Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Kvantitativ 3D doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

Vi udviklede en metode til kvantitativ 3D in silico modellering (q3DISM) af cerebral amyloid-β (Ap) fagocytose af mononukleære fagocytter i gnavermodeller for Alzheimers sygdom. Denne metode kan generaliseres til kvantificering af næsten enhver fagocytisk begivenhed in vivo.

Abstract

Neuroinflammation er nu anerkendt som en vigtig ætiologisk faktor i neurodegenerativ sygdom. Mononukleære fagocytter er medfødte immunceller er ansvarlige for fagocytose og clearance af snavs og efterladenskaber. Disse celler omfatter CNS-residente makrofager kendt som mikroglia og mononukleære fagocytter infiltrerer fra periferien. Lysmikroskopi har generelt været brugt til at visualisere fagocytose i gnavere eller menneskelige hjerne prøver. Imidlertid har kvalitative metoder ikke givet endegyldige bevis for in vivo fagocytose. Her beskriver vi kvantitativ 3D i silico modellering (q3DISM), en robust metode giver mulighed for ægte 3D kvantificering af amyloid-β (Ap) fagocytose af mononukleære fagocytter i gnavere Alzheimers sygdom (AD) modeller. Fremgangsmåden involverer fluorescerende visualisering Ap indkapslet i phagolysosomes i gnaver hjernesektioner. Store z-dimensionelle konfokale datasæt derefter 3D rekonstrueres til kvantificering af A &# 946; rumligt colocalized inden fagolysosomet. Vi viser den vellykkede anvendelse af q3DISM til muse- og rottehjerner, men denne metode kan udvides til stort set alle fagocytisk begivenhed i helst væv.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alzheimers sygdom (AD), den mest almindelige aldersrelateret demens 1, er karakteriseret ved cerebral amyloid-β (Ap) akkumulering som "senile" p-amyloid plaques, kronisk lavt niveau neuroinflammation, tauopati, neurontab og kognitive forstyrrelser 2 . I AD patient hjerner, er neuroinflammation øremærket af reaktiv astrocytter og mononukleære fagocytter (benævnt mikroglia, selv om deres centrale vs. perifer oprindelse er fortsat uklart) omgiver Ap indskud 3. Da de medfødte immunforsvar vagtposter i CNS, er mikroglia centralt placeret for at rydde hjernen Ap. Imidlertid er mikroglial rekruttering til Ap plaques ledsaget af meget lidt, om nogen, Ap fagocytose 4,5. En hypotese er, at mikroglia er oprindeligt neurobeskyttende ved fagocyterende små forsamlinger Ap. Men i sidste ende disse celler bliver neurotoksisk som overvældende Ap-byrde og / eller aldersrelaterede funktionelle decline, provokerer mikroglia i en dysfunktionel proinflammatorisk fænotype, der bidrager til neurotoksicitet og kognitiv tilbagegang 6.

Nylige genom-dækkende Association Studies (GWAS) har identificeret en klynge af AD risikofaktorer alleler tilhører centrale medfødte immun veje 7, som modulerer fagocytose 8-11. Derfor har immunresponset på cerebral amyloid aflejring blevet en vigtig område af interesse, både med hensyn til forståelsen af AD ætiologi og for at udvikle nye terapeutiske tilgange 12-14. Men der er et vitalt behov for metode til at vurdere Ap fagocytose in vivo. For at løse dette uopfyldt behov, har vi udviklet kvantitativ 3D i silico modellering (q3DISM) for at muliggøre ægte 3D kvantificering af cerebral Ap fagocytose med mononukleære fagocytter i gnavermodeller for Alzheimer-lignende sygdom.

