life technology | S33102 | |
| T4 ligase | ThermoFisher scientific | EL0011 | |
| TEV | home made | ||
| TOP 10 | Invitrogen life technology | C404003 | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Uno Q 1R column | Bio-rad | 720 0011 | |
| β-mercaptoethanol | MPBiomedicals, LLC | 194834 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
| Camserver software | Dectris | n.a. | detector control software |
| DAMAVER | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to align ab initio models |
| DAMMIF | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | ab initio model reconstruction program |
| HPLC program Biologic Duo Flow | Bio-rad | ||
| HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
| ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
| PRIMUS | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program, which performs the manipulation with experimental SAXS |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | https://www.pymol.org/ | software for visualization |
| SUPCOMB | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to superimpose 3D structures |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioLogic Duo Flow | Biorad | ||
| BioLogic Biofrac Fraction collector | Biorad | ||
| HPLC system | Shimadzu | ||
| Labsonic P | Sartorius Stedim biotech | BBI8535108 |
References
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