Summary
Мы разработали методику количественного 3D в силикомарганца моделирования (q3DISM) церебрального амилоида-бета (Ар) фагоцитоза мононуклеарных фагоцитов в грызунах моделях болезни Альцгеймера. Этот метод может быть обобщен для количественному практически любого фагоцитарной события в естественных условиях.
Abstract
Нейровоспаления в настоящее время признается в качестве основного этиологического фактора в развитии нейродегенеративных заболеваний. Мононуклеарных фагоцитов врожденные иммунные клетки, ответственные за фагоцитоза и обезвреживания мусора и наносов. Эти клетки включают CNS-резидентов макрофаги, известные как микроглии и мононуклеарных фагоцитов Проникнув с периферии. Световая микроскопия чаще всего используется для визуализации фагоцитоз в грызуна или образцов мозга человека. Тем не менее, качественные методы не предоставили окончательные доказательства фагоцитоза в естественных условиях. Здесь мы опишем количественный 3D моделирования в силикомарганца (q3DISM), надежный метод , позволяющий для истинного 3D количественному амилоида-бета (Ар) фагоцитоза мононуклеарных фагоцитов в моделях на грызунах Болезнь Альцгеймера (AD). Способ включает флуоресцентно визуализируя A & beta; инкапсулируются в фаголизосомах в разделах мозга грызуна. Большие Z-мерное конфокальной наборов данных затем 3D реконструированы для количественного A &# 946; пространственно локализуется в пределах фаголизосомы. Мы демонстрируют успешное применение q3DISM к мыши и крысы мозга, но эта методика может быть расширена до практически любого события в фагоцитарной любой ткани.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD), самый распространенный возраст слабоумие 1, характеризуется церебрального амилоида-β (Ар) накопления как "старческие" бета-амилоидных бляшек, хронический нейровоспаления низкого уровня, таупатия, гибель нейронов, а также когнитивные нарушения 2 , В AD мозге пациентов, нейровоспаления предназначается под воздействием реактивной астроциты и мононуклеарных фагоцитов (называемый микроглии, хотя их центральных против периферического происхождения , остается неясным) , окружающих A & beta ; 3 -х месторождений. Как врожденной иммунной часовыми ЦНС, микроглии централизованно расположены, чтобы очистить мозг A & beta. Тем не менее, микроглии набор в A & beta ; бляшек сопровождается очень мало, если таковые имеются, Ар фагоцитоза 4,5. Одна из гипотез является то, что микроглии изначально нейропротективная путем phagocytozing небольших сборок A & beta. Тем не менее, в конце концов, эти клетки становятся нейротоксическое, как подавляющее бремя Ар и / или связанных с возрастом функциональной Decline, провоцирует микроглии в дисфункциональной провоспалительного фенотипа, способствуя нейротоксичность и снижение когнитивных 6.
Последние по всему геному ассоциации исследований (GWAS) определили кластер AD аллели риска , принадлежащих к основным врожденных иммунных путей 7 , которые модулируют фагоцитоз 8-11. Следовательно, иммунный ответ на церебрального амилоида стала одной из основных областей интереса, как с точки зрения понимания AD этиологию и для разработки новых терапевтических подходов 12-14. Тем не менее, существует насущная потребность в методологии оценки фагоцитоза Ар в естественных условиях. Для решения этой неудовлетворенной потребности, мы разработали количественное 3D в силикомарганца моделирования (q3DISM) , чтобы включить истинное 3D количественное церебральным Ар фагоцитоза мононуклеарных фагоцитов в моделях грызунов болезнь Альцгеймера, как болезнь.
Ограничено только в той степени, в которой они перепросматривать болезни, животных моделяхоказались бесценными для понимания AD pathoetiology и для оценки экспериментальной терапии. В связи с тем, что мутации в генах пресенилин (PS) и амилоид белка предшественника (АРР), независимо друг от друга вызывают аутосомно-доминантный AD, эти мутантные трансгены широко используются для создания трансгенных моделей на грызунах. Трансгенные мышей APP / PS1 одновременно "шведский совместной экспрессии" мутант человеческого APP (APP SWE) и А экзон 9 мутант человеческого пресенилина 1 (PS1ΔE9) , присутствующие с ускоренным церебральным амилоидозом и нейровоспаления 15,16. Кроме того, мы сгенерировали би-трансгенных крыс coinjected с APP SWE и PS1ΔE9 конструкций (линия TgF344-AD, на фоне Фишер 344). В отличие от трансгенных моделей мышей церебрального амилоидоза, крысы TgF344-AD развить церебральный амилоид , который предшествует таупатия, апоптический потерю нейронов и поведенческие нарушения 17.