Kun begrænset af det omfang, hvori de rekapitulere sygdom, dyremodeller harvist sig uvurderlig for forståelsen AD pathoetiology og for at vurdere eksperimentelle lægemidler. På grund af det faktum, at mutationer i Presenilin (PS) og amyloidprecursorprotein (APP) gener uafhængigt forårsage autosomal dominant AD, er disse mutante transgener blevet grundigt anvendt til at generere transgene gnavermodeller. Transgene APP / PS1-mus samtidigt at co-udtrykke "svenske" mutant human APP (APP SWE) og Δ exon 9 mutant human presenilin 1 (PS1ΔE9) til stede med accelereret cerebral amyloidosis og neuroinflammation 15,16. Endvidere har vi skabt bi-transgene rotter coinjiceret med APP swe og PS1ΔE9 konstruktioner (line TgF344-AD, på en Fischer 344 baggrund). I modsætning til transgene musemodeller af cerebral amyloidose, TgF344-AD rotter udvikler cerebral amyloid, der går forud tauopati, apoptotiske tab af neuroner, og adfærdsmæssig svækkelse 17.

I denne rapport beskriver vi en protokol for immunostaining mikroglia, phagolysosomes og Ap indskud i hjernen sektioner fra APP / PS1 mus og TgF344-AD rotter og erhvervelse af store z-dimensionelle konfokale billeder. Vi detaljer i silico generation og analyse af ægte 3D-rekonstruktioner fra konfokale datasæt tillader kvantificering af Ap optagelse i microgliale phagolysosomes. Mere bredt kan den metode, we detaljer her anvendes til at kvantificere stort set enhver form for fagocytose in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opgørelse af forskningsetik: Alle forsøg med dyr beskrevet heri blev godkendt af University of Southern California Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og udføres i nøje overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og anbefalinger fra Foreningen for Vurdering og Akkreditering af Laboratorium Animal Care International.

1. gnaver Brain Isolering og Forberedelse til Immunfarvning

DAG 1:

  1. Placer alderen TgF344-AD rotter (14 måneder gamle) eller APP / PS1 mus (12 måneder gamle) under kontinuerlig dyb isofluran anæstesi (4%). Vurdere dybden af ​​anæstesi ved tå knivspids og fraværet af tilbagetrækning refleks.
  2. Skær gennem begge sider af brystkassen og løft for at blotlægge hjertet. Sæt en 23 G nål ind i venstre ventrikel af hjertet og lave et lille snit i højre atrium. Fortsæt til afblødning af transcardial perfusion med iskold phosphatpufret saltvand(PBS) under anvendelse af en peristaltisk pumpe (30 ml til mus, som ligger 150 - 200 ml for rotter).
  3. Foretag en kaudal midtlinjeincision ind i huden og flytte huden og musklen til side. Skær gennem toppen af ​​kraniet langs midterlinien og mellem øjnene. Fjern knogleplader og isolere hele hjernen fra kraniet.
  4. Placer hjernen til en koronale gnaver hjerne matrix og skær den i kvarte. Inkuber posterior fjerdedele O / N (16 h) i paraformaldehyd fiksativ (4% PFA i PBS) ved 4 ° C. Vask 3x i PBS, og derefter overføre til 70% ethanol. Advarsel: PFA er giftigt og skal håndteres under en kemisk hætte med passende personlige værnemidler.

DAG 2:

  1. Placer hjerne fjerdedele til indlejring kassetter og gradvis dehydratisere væv i successivt mere koncentrerede 1 h ethanol bade (70%, 80%, 95% og 100% x3).
  2. Klart ethanol fra vævet med tre successive 100% xylen bade (1H hver). Advarsel: Xylen er giftigt og shOuld håndteres under en kemisk hætte med passende personlige værnemidler.
  3. Integrer væv i paraffinblokke efter to smeltede paraffin voks bade (56-58 ° C, 90 min hver).

DAG 3:

  1. Skær 10 um-tykke sektioner af paraffinindlejrede hjerner ved hjælp af en mikrotom. Dip sektioner i et vandbad (50 ° C i 1 min) og anvendelse på mikroskopobjektglas. Lad objektglassene tørre O / N, sikre væv vedhæftning til dias.

2. Immunfarvning

Bemærk: Forskellige kombinationer af antistoffer kan anvendes til farvning nedenfor beskrevne procedure. Antistof-cocktails er kompatible med hjernevæv fra rotter og mus er anført i tabel 1.

