Summary
Wir entwickelten eine Methode für die quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-β (Aß) Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit. Dieses Verfahren kann für die Quantifizierung von praktisch jedem phagozytischen Ereignis in vivo verallgemeinert werden.
Abstract
Neuroinflammation wird nun als wichtiger ätiologischer Faktor bei der neurodegenerativen Erkrankung anerkannt. Mononukleäre Phagozyten sind angeborene Immunzellen verantwortlich für die Phagozytose und die Räumung von Schutt und Geröll. Diese Zellen sind ZNS-Makrophagen als Mikroglia bekannt und mononukleäre Phagozyten von der Peripherie zu infiltrieren. Die Lichtmikroskopie wurde allgemein verwendet worden, die Phagozytose in Nagetieren oder menschliche Gehirn Proben zu visualisieren. Allerdings haben qualitative Methoden nicht definitive Beweise für in vivo Phagozytose zur Verfügung gestellt. Hier beschreiben wir quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM), ein robustes Verfahren ermöglicht für echte 3D - Quantifizierung von Amyloid-β (Aß) Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetier Alzheimer-Krankheit (AD) Modelle. Das Verfahren beinhaltet das fluoreszenz VISUALISIEREN Aß innerhalb Phagolysosome in Nagetier Hirnschnitten verkapselt. Große z-dimensionale konfokalen Datensätze werden dann 3D für die Quantifizierung von A rekonstruiert &# 946; räumlich innerhalb des Phagolysosom colocalized. Wir demonstrieren die erfolgreiche Anwendung von q3DISM zu Maus- und Rattengehirnen, aber diese Methode kann in jedem Gewebe zu praktisch jeder phagozytischen Ereignis verlängert werden.
Introduction
Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Altersdemenz 1 wird durch die zerebrale Amyloid-β (Aß) ist eine Anreicherung als "senile" β-Amyloid - Plaques, chronische Low-Level - neuroinflammation, Tauopathie, Verlust von Neuronen charakterisiert und kognitive Störung 2 . In AD Patienten Gehirn wird bestimmt neuroinflammation durch reaktive Astrozyten und mononukleäre Phagozyten (bezeichnet als Mikroglia, obwohl ihre zentrale vs. peripheren Herkunft unklar bleibt) umgebende Aß Ablagerungen 3. Da die angeborene Immun Wächtern des ZNS, sind Mikroglia zentral Aß zu löschen Gehirn positioniert. Mikroglia Rekrutierung Aß - Plaques jedoch durch sehr wenig begleitet, wenn überhaupt, Aß Phagozytose 4,5. Eine Hypothese ist, dass Mikroglia zunächst neuroprotektive sind durch phagocytozing kleine Versammlungen von Aß. Doch schließlich werden diese Zellen neurotoxisch als überwältigend Aß Belastung und / oder altersbedingten Funktions decline, provoziert Mikroglia in einer dysfunktionalen proinflammatorischen Phänotyp, einen Beitrag zur Neurotoxizität und kognitive Abnahme 6.
Aktuelle genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben einen Cluster von AD Risiko - Allele Gehören Kern angeborenen Immunwege 7 , die 8-11 Phagozytose identifiziert modulieren. Folglich hat die Immunantwort auf die zerebrale Amyloid - Ablagerung ein bedeutendes Interessengebiet geworden, sowohl in Bezug auf AD Ätiologie zu verstehen und für neue therapeutische Ansätze zu entwickeln 14.12. Dennoch gibt es ein wesentliches Bedürfnis nach Methodik Aß Phagozytose in vivo zu bewerten. Um diesen ungedeckten Bedarf adressieren, haben wir quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM) zu ermöglichen , echte 3D - Quantifizierung von zerebralen Aß Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetiermodellen der Alzheimer-ähnliche Krankheit entwickelt.