В этом докладе мы опишем протокол для IMMunostaining микроглии, фаголизосомах и A & beta; депозиты в срезах мозга мышей APP / PS1 и крыс TgF344-AD, а также приобретение больших Z-мерных конфокальных изображений. Мы подробно в силикомарганца генерации и анализа истинных 3D реконструкций из конфокальной наборов данных , позволяющих количественно оценивать поглощения Ар в микроглии фаголизосомах. В более широком смысле, методология , что мы здесь подробно могут быть использованы для количественной оценки практически любых форм фагоцитоза в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Постановка исследовательской этики: Все эксперименты с участием животных , подробно описанные здесь , были одобрены Университета Южной Калифорнии Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) и осуществляется в строгом соответствии с национальными институтами руководящих принципов охраны здоровья и рекомендации от ассоциации по оценке и аккредитации лаборатории Animal Care International.
1. Грызун Изоляция мозга и подготовка к иммунным окрашиванием
1 ДЕНЬ:
- Поместите крыс в возрасте TgF344-AD (14-месячного) или APP / PS1 мышей (12-месячного) при непрерывной глубокой изофлурановым анестезии (4%). Оценка глубины анестезии с помощью пальца щепоткой и отсутствие абстинентного рефлекса.
- Разрезать обе стороны грудной клетки и поднимите, чтобы обнажить сердце. Вставьте 23 G иглу в левый желудочек сердца и сделать небольшой надрез в правое предсердие. Переходим к обескровливания по transcardial перфузией охлажденным льдом фосфатно-солевым буферным раствором(PBS), с помощью перистальтического насоса (30 мл для мышей, в 150 - 200 мл для крыс).
- Сделать хвостового срединный разрез в коже и медленно перемещайте кожу и мышцы в сторону. Прорезать в верхней части черепа по средней линии и между глазами. Удалите костные пластины и изолировать весь мозг из черепа.
- Поместите мозг в корональной матрицу мозга грызуна и порезать его на четвертинки. Выдержите задние четверти O / N (16 ч) параформальдегида фиксаторе (4% PFA в PBS) при 4 ° С. Вымойте 3x в PBS, а затем передать в 70% этанола. Внимание: PFA является токсичным и должны быть обработаны в соответствии с химическим капотом с соответствующим оборудованием индивидуальной защиты.
ДЕНЬ 2:
- Поместите четверти мозг в заливочных кассетами и постепенно обезвоживает ткани в последовательно более концентрированным 1 ч этанола ванны (70%, 80%, 95% и 100% х3).
- Очистить этанол из ткани с тремя последовательными 100% ванны ксилола (1 ч каждый). Внимание: Ксилол является токсичным и шульд быть обработаны под химическим капотом с соответствующим оборудованием индивидуальной защиты.
- Встраивание ткани в парафиновых блоков после двух расплавленного парафина воска ванны (56 - 58 ° C, 90 мин каждая).
ДЕНЬ 3:
- Вырезать 10 мкм толщиной секций залитых парафином мозга с использованием микротома. Dip участки в водяной бане (50 ° С в течение 1 мин) и обратиться к предметные стекла микроскопа. Оставьте слайды высохнуть O / N, что обеспечивает адгезию тканей к слайду.
2. Иммунологическое
Примечание: Различные комбинации антител могут быть использованы для окрашивания процедуры, описанной ниже. Антитела коктейли , совместимые с тканью мозга у крыс и мышей приведены в таблице 1.
ДЕНЬ 4:
- Deparaffinize срезы головного мозга с использованием 2x 100% ванны ксилола (12 мин каждый).
- Увлажняет срезы головного мозга в последовательных ваннах этанол - 100% в течение 10 мин, 95% в течение 5 мин, 80% в течение 10 мин и, наконец, 70% в течение 15 мин - followed от 3х стирок PBS [5 мин при комнатной температуре, с легким перемешиванием]. В то же время, тепло поиска раствор антигена до 95 - 97 ° C на плитке с магнитной мешалкой при перемешивании.