DAG 4:

  1. Afparaffiniser hjernen sektioner ved hjælp af 2x 100% xylen bade (12 min hver).
  2. Rehydrér hjernesnit i successive ethanol bade - 100% i 10 min, 95% i 5 min, 80% i 10 minutter, og til sidst 70% i 15 minutter - followed ved 3x PBS vasker [5 min ved RT, med lys agitation]. I mellemtiden, varme antigen hentning opløsning til 95 - 97 ° C på en varmeplade med magnetisk stang omrøring.
  3. Inkuber hjernesnit i antigen-genvinding opløsning ved 95 - 97 ° C i 30 min. Derefter vaskes 3x i PBS (5 minutter ved stuetemperatur, med lys omrøring).
  4. Hurtigt tørre dias ved hjælp af sarte opgave vinduesviskere at undgå væv tørring, og tegne en hydrofob barriere omkring vævet med en hydrofob barriere pen. Fyld omgivet vævsområde med blokerende buffer [PBS indeholdende 0,3% Triton X-100 og 10% Normal Donkey Serum (NDS)], og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time i et fugtigt kammer.
  5. Erstat blokerende buffer med Iba1 primært antistof (fortyndet med blokerende buffer) til at mærke mononukleære fagocytter, og inkuber O / N ved 4 ° C i et fugtigt kammer. For antistof værter og arbejder fortyndinger, se tabel 1 og tabel of Materials.

Dag 5:

  1. Skylleprimært antistof med 3x PBS bade (5 minutter ved stuetemperatur med let omrøring). Inkuber med fluorescerende sekundære antistof (konjugeret med et 594 nm emission fluorofor) i 1 time (i blokerende buffer ved stuetemperatur i mørke) efterfulgt af 3x PBS bade (5 minutter ved stuetemperatur med let omrøring). På dette tidspunkt, opretholde sektioner i mørke for at undgå fluorescerende signal blegning.

DAG 6-7:

  1. Gentag trin 2.5 & 2.6 med CD68 (rottehjerner) eller LAMP1 (muse væv) antistoffer og egnede sekundære antistoffer (kombineret med en 488 nm emission fluorofor) at mærke phagolysosomes.

DAG 7 - 8:

  1. Gentag trin 2.5 & 2.6 med OC (rotte væv) eller 4G8 (musehjerner) antistoffer og egnede sekundære antistoffer (koblet til en 647 nm fluorofor) til at mærke Ap aflejringer.
    BEMÆRK: Alternativt kan 6E10-antistof anvendes med succes både mus og rotte væv. For passende antistof kombinationer, se tabel Materialer
  2. Tillad sektioner til helt tørre O / N ved RT i mørke. Derefter omfatter enheder med en dækstrimmel forseglet af Fluorescensmonteringsmedium medier indeholdende DAPI.

3. Erhvervelse af Stor Z-stack Konfokal datasæt

Bemærk: Denne protokol kræver en fuldautomatisk laser konfokalt udstyret med et 60X objektiv og 405 nm, 488 nm, 594 nm og 647 nm lasere. Alt udstyr er computerstyret med billedbehandling og laser kontrol software. Forud for påbegyndelse af imaging-protokollen, tænd computeren, epifluorescerende lampe, mikroskop, lasere og kamera.

DAG 9:

  1. Vælg 60X mikroskopobjektiv. Tilføj immersionsolie på objektivet, og placer prøven på indehaveren mikroskopbordet dias. Hæv mål indtil olien kommer i kontakt med objektglasset. Juster brændplanet at lokalisere amyloide plaques i hippocampus eller hjernebarken ved hjælp epifluorescerende belysning gennem okularerne.
  2. Anskaf konfokal imalderen aktiverede mononukleære fagocytter omkringliggende amyloid aflejringer i hippocampus eller cortex af gnavere ved konfokal mikroskopi (60X forstørrelse, z-stack trin: 0,25 um <z <0,40 um, antal trin 25 <n <35).