nur durch das Ausmaß beschränkt, auf die sie Krankheit rekapitulieren, Tiermodelle habenbewiesen von unschätzbarem Wert für das Verständnis der AD pathoetiology und für experimentelle Therapeutika zu bewerten. Aufgrund der Tatsache, dass Mutationen in den Presenilin (PS) und Amyloid Precursor Protein (APP) Gene unabhängig autosomal dominant AD verursachen, sind diese mutierten Transgene wurden verwendet, umfassend transgene Nagetiermodellen zu erzeugen. Transgene APP / PS1 - Mäuse Koexpression gleichzeitig "Schwedisch" mutiertes menschliches APP (APP swe) und Δ Exon 9 mutierten humanen Presenilin 1 (PS1ΔE9) vorhanden mit beschleunigten zerebraler Amyloidose und neuroinflammation 15,16. Ferner haben wir bi-transgenen Ratten co - injiziert mit APP swe und PS1ΔE9 Konstrukte (Linie TgF344-AD, auf einem Fischer - 344 - Hintergrund) erzeugt. Im Gegensatz zu transgenen Mausmodellen von zerebraler Amyloidose entwickeln TgF344-AD - Ratten , die zerebrale Amyloid - 17 Tauopathie, apoptotischen Verlust von Neuronen und Verhaltens Beeinträchtigung vorausgeht.
In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll für die immunostaining Mikroglia, Phagolysosome und Aß-Ablagerungen in Hirnschnitten von APP / PS1-Mäusen und TgF344-AD Ratten und Erwerb von großen z-dimensionalen konfokalen Bildern. Wir Detail in silico Erzeugung und Analyse von echten 3D - Rekonstruktionen aus konfokalen Datensätze ermöglicht die Quantifizierung von Aß - Aufnahme in Mikroglia Phagolysosome. Allgemeiner gesagt, dass die Methodik ausführlich hier können wir nahezu jede Form der Phagozytose in vivo zu quantifizieren.
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Protocol
Erklärung der Forschungsethik: Alle Versuche mit hierin aufgeführten Tiere wurden von der University of Southern California Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) und durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und Empfehlungen der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Labor genehmigt Animal Care international.
1. Gehirn von Nagetieren Isolierung und Vorbereitung für Immunostaining
TAG 1:
- Legen Sie im Alter von TgF344-AD-Ratten (14 Monate alt) oder APP / PS1-Mäuse (12 Monate alte) unter Dauer tief Isoflurananästhesie (4%). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Zehe Prise und das Fehlen von Rückzugsreflex.
- Schneiden Sie durch beide Seiten des Brustkorbs und heben Sie das Herz aussetzen. Legen Sie eine 23 G-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens und machen einen kleinen Einschnitt in den rechten Vorhof. Fahren Sie mit dem Ausbluten von transkardialer Perfusion mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung(PBS) eine peristaltische Pumpe (30 ml für Mäuse; 150-200 ml für Ratten) verwendet.
- Machen Sie einen Schwanzmittelschnitt in die Haut und die Haut und Muskeln zur Seite schieben. Geschnitten durch die Oberseite des Schädels entlang der Mittellinie und zwischen den Augen. Entfernen Sie die Knochenplatten und isolieren das gesamte Gehirn aus dem Schädel.
- Legen Sie das Gehirn in einen koronalen Gehirn von Nagetieren Matrix und in Scheiben schneiden sie in Viertel. posterior Viertel inkubieren O / N (16 h) in Paraformaldehyd Fixierlösung (4% PFA in PBS) bei 4 ° C. Waschen 3x in PBS, und dann übertragen zu 70% Ethanol. Achtung: PFA ist giftig und sollte unter einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden.
TAG 2:
- Platzieren Gehirn Viertel in Einbettungskassetten und progressiv Gewebe entwässern in sukzessiv konzentrierter 1 h Ethanolbäder (70%, 80%, 95% und 100% x3).
- Klar Ethanol aus dem Gewebe mit drei aufeinanderfolgenden 100% Xylol Bäder (jeweils 1 h). Achtung: Xylol ist giftig und shOuld mit entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung unter einer chemischen Abzugshaube gehandhabt werden.
- Einbetten von Gewebe in Paraffinblöcken nach zwei geschmolzene Paraffinwachs Bäder (56-58 ° C, 90 min jeweils).
TAG 3:
- Schneiden Sie 10 um dicke Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Gehirne mit einem Mikrotom. Dip Abschnitte in ein Wasserbad (50 ° C für 1 min) und wenden auf Objektträger. Lassen Sie die Folien O / N, um sicherzustellen, Gewebe Haftung auf der Folie zu trocknen.