- Инкубировать срезы головного мозга в растворе антигена при 95 поиска информации - 97 ° С в течение 30 мин. Затем промойте 3 раза в PBS (5 мин при комнатной температуре, с легким перемешиванием).
- Быстро сохнут слайдов с использованием тонких дворники задач, чтобы избежать высыхания тканей, и нарисуйте гидрофобный барьер вокруг области ткани с гидрофобным барьерного ручкой. Заполнить область окруженную ткани с блокирующим буфером [PBS, содержащим 0,3% Тритона Х-100 и 10% Нормальная Осел сыворотка (НСР)], и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч в увлажненной камере.
- Заменить блокирующий буфер с Iba1 первичным антителом (разбавление в блокирующем буфере) маркировать мононуклеарных фагоцитов, и инкубировать O / N при 4 ° С во влажной камере. Для хостов антител и рабочих разведений, см таблицу 1 и таблицу материалов.
ДЕНЬ 5:
- Полосканиепервичное антитело с 3x PBS ванны (5 мин при комнатной температуре с легким перемешиванием). Инкубируйте с флуоресцентным вторичным антителом (сопряженного с флуорофором эмиссии 594 нм) в течение 1 ч (в блокирующем буфере при комнатной температуре в темноте) с последующим 3x PBS ванны (5 мин при комнатной температуре с легким перемешиванием). В это время, поддерживать участки в темноте, чтобы избежать флуоресцентного отбеливания сигнала.
ДЕНЬ 6 - 7:
- Повторите шаги 2.5 и 2.6 с CD68 (крысиный мозг) или LAMP1 (мышь ткани) антитела и соответствующие вторичные антитела (в сочетании с флуорофором излучения 488 нм) для обозначения фаголизосомах.
День 7 - 8:
- Повторите шаги 2.5 и 2.6 с OC (крысы ткани) или антитела 4G8 (мозг мышей) и соответствующими вторичными антителами (в сочетании с 647 нм) флуорофора маркировать A & beta; депозиты.
Примечание: В качестве альтернативы, 6E10 антитела могут быть успешно использованы как на мышей и крыс ткани. Для получения соответствующих комбинаций антител, смотри таблицу материалов - Разрешить разделы полностью высохнуть O / N при комнатной температуре в темноте. Затем крышка образцы с покровным заверенного флуоресцентных монтажными средах, содержащих DAPI.
3. Приобретение Большой Z-стек конфокальной Datasets
Примечание: Этот протокол требует, полностью автоматизированный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный объективом 60X и 405 нм, 488 нм, 594 нм и 647 нм лазеров. Все оборудование управляется компьютером с помощью визуализации и управления лазером программного обеспечения. До начала протокола обработки изображений, питание на компьютере, эпифлуоресцентной лампы, микроскоп, лазеры и камеры.
ДЕНЬ 9:
- Выберите цель 60X микроскоп. Добавьте масло погружения в объектив, и поместить образец на держатель микроскопа этап слайд. Поднимите цель, пока масло не вступает в контакт с горкой. Регулировка фокальной плоскости, чтобы определить местонахождение амилоидных бляшек в гиппокампа или коры головного мозга с использованием эпифлуоресцентной освещения через окуляры.
- Приобретать конфокальной IMвозраст активированных мононуклеарных фагоцитов, окружающих отложения амилоида в гиппокампе или коры головного мозга грызунов с помощью конфокальной микроскопии (60X увеличении, шаги г-газохода: 0,25 мкм <г <0,40 мкм, число ступеней 25 <п <35).
4. q3DISM
Примечание: Для того, чтобы дать значительные результаты, мы предлагаем проанализировать как минимум 3 кадра в животных / интересующей области. Для каждого изображения, обилие клеток для анализа могут меняться в зависимости от экспериментальных парадигм. В репрезентативных результатов , представленных в настоящем докладе, мы проанализировали 3 клеток / условие (например, мононуклеарные фагоциты , удаленные от или связанные с бляшек; показано на рисунках 1C - D и 2C - D).
ДЕНЬ 10:
- Анализ конфокальной наборов данных с научными 3D обработки и анализа изображений программное обеспечение колокализации (coloc) модуль для пространственной близости Iba1 / CD68 (крысы ткани) или Iba1 / LAMP1 (мыши) ткани окрашивания во всех Z-плоскостях одновременно.Создание Iba + / CD68 + или Iba + / LAMP1 + колокализационные каналов , которые соответствуют фаголизосомах в активированных мононуклеарных фагоцитов.