4. q3DISM

Bemærk: For at give betydelige resultater, foreslår vi analysere minimum 3 billeder pr dyr / region af interesse. For hvert billede, kan den overflod af celler for at analysere variere eksperimentelle paradigmer. I de repræsentative resultater er vist i denne rapport, vi analyseret 3 celler / tilstand (f.eks mononukleære fagocytter fjernt fra eller forbundet med plaques, se figur 1C - D og 2C - D).

DAG 10:

  1. Analyser konfokale datasæt med videnskabelig 3D billedbehandling og analyse software colokalisering (Coloc) modul for geografisk nærhed af Iba1 / CD68 (rotte væv) eller Iba1 / LAMP1 (mus væv) farvning i alle z-planer samtidigt.Opret Iba + / CD68 + eller Iba + / LAMP1 + co-lokaliseringstoppe kanaler, der svarer til phagolysosomes inden aktiverede mononukleære fagocytter.
    1. Vælg TRITC for kanal A (svarende til Iba1 farvning koblet med 594 nm fluorofor) og FITC for kanal B (svarende til CD68 eller LAMP1 farvning koblet med 488 nm fluorofor). På højre side af softwaren vinduet for 'tilstand check, "vælg' tærskel 'og for' Coloc intensiteter, 'Vælg' kilde kanaler".
    2. Klik på 'Rediger' for at vælge 'Coloc farve' på højre side af softwaren vinduet.
    3. For hver kanal uafhængigt justere tærskler til at omfatte specifik farvning og udelukke baggrund / ikke-specifikke signaler. Når justeret, ændrer ikke tærskler mellem billeder for at sikre en uvildig analyse. De colocalized voxels (pixels fra alle z-stakke) vises i den valgte i trin 4.1.2 i alle z-stakke SIM farveultaneously.
    4. Klik på 'bygge Coloc kanal'. Den colokalisering Kanal oprettet vises i vinduet displayet justering.
    5. Klik på Coloc kanal til at åbne statistik kanal. Den '% af volumen / materiale A ovenfor tærskel colocalized «repræsenterer% af Iba1 signal (voxels svarende til 594 nm fluoroforen) colocalized med LAMP1 eller CD68-signal (voxels svarende til 488 nm fluorophor). Mere enkelt, er dette den monocyt volumen, der optages af phagolysosomes (se figur 1C og 2C).
      BEMÆRK: '% af volumen / materiale B ovenfor tærskel colocalized «svarer til% af LAMP1 eller CD68 signal colocalized med Iba1. Dette bør være tæt på 100%, da phagolysosomes er intracellulære strukturer. Værdier er baseret på forholdet mellem signal fra alle z-stakke er overskredet colocalized.
  2. Ved hjælp af Coloc modul, analysere Coloc kanal oprettet i trin 4.1 for geografisk nærhed med OC (rotte tissue) eller 4G8 (muse væv) Ap-signaler. Dette giver mulighed for kvantificering af Ap indkapslet i phagolysosomes.
    1. Vælg den kanal A Coloc datasæt (svarende til Iba1 / CD68 eller Iba1 / LAMP1 Coloc kanal oprettet i trin 4.1) og Cy5 for kanal B (svarende til OC eller 4G8 farvning kombineret med 647 nm fluorophor).
    2. Byg en Coloc kanal som beskrevet i trin 4.1.2 til 4.1.5.
    3. Klik på Coloc kanal til at åbne statistik kanal. Den '% af volumen / materiale A ovenfor tærskel colocalized «repræsenterer% af Iba1 / LAMP1 eller Iba1 / CD68 (voxels svarende til Coloc kanal bygget i trin 4.1.5.) Colocalized med OC eller 4G8 signal (voxels svarende til 647 nm fluorofor). Dette er den fagolysosomale volumen, der optages af Ap (se figur 1D og 2D).
      BEMÆRK: '% af volumen / materiale B ovenfor tærskel colocalized' svarer til% af den samlede Ap signal colocalized med phagolysosomes.Dette kan anvendes til at evaluere den del af de samlede Ap indskud indkapslet i phagolysosomes (ikke vist i de foreliggende repræsentative resultater).