2. Immunostaining
Hinweis: Verschiedene Kombinationen von Antikörpern können für das Färbeverfahren eingesetzt werden unten beschrieben. Antikörper - Cocktails kompatibel mit Hirngewebe von Ratten und Mäusen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
TAG 4:
- Deparaffinisieren Gehirnschnitte mit 2x 100% Xylol Bäder (12 min jeweils).
- Rehydrieren Hirnschnitten in aufeinanderfolgenden Bädern ethanol - 100% für 10 min, 95% für 5 min, 80% für 10 min, und schließlich 70% für 15 min - followed durch 3x PBS Waschungen [5 min bei RT, mit Licht Agitation]. Inzwischen Lösungswärme Antigen-Retrieval auf 95-97 ° C auf einer Heizplatte mit Magnetstab gerührt wurde.
- Inkubieren Hirnschnitten in Antigen-Retrieval-Lösung bei 95-97 ° C für 30 min. Dann waschen 3x in PBS (5 min bei RT, mit Licht Agitation).
- Schnell trocken Dias heikle Aufgabe Wischer mit Gewebe ein Austrocknen zu verhindern, und mit einer hydrophoben Barriere Stift eine hydrophobe Barriere rund um den Gewebebereich zu ziehen. Füllen eingekreisten Gewebebereich mit Blockierungspuffer [PBS, enthaltend 0,3% Triton X-100 und 10% normalem Eselserum (NDS)] und für 1 h in einer befeuchteten Kammer bei RT inkubieren.
- Ersetzen Blockierungspuffer mit Iba1 primären Antikörper (in Blockierungspuffer verdünnt) mononukleären Phagozyten zu etikettieren, und Inkubieren O / N bei 4 ° C in einer befeuchteten Kammer. Siehe Antikörper - Hosts und Arbeitsverdünnungen, Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien.
TAG 5:
- Spülenprimärer Antikörper mit 3x PBS Bäder (5 min bei RT mit Licht Agitation). Inkubieren mit fluoreszierenden Sekundärantikörper (konjugiert mit einem 594 nm-Emission Fluorophor) für 1 h (in Blockierungspuffer bei RT im Dunkeln), gefolgt von PBS 3x Bäder (5 min bei RT mit leichtem Schütteln). Zu diesem Zeitpunkt halten Abschnitte im Dunkeln Fluoreszenzsignal Bleichen zu vermeiden.
Tag 6 - 7:
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 mit CD68 (Rattenhirnen) oder LAMP1 (Mausgewebe) Antikörper und geeignete Sekundärantikörper (in Verbindung mit einem 488-nm-Emissions Fluorophore) Phagolysosome zu beschriften.
TAG 7 - 8:
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 mit OC (Rattengewebe) oder 4G8 (Gehirn der Maus) Antikörper und einem geeigneten sekundären Antikörper (gekoppelt mit einem 647 nm Fluorophore) Aß Ablagerungen zu beschriften.
HINWEIS: Alternativ können 6E10 Antikörper erfolgreich sowohl auf Maus und Ratte Gewebe verwendet werden. Für eine entsprechende Antikörper - Kombinationen finden Sie in der Tabelle der Materialien - Lassen Abschnitte vollständig trocknen O / N bei RT im Dunkeln. Dann Abdeckung Proben mit einem Deckglas versiegelt durch Fluoreszenz Montage Medien mit DAPI.
3. Erwerb von großen Z-Stack konfokale Datensätze
Hinweis: Dieses Protokoll ein Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem 60X Objektiv und 405 nm, 488 nm, 594 nm und 647 nm Laser vollständig automatisiert erfordert. Alle Geräte sind Computer von Imaging- und Lasersteuerungssoftware gesteuert. Vor dem Bildgebungsprotokoll, Leistung auf dem Computer, epifluoreszenten Lampe, Mikroskop, Laser und Kamera zu beginnen.
TAG 9:
- Wählen Sie das 60X Mikroskopobjektiv. In Sionsöl auf die Linse, und legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch Diahalter. Heben Sie das Ziel, bis der Öl Kontakt mit der Folie macht. Stellen Sie die Fokusebene zu Amyloid-Plaques im Hippocampus oder Hirnrinde mit epifluoreszenten Beleuchtung durch die Okulare lokalisieren.