- Выберите TRITC для канала А (что соответствует Iba1 окрашивания в сочетании с 594 нм флуорофора) и FITC для канала В (что соответствует CD68 или ЛАМПА1 окрашивания в сочетании с 488 нм флуорофор). На правой стороне окна программного обеспечения для "проверки режима" установите флажок "порог", и для "интенсивности coloc", выберите "каналов источника".
- Нажмите "Изменить", чтобы выбрать 'coloc цвет' на правой стороне окна программы.
- Для каждого канала независимо друг от друга, настроить пороговые значения для включения конкретного окрашивания и исключить фон / неспецифические сигналы. После настройки, не изменяются пороги между изображениями для обеспечения непредвзятого анализа. В колокализованы вокселей (пикселей из всех Z-стеки) будут отображаться в цвете, выбранном в шаге 4.1.2 во всех Z-стеки SIM-картыultaneously.
- Нажмите на кнопку "построить coloc канал". Колокализация канал, созданный появится в окне регулировки дисплея.
- Нажмите на канале coloc, чтобы открыть статистику канала. '% От объема / материала А выше порога колокализованы' представляет% сигнала Iba1 (вокселей, соответствующих 594 нм флуорофора) локализуется с LAMP1 или CD68 сигнала (вокселей, соответствующие 488 нм флуорофора). Проще говоря, это объем моноцитов , занимаемая фаголизосомах (см рисунки 1С и 2С).
Примечание: '% от объема / материала Б выше порога колокализованы' соответствует% от LAMP1 или CD68 сигнала локализуется с Iba1. Это должно быть близко к 100%, а фаголизосомах являются внутриклеточными структурами. Значения основаны на соотношении сигнала от всех Z-стеки выше порога локализуется.
- С помощью модуля coloc, анализировать coloc канал, созданный на шаге 4.1, для пространственной близости с OC (TI крысыСГУП) или 4G8 (мышь ткани) A & beta; сигналы. Это позволяет количественного A & beta; инкапсулированный в фаголизосомах.
- Выберите канал, A coloc набор данных (соответствующий Iba1 / CD68 или Iba1 / LAMP1 coloc канал, созданный на шаге 4.1) и Cy5 для канала В (что соответствует OC или 4G8 окрашивания в сочетании с 647 нм флуорофора).
- Построить канал coloc как описано в пунктах 4.1.2 4.1.5.
- Нажмите на канале coloc, чтобы открыть статистику канала. '% От объема / материала А выше порога колокализованы' представляет% от Iba1 / LAMP1 или Iba1 / CD68 (вокселей, соответствующий coloc канала, построенного на этапе 4.1.5.) Локализуется с OC или 4G8 сигнала (вокселей, соответствующий 647 нм флуорофор). Это объем phagolysosomal занимают A & beta ; (см рисунки 1D и 2D).
Примечание: '% от объема / материала Б выше порога колокализованы' соответствует% от общего сигнала Ар локализуется с фаголизосомах.Это может быть использовано для оценки доли общей суммы вкладов A & beta; инкапсулировать в фаголизосомах (не показано в настоящем репрезентативные результаты).
- Используйте превзойдет модуль для восстановления конфокальной стеки изображения и создавать 3D-модели A & beta; инкапсулированные в моноцитов фаголизосомах.
- В окне "настройка изображения", выберите TRITC (показывать только Iba1 окрашивание). В окне "Свойства тома" выберите "добавить новую поверхность.
- На этапе '1/5 алгоритма ", в" настройки ", выберите" поверхность ". Кроме того , в "цвет", выберите тип цвета в палитре или RGB и регулировать прозрачность (красный устанавливается в размере 60% прозрачности в рисунках 1В и 2В). Установите флажок "выбрать интересующую область. Нажмите "Далее.
- На этапе «2/5 области , представляющей интерес," нарисуй окно вокруг ячейки интереса путем корректировки х, у и г координаты (см белые коробки на рисунках 1А 2А). Нажмите "Далее.
- На этапе '3/5 источник канала ", выберите исходный канал TRITC. Установите флажок "гладкий," и установить площадь поверхности уровень детализации до 0,4 мкм. Для "пороговым" выберите абсолютную интенсивность. Нажмите "Далее.