  3. Brug overgå modulet til at rekonstruere de konfokale billedstakke og generere 3D-modeller af Ap indkapslet i monocyt phagolysosomes.
    1. I "display justering 'vindue, skal du vælge TRITC (kun at vise Iba1 farvning). I 'volumen egenskaber' vindue, skal du klikke på "tilføj ny overflade«.
    2. I trin '1/5 algoritme ", i" indstillinger "vælg' overflade.« Også i 'farve, "vælg farve typen i paletten eller RGB og justere gennemsigtigheden (rød er fastsat til 60% gennemsigtighed i figur 1B og 2B). Afkrydsningsfelt 'vælg region af interesse «. Klik næste.
    3. I Trin '2/5 område af interesse,' tegne et vindue omkring cellen af interesse ved at justere x, y og z-koordinater (se hvide kasser i figur 1A 2A). Klik næste.
    4. I trin '3/5 kilde kanal' skal du vælge TRITC kilde kanal. Marker afkrydsningsfeltet 'glat, "og sæt overfladeareal detalje-niveau til 0,4 um. For 'tærskling, "vælg absolut intensitet. Klik næste.
    5. I Trin '4/5 tærskel,' justere tærsklen således at volumenet skabt overlapper perfekt med TRITC kanalsignalet. Klik næste.
    6. I trin '5/5 klassificere overflader, "i afsnittet' filtertype," vælge objekter afhængig af deres størrelse, der skal medtages eller udelukkes fra de mængder, der skal oprettes. Klik finish udføre alle skabelse trin, og afslutte guiden.
    7. Gentag trin 4.3.1 til 4.3.6 for at skabe en 3D-overflade til FITC-kanal (LAMP1 + eller CD68 + phagolysosomes).
    8. Gentag trin 4.3.1 til 4.3.6 for at skabe en 3D-overflade for Cy5 kanal (OC + eller 4G8 + Ap indskud).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Brug metodik den etapevise for q3DISM beskrevet ovenfor, er vi i stand til at kvantificere Ap optagelse i monocyt phagolysosomes i hjerner af APP / PS1 mus (figur 1) og TgF344-AD rotter (Figur 2). Derfor har q3DISM metode aktiveret analyse af mononukleære fagocytter i muse- og rottemodeller af AD. Interessant er det volumen, der optages af CD68 + phagolysosomes steget betydeligt i Iba1 + mononukleære fagocytter forbundet med sammenlignet med fjernt fra plaques i både APP / PS1-mus (figur 1B, C) og TgF344-AD-rotter (figur 2B, C). Disse data viser, at mononukleære fagocytter nær plaques er klar til fagocytose sammenlignet med celler placeret væk fra pladen. For at illustrere rækken af data fra farvning forskellige Ap konformerer, vi anvendt forskellige antistoffer i mus og rotte væv (se nærmere i Table 1 og diskussion) - vi søger ikke direkte sammenligne mus og rotte modeller af AD med hensyn til Ap fagocytose. Ikke desto mindre var det bemærkelsesværdigt, at plak associeret mononukleære fagocytter var steget Ap-optagelse i APP / PS1-mus sammenlignet med celler fjernt fra plaques (fig 1D). TgF344-AD rotter havde meget beskedne optagelse af Ap fibriller samlet, og ingen ændring i Ap fibril fagocytose som funktion af afstand fra plaques (figur 2D).

tabel 1
Tabel 1: Immunfarvning mononukleære fagocytter, Phagolysosomes og Amyloid-β i hjernevæv fra APP / PS1 Mus eller TgF344-AD rotter. Rotte eller mus specifikke antistof-cocktails er angivet med deres respektive vært i parentes. Farver indikerer fluoroforen anvendt til det sekundære antistof. Rød: Alexa Fluor 594; grøn: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647.