- Erwerben Sie konfokalen imAlter aktivierte mononukleäre Phagozyten Amyloid-Ablagerungen im Hippocampus oder Cortex von Nagetieren umgebenden durch konfokale Mikroskopie (60X Vergrößerung, z-Stapel Schritte: 0,25 & mgr; m <z <0,40 um, die Anzahl der Schritte 25 <n <35).
4. q3DISM
Hinweis: Um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, empfehlen wir Ihnen ein Minimum von 3 Bildern pro Tier / Region von Interesse zu analysieren. Für jedes Bild variiert die Fülle von Zellen zu analysieren, auf experimentellen Paradigmen abhängig. In den repräsentativen Ergebnisse in diesem Bericht gezeigt, analysierten wir 3 Zellen / Zustand (zB einkernigen Phagozyten entfernt von oder mit Plaques, siehe 1C - D und 2C - D).
TAG 10:
- Analysieren Sie konfokalen Datensätze mit wissenschaftlichen 3D-Bildverarbeitung und Analyse-Software Kolokalisation (coloc) Modul für die räumliche Nähe von Iba1 / CD68 (Rattengewebe) oder Iba1 / LAMP1 (Mausgewebe) Färbung in allen z-Ebenen gleichzeitig.Erstellen Sie Iba + / CD68 + oder Iba + / LAMP1 + Kolokalisierung Kanäle , die zu Phagolysosome innerhalb aktivierten mononukleären Phagozyten entsprechen.
- Wählen TRITC für Kanal A (entsprechend Iba1 Anfärbung gekoppelt mit 594 nm Fluorophor) und FITC für Kanal B (entsprechend CD68 oder LAMP1 Anfärbung gekoppelt mit 488 nm-Fluorophor). Auf der rechten Seite des Software-Fensters für 'Modus zu überprüfen, "die Option" Schwelle ", und für" coloc Intensitäten "die Option" Quellkanäle ".
- Klicken Sie auf 'Bearbeiten' 'coloc Farbe "auszuwählen, auf der rechten Seite des Software-Fensters.
- Für jeden Kanal unabhängig einstellen Schwellen spezifische Färbung zu schließen und Hintergrund / nicht-spezifische Signale auszuschließen. Einmal eingestellt, ändern sich nicht, Schwellen zwischen den Bildern eine unvoreingenommene Analyse zu gewährleisten. Die colocalized Voxel (Pixel von allen Z-Stapel) wird in der Farbe in Schritt ausgewählt erscheinen 4.1.2 in allen z-Stacks simultaneously.
- Klicken Sie auf "coloc Kanal bauen '. Die Kolokalisation Kanal erstellt wird im Display Einstellungsfenster angezeigt.
- Klicken Sie auf den coloc Kanal Kanalstatistik zu öffnen. Die '% Volumen / Material A über dem Schwellenwert colocalized' stellt die% der Iba1 Signal (Voxel zu dem 594 nm Fluorophore entspricht) kolokalisiert mit LAMP1 oder CD68-Signal (Voxel zu dem 488 nm Fluorophore entspricht). Einfacher ausgedrückt, ist dies die durch Phagolysosomen besetzten monocyte Volumen (Figuren 1C und 2C zu sehen).
HINWEIS: '% Volumen / Material B oberhalb der Schwelle colocalized' entspricht% der LAMP1 oder CD68-Signal mit Iba1 colocalized. Dies sollte zu 100% betragen, wie Phagolysosome intrazelluläre Strukturen sind. Die Werte basieren auf einem Verhältnis von Signal von allen Z-Stapel über dem Schwellenwert colocalized.
- das coloc Modul verwenden, analysieren die coloc Kanal in Schritt 4.1 für räumliche Nähe mit OC (Ratte ti erstelltUSGABE) oder 4G8 (Mausgewebe) Aß-Signale. Dies ermöglicht die quantitative Bestimmung von A & bgr; in Phagolysosomen eingekapselt.
- Wählen Sie den Kanal A coloc-Datensatz (entsprechend dem Iba1 / CD68 oder Iba1 / LAMP1 coloc Kanal in Schritt 4.1 erstellt) und Cy5 für Kanal B (entsprechend OC oder 4G8-Färbung gekoppelt mit 647 nm Fluorophore).
- Bauen Sie ein coloc Kanal wie in den Schritten 4.1.2 bis 4.1.5 beschrieben.