- На этапе "4/5 порога" отрегулировать порог так, что объем, созданный перекрывается полностью с сигналом канала TRITC. Нажмите "Далее.
- На шаге '5/5 классифицируют поверхности "в разделе" Тип фильтра "выберите объекты в зависимости от их размера, которые будут включены или исключены из объемов, которые будут созданы. Нажмите кнопку Готово, выполните все шаги создания и выхода из мастера.
- Повторите шаги 4.3.1 для 4.3.6 для создания 3D - поверхности для канала FITC (LAMP1 + или CD68 + фаголизосомах).
- Повторите шаги 4.3.1 для 4.3.6 для создания 3D - поверхности для канала Cy5 (OC + или 4G8 + A & beta ; депозиты).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя методику многостадийного для q3DISM подробно описано выше, мы можем количественно оценить поглощение Ар в моноцитов фаголизосомах в мозге APP / PS1 мышей (рисунок 1) и крыс TgF344-AD (рисунок 2). Таким образом, методология q3DISM позволило анализ мононуклеарных фагоцитов в мышей и крыс моделей AD. Интересно отметить , что объем , занимаемый CD68 + фаголизосомах значительно увеличивается в Iba1 + мононуклеарных фагоцитов , связанных с по сравнению с далеким от бляшек как в APP / PS1 мышей (рис 1B, C) и крыс TgF344-AD (рис 2B, C). Эти данные показывают, что одноядерные фагоциты возле бляшек готова к фагоцитоза по сравнению с клетками, расположенными вдали от зубного налета. Для того , чтобы проиллюстрировать диапазон данных от окрашивания различных конформеров A & beta ; , мы использовали различные антитела для мышей и крыс ткани (подробно в TaBLE 1 и обсуждение) - мы не ищем непосредственно сравнивать мышей и крыс модели AD в отношении Ар фагоцитоза. Тем не менее, это было отметить , что бляшки связаны мононуклеарных фагоцитов увеличилось поглощение Ар у мышей APP / PS1 по сравнению с клетками , удаленных от бляшек (рис 1D). Крыс TgF344-AD было очень скромное поглощение Ар фибрилл в целом, и никаких изменений в Ар фибрилл фагоцитоза в зависимости от расстояния от бляшек (рис 2D).
Таблица 1: Иммунологическое мононуклеарных фагоцитов, фаголизосомах и амилоида-β в ткани головного мозга от APP / PS1 мышей или крыс TgF344-AD. Крысы или мыши специальные коктейли антител перечислены с их соответствующего хоста в скобках. Цвета указывают на флуорофор, используемый для вторичного антитела. Красный: Alexa Fluor 594; зеленый: Alexa Fluor 488;пурпурного: Alexa Fluor 647.
Рисунок 1: Визуализация и количественное определение амилоида-бета Фагоцитоз в головном мозге APP / PS1 мыши. (A) конфокальной изображения срезов мозга от APP / PS1 мыши , показывая Iba1 + клеток (красный), LAMP1 + фаголизосомах (зеленый) и 4G8 + амилоидных отложений (Magenta). Врезка 1 выдвигает на первый план мононуклеарных фагоцитов далекий от зубного налета, в то время как вставка 2 показывает мононуклеарных фагоцитов, связанный с налетом. Шкала бар обозначает 50 мкм. Меньшие панели справа являются утолщения из Iba1, LAMP1 и 4G8 сигналы в вставках 1 и 2. (B) 3D реконструкции Iba1, LAMP1 и сигналы 4G8 для вставках 1 и 2. Шкала столбика обозначает 3 мкм. (C) Количественный Iba1 + объема мононуклеарных фагоцитов , занимаемого LAMP1 + фаголизосомах. (