figur 1
Figur 1: Visualisering og Kvantificering af Amyloid-β Fagocytose i APP / PS1 Mouse Brains. (A) Konfokal billeder af hjernen sektioner fra en APP / PS1 mus viser Iba1 + celler (rød), LAMP1 + phagolysosomes (grøn) og 4G8 + amyloide aflejringer (magenta). Indsat 1 fremhæver en mononukleær fagocyt fjernt fra pladen, mens indsatte 2 viser en mononukleær fagocyt forbundet med pladen. Scale bar betegner 50 um. Mindre paneler til højre er udvidelser af Iba1, LAMP1 og 4G8 signaler inden indsatse 1 og 2. (B) 3D rekonstruktion af Iba1, LAMP1 og 4G8 signaler til indsatse 1 og 2. Scale bar betegner 3 um. (C) Kvantificering af Iba1 + mononukleære fagocytsystem volumen besat af LAMP1 + phagolysosomes. ( + fagolysosomale volumen besat af 4G8 + Ap. Værdier er baseret på forholdet mellem signal (voxels) over tærskelværdien, der er colocalized. Data er vist som gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (n = 6 celler) for mononukleære fagocytter fjernt fra plaques (1), eller forbundet med plaques (2). ** P <0,01 ved t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Visualisering og Kvantificering af Amyloid-β Fagocytose i TgF344-AD rottehjerner. (A) Konfokal billeder af hjernesnit fra en TgF344-AD rotte viser Iba1 + -celler (rød), CD68 + phagolysosomes (grøn) og OC + opløselig fibrillært A & # 946; (Magenta). Indsat 1 fremhæver en mononukleær fagocyt fjernt fra pladen, mens indsatte 2 viser en mononukleær fagocyt forbundet med pladen. Scale bar betegner 50 um. Mindre paneler til højre er forstørrelser af Iba1, CD68 og OC signaler i mellemværker 1 og 2. (B) 3D rekonstruktion af Iba1, CD68 og OC signaler for mellemværker 1 og 2. Scale bar betegner 3 um. (C) Kvantificering af Iba1 + mononukleære fagocytsystem volumen besat af CD68 + phagolysosomes. (D) Kvantificering af intracellulær CD68 + fagolysosomale volumen besat af OC + Ap. Værdier er baseret på forholdet mellem signal (voxels) over tærskelværdien, der er colocalized. Data er vist som gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (n = 6 celler) for mononukleære fagocytter fjernt fra plaques (1), eller forbundet med plaques (2). ** P <0,01 ved t-test.rge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den protokol, som vi beskriver i denne rapport for ægte 3D kvantificering af Ap fagocytose in vivo ved mononukleære fagocytter afhængig særlig mærkning af cellulære og subcellulære rum samt Ap indskud. Specifikt anvender vi Iba1 (ioniseret-calciumbindende Adaptor molekyle 1), et protein, der er involveret i membranen ruffling og fagocytose ved celleaktivering 18, 19, til at farve cerebrale mononukleære fagocytter. Mens Iba1 + celler generelt betragtes som hjerne-resident mikroglia, er det fortsat muligt, at perifert infiltrerer mononukleære fagocytter omfatter en delmængde af immunolabeled celler. Intracellulære phagolysosomes er afsløret med antistoffer, der genkender medlemmer af det lysosomale / endosomale-associeret membran glycoprotein (LAMP) familie: LAMP1 20 eller CD68 21. Sidstnævnte er primært lokaliseret til lysosomer og endosomer, med en mindre fraktion cirkulerer til cellen sverflade. LAMP1 og CD68 antistoffer er begge blevet brugt med held i rotter og mus væv, og beslutningen om at bruge, er primært afhængig af væld af andre antistoffer anvendes til co-farvning (se tabel 1). Det er vigtigt at være klar over, at forskellige antistoffer kan anvendes til påvisning af Ap. I musevæv, 4G8 (genkende humane og muse aminosyrerester 17 - 24 ud af Ap-peptid 22, figur 1) og 6E10 (genkende humane aminosyrerester 1 - 17 ud 23, data ikke vist) er blevet anvendt med succes, hvilket tillader detektion og kvantificering af Ap-indhold i LAMP1 + eller CD68 + phagolysosomes stede i Iba1 + mononukleære fagocytter. Ved hjælp af vores q3DISM metode, observerede vi øget Ap belastning i Iba1 + celler i forbindelse med den globale reduktion af Ap belastning i hjernen hos APPPS1 / IL-10 - / - mus 16, mens andre viste nedsat Ap-optagelse i Iba1 + < / sup> celler ledsaget af øget Ap belastning og plak volumen i hjernen hos Rag-5xfAD mus 24. Disse resultater antyder, at den observerede fænomen er en "snapshot" af aktiv Ap fagocytose, selv om vores metodik ikke kan anvendes til at forudsige, om det fagocyteres materiale effektivt fordøjes og blokerede.