- Klicken Sie auf den coloc Kanal Kanalstatistik zu öffnen. Die '% Volumen / Material A über dem Schwellenwert colocalized' stellt die% der Iba1 / LAMP1 oder Iba1 / CD68 colocalized mit OC oder 4G8-Signal (Voxel entsprechend dem 647 (Voxel zum coloc Kanal in Schritt 4.1.5. Gebaut entspricht) nm Fluorophore). Dies ist das phagolysosomalen Volumen von Aß besetzt (siehe 1D und 2D).
HINWEIS: '% Volumen / Material B oberhalb der Schwelle colocalized' entspricht% der Gesamtmenge von Aß-Signal mit Phagolysosome colocalized.Dies kann dazu verwendet werden, um den Anteil des gesamten Aß Ablagerungen innerhalb Phagolysosome eingekapselt zu bewerten (nicht in den vorliegenden repräsentativen Ergebnisse gezeigt).
- Verwenden Sie das Modul übertreffen die konfokale Bildstapel und erzeugen 3D-Modelle von Aß in Monozyten Phagolysosome eingekapselt zu rekonstruieren.
- Im Fenster "Anzeige Einstellung", wählen Sie TRITC (nur Iba1 Färbung zeigen). Im Fenster "Volume-Eigenschaften", klicken Sie auf "Hinzufügen neuer Oberfläche '.
- In Schritt '1/5 Algorithmus' in 'Einstellungen' wählen 'Oberfläche.' Auch in "Farbe" Farbtyp in der Palette oder RGB auszuwählen und anzupassen Transparenz (rot bei 60% Transparenz in den 1B und 2B eingestellt ist). Kontrollkästchen "wählen Region von Interesse". Klicken Sie auf Weiter.
- In Schritt '2/5 Region von Interesse " , ein Fenster um die Zelle von Interesse ziehen durch x Einstellung, y und z - Koordinaten (siehe weiße Kästchen in den 1A 2A). Klicken Sie auf Weiter.
- In Step '3/5 Quellkanal ", wählen Sie den TRITC Quellkanal. Markieren Sie das Kästchen "glatt" und setzen Oberfläche Detailebene bis 0,4 um. Für "Thresholding" absolute Intensität auswählen. Klicken Sie auf Weiter.
- In Step '4/5 Schwelle "einstellen Schwelle, so dass das erzeugte Volumen perfekt mit dem Signal TRITC Kanal überlappt. Klicken Sie auf Weiter.
- In Step '5/5 Oberflächen klassifizieren, "in Abschnitt" Filtertyp "die Option Objekte in Abhängigkeit von ihrer Größe von den Volumina eingeschlossen oder ausgeschlossen werden, geschaffen werden. Klicken Sie auf Fertig, führen alle erforderlichen Schritten und den Assistenten zu beenden.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.6 eine 3D - Oberfläche für die FITC - Kanal (LAMP1 + oder CD68 + Phagolysosome) zu erstellen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.6 eine 3D - Oberfläche für die Cy5 Kanal (OC + oder 4G8 + Aß Ablagerungen) zu erstellen.
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Representative Results
Mit dem mehrstufigen Methodik für q3DISM oben beschrieben, sind wir in der Lage Aß - Aufnahme in Monozyten Phagolysosome im Gehirn von APP / PS1 - Mäuse (Abbildung 1) und TgF344-AD - Ratten (Abbildung 2) zu quantifizieren. Daher hat die q3DISM Methodik Analyse von mononukleären Phagozyten in Maus- und Rattenmodellen von AD aktiviert. Interessanterweise wird das Volumen besetzt durch CD68 + Phagolysosomen signifikant erhöht in Iba1 + mononukleäre Phagozyten , die mit im Vergleich zum Abstand von Plaques sowohl in APP / PS1 - Mäuse (1B, C) und TgF344-AD - Ratten (2B, C). Diese Daten zeigen, dass die mononukleären Phagozyten in der Nähe Plaques werden für die Phagozytose bereit, im Vergleich zu Zellen weg von der Plaque. Um den Bereich von Daten aus unterschiedlichen Färbung Aß Konformere zu veranschaulichen, die wir in Ta verschiedene Antikörper in Maus und Rattengewebe (detailliert verwendetBLE 1 und Diskussion) - zu Aß Phagozytose suchen wir nicht direkt in Bezug Maus und Rattenmodellen von AD zu vergleichen. Trotzdem war es bemerkenswert , dass Plaque assoziiert einkernigen Phagozyten Aß - Aufnahme in APP / PS1 - Mäusen erhöht war im Vergleich zu den Zellen entfernt von Plaques (1D). TgF344-AD Ratten hatten sehr geringe Aufnahme von Aß - Fibrillen Gesamt, und keine Veränderung in Aß Fibrillen Phagozytose als Funktion der Entfernung von Plaques (2D).