Рисунок 2: Визуализация и количественное определение амилоида-бета Фагоцитоз в TgF344-AD Rat Brains. (A) конфокальной изображения срезов мозга от TgF344 в AD-крысы показывая Iba1 + клеток (красный), CD68 + фаголизосомах (зеленый) и OC + растворимый фибриллярная & # 946; (Пурпурного). Врезка 1 выдвигает на первый план мононуклеарных фагоцитов далекий от зубного налета, в то время как вставка 2 показывает мононуклеарных фагоцитов, связанный с налетом. Шкала бар обозначает 50 мкм. Меньшие панели справа являются утолщения из Iba1, CD68 и OC сигналы в вставках 1 и 2. (B) 3D реконструкции Iba1, CD68 и OC сигналов для вставках 1 и 2. Шкала столбика обозначает 3 мкм. (C) Количественный Iba1 + объема мононуклеарных фагоцитов , занимаемого CD68 + фаголизосомах. (D) Количественное внутриклеточного CD68 + phagolysosomal объема , занимаемого OC + А. Значения основаны на соотношении сигнала (вокселей) выше порогового значения, которые локализуется. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (N = 6 клеток) для мононуклеарных фагоцитов далеких от бляшек (1), или связанной с бляшками (2). ** Р <0,01 по Т-критерию Стьюдента.rge.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол , который мы описываем в настоящем докладе , для истинного 3D количественного фагоцитоза Ар в естественных условиях с помощью мононуклеарных фагоцитов зависит от конкретной маркировки клеточных и субклеточных отсеков, а также A & beta ; месторождений. В частности, мы используем Iba1 (ионизированного кальция Связывание адаптера молекулы 1), белок , который участвует в мембранной рассердило и фагоцитоза при активации клеток 18, 19, окрасить мозговые мононуклеарных фагоцитов. В то время как Iba1 + клетки , как правило , рассматривается как мозг-резидент микроглии, остается возможным , что периферически инфильтрирующие мононуклеарных фагоцитов содержат подмножество immunolabeled клеток. Внутриклеточные фаголизосомах выявлены антитела , распознающие с членами семьи Лизосомные / эндосом-ассоциированный мембранный гликопротеин (LAMP): LAMP1 20 или CD68 21. Последнее в основном локализованы в лизосомы и эндосомы, с меньшей частью циркулирующего к клеточному Sтвое лицо. LAMP1 и CD68 антитела оба были успешно использованы в крыс и мышей ткани, а также решение по которому использовать в первую очередь зависит от множества других антител , используемых для совместного окрашивания (таблица 1). Важно иметь в виду, что различные антитела могут быть использованы для обнаружения A & beta. В ткани мыши, 4G8 (распознавания остатков человека и мыши аминокислот 17 - 24 из Ар пептида 22, рис 1) и 6Е10 (признание человеческого аминокислотных остатков 1 - 17 23, данные не показаны), были успешно использованы, позволяя обнаружение и количественное определение содержания в Ар LAMP1 + или CD68 + фаголизосомах присутствующих в Iba1 + мононуклеарных фагоцитов. Используя методику q3DISM, мы наблюдали повышенную нагрузку в Ар Iba1 + клеток , связанных с глобальным сокращением нагрузки в Ар мозге APPPS1 / IL-10 - / - мышей 16, в то время как другие показали поглощение уменьшилось в Ар Iba1 + < / SUP> клетки сопровождается увеличением нагрузки и Ар бляшек объема в головном мозге Rag-5xfAD мышей 24. Эти результаты свидетельствуют о том, что наблюдаемое явление является "моментальный снимок" активного фагоцитоза Ар, хотя наша методика не может быть использована для предсказания, если фагоцитированы материал эффективно переваривается и очищается.
В тканях крыс мы обнаружили A & beta ; депозиты с использованием OC (признавая растворимые A & beta 42 олигомеры / фибриллы 25,26, рис 2) или 6Е10 17 (не показан). Интересно, что очень мало OC + фибриллы присутствовали в моноцитов фаголизосомах в TgF344-AD мозга крыс. Это явление ранее сообщалось в APP23 трансгенных мышей с использованием immunogold окрашивания и 3D - реконструкция 27. Примечание: разнообразие антител для обнаружения различных видов / A & beta; конформеров доступны и потенциально могут быть проверены и использованы по усмотрению пользователя.