I rotter væv, vi har registreret Ap indskud ved hjælp OC (anerkende opløselige Ap 42 oligomerer / fibriller 25,26, figur 2) eller 6E10 17 (ikke vist). Interessant, meget lidt OC + fibriller var til stede i monocyt phagolysosomes i TgF344-AD rottehjerner. Dette fænomen er tidligere blevet rapporteret i APP23 transgene mus ved anvendelse immunguld-farvning og 3D-rekonstruktion 27. Bemærk: en række antistoffer til påvisning af forskellige Ap arter / konformere er tilgængelige og kan potentielt blive testet og ansat på brugerens skøn.

nt "> Vores q3DISM teknik er blevet vedtaget af os og andre til at kvantificere Ap fagocytose i forbindelse med AD 16,24,28. Imidlertid kan fremgangsmåden være indrettet til at evaluere stort set enhver form for fagocytose. Den kan også anvendes på væv andet end hjernen, og til andre dyrearter (herunder mennesker). de er beskrevet i denne protokol procedurer stole på standard immunfarvning, detekteres med fluorescens og filmede med et konfokal mikroskop. i denne rapport har vi anvendt paraffinindlejret væv efter retningslinjer billede af antistoffet fabrikanter. om ønsket kan den foreliggende protokol kunne også optimeres for friskt væv (indlejret i 2% agarose i PBS). kan protokollen også optimeres for at detektere fagocytose af coaggregating proteiner. Dette er gjort muligt ved farvning og erhverve billeder, der består af mere end 4 fluorescerende farver 29. i dette tilfælde ville oprettelsen af den første colokalisering kanal (monocyt / fagolysosomet) efterfølges af skabelseaf en anden colokalisering kanal (aggregeret protein 1 / co-aggregeret protein 2). Derefter vil de to kanaler anvendes til 3D-analyse og modellering.