Tabelle 1: Immunostaining mononukleäre Phagozyten, Phagolysosome und Amyloid-β im Hirngewebe von APP / PS1 - Mäuse oder TgF344-AD Ratten. Ratte oder Maus-spezifischen Antikörper-Cocktails werden mit ihren jeweiligen Host in Klammern aufgeführt. Farben zeigen den Fluorophor für den sekundären Antikörper verwendet. Rot: Alexa Fluor 594; grün: Alexa Fluor 488;Magenta: Alexa Fluor 647.
Abbildung 1: Visualisierung und Quantifizierung von Amyloid-β Phagozytose in APP / PS1 Mäusehirnen. (A) konfokale Bilder von Hirnschnitten von einer APP / PS1 Maus zeigt Iba1 + Zellen (rot), LAMP1 + Phagolysosome (grün) und 4G8 + Amyloid - Ablagerungen (magenta). Inset 1 hebt einen einkernigen Phagozyten entfernt von der Plaque, während Einschub 2 einen einkernigen Phagozyten mit der Plaque assoziiert zeigt. Maßstabsbalken zeigt den 50 & mgr; m. Kleinere Platten auf der rechten Seite sind Vergrößerungen von Iba1, LAMP1 und 4G8 Signale innerhalb Einsätze 1 und 2 (B) 3D - Rekonstruktion von Iba1, LAMP1 und 4G8 Signale für Einsätze 1 und 2. Maßstabsbalken zeigt 3 um. (C) Quantifizierung von Iba1 + einkernigen Phagozyten Volumen von LAMP1 besetzt + Phagolysosome. (
Abbildung 2: Visualisierung und Quantifizierung von Amyloid-β Phagozytose in TgF344-AD Gehirn von Ratten. (A) konfokale Bilder von Hirnschnitten von einem TgF344-AD Ratte zeigt Iba1 + Zellen (rot), CD68 + Phagolysosome (grün) und OC + löslich fibrillar A & # 946; (Magenta). Inset 1 hebt einen einkernigen Phagozyten entfernt von der Plaque, während Einschub 2 einen einkernigen Phagozyten mit der Plaque assoziiert zeigt. Maßstabsbalken zeigt den 50 & mgr; m. Kleinere Platten auf der rechten Seite sind Vergrößerungen von Iba1, CD68 und OC - Signale innerhalb Einschübe 1 und 2 (B) 3D - Rekonstruktion von Iba1, CD68 und OC Signale für Einsätze 1 und 2. Maßstabsbalken zeigt 3 um. (C) Quantitation of Iba1 + mononukleären Phagozyten Volumen von CD68 + Phagolysosomen besetzt. (D) Quantifizierung der intrazellulären CD68 + phagolysosomalen Volumen von OC besetzt + Aß. Die Werte basieren auf einem Verhältnis von Signal (Voxel) oberhalb der Schwelle, die kolokalisiert sind. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (n = 6 Zellen) für mononukleären Phagozyten entfernt von Plaketten (1) oder in Verbindung mit Platten (2) gezeigt. ** P <0,01 von Student-t-Test.rge.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Protokoll , das wir in diesem Bericht für echte 3D - Quantifizierung von Aß Phagozytose in vivo durch mononukleäre Phagozyten beschreiben beruht auf einer spezifischen Kennzeichnung von zellulärer und subzellulärer Kompartimente sowie Aß Ablagerungen. Insbesondere verwenden wir Iba1 (ionisiertes-Calcium - Bindungs Adaptor - Molekül 1), ein Protein , das in 18 - Membran Kräuseln und Phagozytose bei Zellaktivierung beteiligt ist, 19, zerebrale mononukleären Phagozyten zu färben. Während Iba1 + Zellen im Allgemeinen als Gehirn-resident Mikroglia angesehen werden, bleibt es möglich , dass peripher infiltrieren einkernigen Phagozyten eine Untergruppe von Zellen immun umfassen. Intrazellulärer Phagolysosome enthüllt mit Antikörpern Mitglieder des lysosomalen / endosomalen-assoziierte Glykoprotein (LAMP) Familie zu erkennen: LAMP1 20 oder CD68 21. Letztere wird in erster Linie lokalisiert Lysosomen und Endosomen, mit einem kleineren Anteil an der Zelle s zirkulierendeDein Gesicht. LAMP1 und CD68 Antikörper in Ratten- und Maus - Gewebe verwendet erfolgreich sowohl worden, und die Entscheidung über die zu verwenden ist in erster Linie abhängig von der Vielzahl von anderen für die Co-Färbung verwendete Antikörper (siehe Tabelle 1). Es ist wichtig, sich bewusst sein, dass verschiedene Antikörper können zur Detektion von Aß verwendet werden. In Mausgewebe, 4G8 (Erkennen humanen und murinen Aminosäurereste 17-24 des Aß - Peptid 22, Abbildung 1) und 6E10 (Erkennen menschlichen Aminosäurereste 1-17 23, Daten nicht gezeigt) sind erfolgreich verwendet worden, was die Detektion und Quantifizierung von Aß - Gehalt in LAMP1 + oder CD68 + Phagolysosome in Iba1 + einkernigen Phagozyten. Mit unserem q3DISM Methodik beobachteten wir erhöhte Aß Last in Iba1 + mit globalen Reduktion von Aß Last assoziierten Zellen in den Gehirnen von APPPS1 / IL-10 - / - Mäuse 16, während andere zeigten verringerte Aß - Aufnahme in Iba1 + < / sup> durch erhöhte Aß Last und Plaquevolumen in den Gehirnen von 24 Rag-5xfAD Mäuse begleitet Zellen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Phänomen beobachtet wird, ist ein "Schnappschuss" der aktiven Aß Phagozytose, obwohl unsere Methode kann nicht verwendet werden, um vorherzusagen, ob die phagozytierten Material effizient verdaut und gelöscht.
In Rattengewebe wir Aß - Ablagerungen unter Verwendung OC (Erkennungs löslichen Aß 42 Oligomeren / Fibrillen 25,26, 2) oder 6E10 17 (nicht gezeigt) detektiert. Interessanterweise sehr wenig OC + Fibrillen waren in Monozyten Phagolysosome in TgF344-AD Gehirn von Ratten. Dieses Phänomen wurde in APP23 transgenen Mäusen zuvor unter Verwendung von Immungold berichtet Färbung und 3D - Rekonstruktion 27. Hinweis: eine Vielfalt von Antikörpern zum Nachweis verschiedener Aß species / Konformeren vorliegen und möglicherweise getestet und beim Anwender Ermessen eingesetzt werden kann.
nt "> Unsere q3DISM Technik wurde von uns und anderen zu quantifizieren Aß Phagozytose im Rahmen der AD 16,24,28. Jedoch angenommen wurden, kann das Verfahren praktisch jede Form von Phagozytose zu bewerten angepasst werden. Es ist auch auf Gewebe angewendet werden kann das Gehirn anders als, und auf andere Tierarten (einschließlich Menschen). die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren basieren auf Standard-Immunfärbung, mit Fluoreszenz detektiert und mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet wird. in diesem Bericht haben wir in Paraffin eingebetteten Gewebe nach den Richtlinien verwendet durch den Antikörper-Hersteller zur Verfügung gestellt. Wenn das Protokoll auch für frisches Gewebe optimiert werden konnte (eingebettet in 2% Agarose in PBS) gewünscht. das Protokoll auch Phagozytose von coaggregating Proteinen optimiert werden kann zu erkennen. Dies wird möglich gemacht durch Anfärben und Acquiring komponierten Bildern von mehr als 4 fluoreszierenden Farben 29. In diesem Fall ist die Schaffung des ersten Kolokalisierung Kanal (Monozyten / Phagolysosom) würde durch die Schöpfung folgeneines zweiten Kolokalisierung Kanal (protein 1 / co-aggregierte Protein 2 aggregiert). Dann würden die beiden Kanäle für die 3D-Analyse und Modellierung verwendet werden.Die q3DISM Technik wird in erster Linie durch die Spezifität und Sensitivität der Immunfärbung, die Qualität der Antikörper und Kolokalisation Ansatz beschränkt. Dieses mehrstufige Verfahren hat ein paar möglichen Gefahren, die Qualität der Färbung und somit 3D-Quantifizierung von Aß Aufnahme beeinflussen können. Der erste kritische Schritt des Verfahrens ist die Isolierung von Nagetier-Gehirnen. Tatsächlich ist eine sorgfältige Gewebe Handhabung grundlegende Schädigung des Gehirns zu vermeiden und zu gewährleisten, dass Hirnstrukturen intakt bleiben, wenn sie geschnitten. Zweitens ist Gewebefixierung Zeit sehr wichtig, da über Fixierung (mehr als 16 Stunden in 4% PFA) begrenzt Nachweis von subzellulärer Phagolysosome und Aß-Gehalt. Wichtig ist, dass die aufeinanderfolgenden Anfärbung von 1) Monozyten, 2) und 3 Phagolysosomen) Aß für den Erfolg des Verfahrens kritisch. Es ist essential die Antikörper verwenden consecutively- nicht gleichzeitig. Zusätzlich Erfassung der z-Stapel konfokale Bilder ist von äußerster Wichtigkeit, da die 3D-Modellierung von Zellen, Phagolysosomen und Aß-Peptid sowie Kolokalisation von der Qualität der Bildgebung von zellulären und subzellulären Strukturen durch die Dicke des Abschnitts Gewebe abhängen analysiert. Schließlich Anpassung der Schwellenwerte in der Software ist entscheidend für die 3D-Modellierung und für Kolokalisationsanalyse. Tatsächlich Schwellenwerte für die verschiedenen Kanäle müssen sorgfältig ausgewählt werden, da sie bestimmen, welches Signal enthalten ist (spezifische) oder ausgeschlossen (Hintergrund) aus der Analyse. Es ist auch wichtig, dass die gewählten Schwellenwerte zwischen den Proben im Falle des Vergleichs verschiedener Tiere / Proben konsistent bleiben. Bisher klassischen Immunhistofärbung, Kernspintomographie und Positronen - Emissions - Tomographie die bildgebenden Verfahren der Wahl gewesen , in vivo - Visualisierung und Quantifizierung von A & bgr;30. Obwohl sehr nützlich für die großtechnische Quantifizierung von Amyloidlast in Gehirnen von Nagetieren oder AD-Patienten sind diese Verfahren ineffizient für die Visualisierung von intrazellulärem Aß. Andere Techniken konfokale Mikroskopie, die Fluoreszenzspektroskopie und Strömungs existieren Zytometrie und wurden von uns und anderen verwendet worden ist, zu unterscheiden und die intrazelluläre Aß - Gehalt in vitro 16,31,32 quantifizieren. Immungold- Färbung in Verbindung mit 3D - Rekonstruktion wurde zuvor verwendet , um die Abwesenheit von Amyloidfibrillen innerhalb Mikroglia in vivo in APP23 transgenen Mäusen zu markieren 27, und eine andere Studie erfolgreich konfokaler Bildgebung und 3D - Oberflächenrekonstruktion von Mikroglia-assoziierten mit β-Amyloid - Plaques begrenzt Aß zu zeigen , Interaktion und Aufnahme 33. Allerdings sind diese Techniken nicht zur Quantifizierung von intra phagolysosomalen Aß Spezies ermöglichen. Andere haben kürzlich eine fluoreszenzbasierte in vivo - Assay ermöglicht die Messung entwickelteder Phagozytose von peripheren Makrophagen in der Ratte 34. Diese Methode ermöglicht es sinnreich zur Quantifizierung von Fluoreszenz bioprobes in Phagolysosomen in vivo jedoch verfügbaren Daten so sind an der Peripherie weit begrenzt.
Unseres Wissens ist q3DISM die erste Methode, die 3D-Visualisierung und Quantifizierung von Aß Phagozytose in Gehirnen von Nagetier AD-Modelle bietet. Dieses beeindruckende Tool ebnen zweifellos den Weg zu einem tieferen Verständnis der zerebralen Aß Phagozytose und kann auch in anderen Zusammenhängen als nützlich erweisen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23 G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10x | Bioland Scientific | PBS01-02 | Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10x | DAKO | S1699 | Working concentration 1x |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1,000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. |
References
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