нт "> Наша методика q3DISM была принята нами и другими для количественного определения Ар фагоцитоз в контексте AD 16,24,28. Тем не менее, этот метод может быть адаптирован для оценки практически любых форм фагоцитоз. Кроме того , может быть применен к тканям кроме головного мозга, а также для других видов животных (включая человека). процедуры, описанные в данном протоколе опираются на стандартную иммунным окрашиванием, обнаруженный с флуоресценцией и визуализируют с помощью конфокальной микроскопии. в этом докладе мы использовали залитых парафином ткани в соответствии с рекомендациями предоставлены производителями антител. при желании, настоящий протокол также может быть оптимизирована для свежей ткани (встроенный в 2% агарозном геле в PBS). протокол также может быть оптимизирована для обнаружения фагоцитоз coaggregating белков. Это стало возможным с помощью окрашивания и приобретения изображения , состоящие из более 4 -х флуоресцентных цветов 29. В этом случае создание первого колокализационные канала (моноциты / фаголизосому) будет сопровождаться созданиемвторого колокализацию канала (агрегируются белка 1 / со-агрегируется белок 2). Затем, эти два канала будут использоваться для 3D-анализа и моделирования.Методика q3DISM ограничена, главным образом, специфичность и чувствительность, иммунное окрашивание качества антител, и колокализационные подхода. Эта многоступенчатая процедура имеет несколько потенциальных ловушек, которые могут повлиять на качество окрашивания и, следовательно, 3D поглощения количественное Ар. Первый критический шаг процедуры является выделение грызуна мозгов. Действительно, обработка осторожны ткани имеет основополагающее значение, чтобы избежать повреждения головного мозга и, чтобы гарантировать, что мозговые структуры остаются нетронутыми, когда разрезали. Во-вторых, время фиксации ткани является весьма важным, так как чрезмерная фиксация (более 16 ч в 4% PFA) ограничивает обнаружение субклеточных фаголизосомах и содержание Ар. Важно отметить, что последовательное окрашивание 1) моноциты, 2) фаголизосомах и 3) A & beta; имеет решающее значение для успеха этого метода. Это Essentриала использовать антитела consecutively- не одновременно. Кроме того, приобретение Z-стеков конфокальных изображений имеет огромное значение, так как 3D моделирование клеток, фаголизосомах и Ар пептида, а также колокализация анализов зависит от качества визуализации клеточных и субклеточных структур по толщине среза ткани. И, наконец, настройка порогов в программном обеспечении имеет решающее значение для 3D моделирования и анализа колокализацию. Действительно, пороговые значения для различных каналов должны быть тщательно подобраны, так как они будут определять, какой сигнал включен (специфический) или исключить (фон) из анализа. Он также имеет важное значение, что пороги, выбранные остаются неизменными между образцами в случае сравнения различных животных / образцов. До сих пор, классическая immunohistostaining, магнитно - резонансная томография и позитронно - эмиссионной томографии были методы визуализации выбора для визуализации в естественных условиях и количественного A & beta ;30. Несмотря на то, весьма полезно для крупномасштабного количественного амилоида в головном мозге грызунов или пациентов с болезнью Альцгеймера, эти методы неэффективны для визуализации внутриклеточного A & beta. Другие методы с использованием конфокальной микроскопии, флуоресцентной спектроскопии и проточной цитометрии существуют и были использованы нами и другими , чтобы различать и количественно внутриклеточное содержание Ар в пробирке 16,31,32. Immunogold окрашивание в сочетании с 3D - реконструкцией ранее использовался , чтобы подчеркнуть отсутствие амилоидных фибрилл в пределах микроглии в естественных условиях в APP23 трансгенных мышей 27, и еще одно исследование успешно использовали конфокальной микроскопии и 3D реконструкции поверхности микроглии-ассоциированной с бета-амилоидных бляшек , чтобы показать ограниченный A & beta взаимодействие и поглощение 33. Однако эти методы не позволяют количественному внутригрупповых phagolysosomal видов Ар. Другие недавно разработали флуоресцентный на основе анализа в естественных условиях позволяет измерятьфагоцитарной активности периферических макрофагов у крыс 34. Этот метод позволяет изобретательно для количественного флуоресцентного bioprobes в фаголизосомах в естественных условиях, тем не менее, данные , доступные до сих пор ограничены по периферии.
Насколько нам известно, q3DISM первый метод, который дает 3D-визуализации и количественного определения фагоцитоза в Ар мозге моделей с грызунами AD. Этот грозный инструмент, несомненно, проложит путь к более глубокому пониманию мозга Ар фагоцитоза, а также может оказаться полезным и в других контекстах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23 G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10x | Bioland Scientific | PBS01-02 | Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10x | DAKO | S1699 | Working concentration 1x |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1,000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. |
References
- Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
- Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774 (2010).
- Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
- Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
- Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
- Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
- Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949 (2012).
- Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
- Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
- Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185 (2012).
- Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
- Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
- Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
- Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
- Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
- Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
- Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
- Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
- Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33 (2015).
- Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).
- Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
- Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
- Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
- Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
- Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).