Den q3DISM teknik er primært begrænset af specificitet og følsomhed immunfarvning, kvalitet af antistoffer, og colokalisering tilgang. Denne flertrins procedure har et par potentielle faldgruber, der kan påvirke kvaliteten af ​​farvningen og dermed 3D kvantificering af Ap-optagelse. Den første kritiske trin i proceduren er isoleringen af ​​gnaverhjerner. Faktisk omhyggelig væv håndtering er afgørende for at undgå skader på hjernen, og at sikre, at hjernens strukturer forbliver intakt, når sektioneret. Sekund, vævsfiksering tid er ganske vigtigt, da over-fiksering (mere end 16 timer i 4% PFA) begrænser påvisning af subcellulære phagolysosomes og Ap-indhold. Vigtigt er det, den successive farvning af 1) monocytter, 2) phagolysosomes og 3) Ap er afgørende for succes af metoden. Det er EssentIAL at bruge antistofferne consecutively- ikke samtidigt. Derudover, erhvervelse af Z-stack konfokale billeder er af yderste vigtighed, eftersom 3D modellering af celler, phagolysosomes og Ap-peptid såvel som co-lokalisering analyser afhænge af kvaliteten af ​​billeddannelse af cellulære og subcellulære strukturer gennem tykkelsen af ​​vævssnittet. Endelig justering af tærskelværdierne i softwaren er afgørende for 3D-modellering og for co-lokalisering analyse. Faktisk tærskler for de forskellige kanaler skal omhyggeligt valgt, da de vil være afgørende, hvilket signal er inkluderet (specifik) eller udelukket (baggrund) fra analysen. Det er også afgørende, at de tærskler valgte være konsekvent mellem prøverne i tilfælde af sammenligning af forskellige dyr / prøver. Hidtil har klassisk immunohistostaining, magnetisk resonans og positronemissionstomografi været de billeddannende metoder til valg til in vivo-visualisering og kvantificering af Ap30. Selvom meget nyttig for storstilet kvantificering af amyloid byrde i hjernen hos gnavere eller AD patienter, disse metoder er ineffektive til visualisering af intracellulær Ap. Andre teknikker, der anvender konfokal mikroskopi, fluorescens-spektroskopi og flowcytometri eksisterer og er blevet brugt af os og andre til at skelne og kvantificere intracellulær Ap indhold in vitro 16,31,32. Immunguld farvning kombineret med 3D-rekonstruktion er tidligere blevet anvendt til at fremhæve fraværet af amyloidfibriller inden mikroglia in vivo i APP23 transgene mus 27, og en anden undersøgelse med held anvendt konfokal billeddannelse og 3D overflade rekonstruktion af mikroglia-associeret med p-amyloid plaques at vise begrænset Ap interaktion og optagelse 33. Men disse teknikker ikke mulighed for kvantificering af intra-fagolysosomale Ap arter. Andre har for nylig udviklet en fluorescens-baseret in vivo-assay muliggør målingenaf fagocytisk aktivitet ved perifere makrofager i rotten 34. Denne metode sindrigt muliggør kvantificering af fluorescerende bioprobes i phagolysosomes in vivo, men data hidtil er begrænset til periferien.

Så vidt vi ved, q3DISM er den første metode, der giver 3D-visualisering og kvantificering af Ap fagocytose i hjerner fra gnavere AD-modeller. Denne formidable værktøj vil utvivlsomt bane vejen til en dybere forståelse af cerebral Ap fagocytose, og kan også vise sig nyttig i andre sammenhænge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7, (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16, (3), 229-236 (2015).
  4. Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330, (6012), 1774 (2010).
  5. Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28, (33), 8354-8360 (2008).
  6. Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39, (4), 886-890 (2011).
  7. Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518, (7539), 365-369 (2015).
  8. Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88, (4), 640-651 (2014).
  9. Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33, (12), 2949 (2012).
  10. Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. 1-13 (2013).
  11. Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
  12. Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. 314185 (2012).
  13. Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38, (11), 674-681 (2015).
  14. Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, (5), 593-607 (2013).
  15. Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17, (6), 157-165 (2001).
  16. Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85, (3), 534-548 (2015).
  17. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33, (15), 6245-6256 (2013).
  18. Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, (3), 855-862 (1996).
  19. Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88, (4), 844-856 (2004).
  20. Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (30), 11055-11060 (2014).
  21. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81, (6), 1607-1613 (1993).
  22. Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60, (6), 988-1009 (2008).
  23. Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (6), 1936-1940 (2006).
  24. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (9), 1316-1325 (2016).
  25. Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285, (47), 36945-36957 (2010).
  26. Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13594-13599 (2009).
  27. Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22, (3), 427-434 (2001).
  28. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7, (278), 33 (2015).
  29. Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6, (230), 46 (2014).
  30. Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59, (10), 940-947 (2006).
  31. Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (13), 7609-7614 (2000).
  32. Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36, (2), 577-589 (2016).
  33. Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36, (18), 5084-5093 (2016).
  34. Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12, (3), 239-246 (2015).
Kvantitativ 3D<em&gt; I Silico</em&gt; Modeling (q3DISM) af cerebral amyloid-beta Fagocytose i gnavermodeller af Alzheimers sygdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter