Summary
We ontwikkelden een methode voor kwantitatieve 3D in silico modellering (q3DISM) van cerebrale amyloid-β (Aß) fagocytose door mononucleaire fagocyten in diermodellen van de ziekte van Alzheimer. Deze methode kan worden gegeneraliseerd voor de kwantificering van vrijwel elke fagocytische gebeurtenis in vivo.
Abstract
Neuro-inflammatie wordt nu erkend als een belangrijke etiologische factor in neurodegeneratieve ziekte. Mononucleaire fagocyten zijn aangeboren immuunsysteem cellen die verantwoordelijk zijn voor de fagocytose en het ruimen van puin en afval. Deze cellen zijn onder andere CNS-resident macrofagen bekend als microglia en mononucleaire fagocyten infiltreren uit de periferie. Lichtmicroscopie over het algemeen gebruikt om fagocytose visualiseren knaagdieren of menselijke hersenen specimens. Echter kwalitatieve methoden geen definitief bewijs van in vivo fagocytose. Hier beschrijven we kwantitatieve 3D in silico modellering (q3DISM), een robuuste methode waardoor echte 3D-kwantificering van amyloid-β (Aß) fagocytose door mononucleaire fagocyten in knaagdieren de ziekte van Alzheimer (AD) modellen. De methode houdt fluorescerend visualiseren Ap ingekapseld in phagolysosomes inproefdierhersenen secties. Grote z-dimensionale confocale datasets worden vervolgens 3D gereconstrueerd voor kwantificering van A &# 946; ruimtelijk colocalized binnen de fagolysosoom. We tonen de succesvolle toepassing van q3DISM muizen- en ratten hersenen, maar deze methode kan worden uitgebreid tot vrijwel elke fagocytische gebeurtenis in elk weefsel.
Introduction
Ziekte van Alzheimer (AD), de meest voorkomende leeftijd gerelateerde dementie 1, gekenmerkt door cerebrale amyloïde-β (Aß) accumulatie "seniele" β-amyloïde plaques, chronische lage zenuwontsteking, tauopathie, neuronaal verlies en cognitieve stoornis 2 . In AD patiënt hersenen, wordt neuroinflammatie gereserveerd door reactieve astrocyten en mononucleaire fagocyten (aangeduid als microglia, hoewel hun centrale vs. perifere herkomst onduidelijk blijft) omliggende Aß afzettingen 3. Aangezien het aangeboren immuunsysteem wachters van het CZS, zijn microglia centraal gepositioneerd hersenen Aß wissen. Echter microglia werving Ap-plaques gepaard met zeer weinig of geen Aß fagocytose 4,5. Een hypothese is dat microglia in eerste instantie neuroprotectieve door phagocytozing kleine vergaderingen van AB. Echter, uiteindelijk deze cellen neurotoxisch overweldigend Aß last en / of leeftijdsgerelateerde functionele decline, provoceert microglia in een disfunctionele pro-inflammatoire fenotype, wat bijdraagt aan neurotoxiciteit en cognitieve achteruitgang 6.
Recente Genoombrede Association Studies (GWAS) hebben een cluster van AD risico-allelen die behoren tot de belangrijkste aangeboren immuunsysteem trajecten 7 dat fagocytose 8-11 moduleren geïdentificeerd. Bijgevolg, de immuunrespons op cerebrale amyloïde afzetting is uitgegroeid tot een belangrijk aandachtsgebied, zowel in termen van het begrip van AD etiologie en voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen 12-14. Toch is er een belangrijke behoefte aan methoden Ap fagocytose in vivo te evalueren. Om dit onvervulde behoefte aan te pakken, hebben we kwantitatieve 3D in silico modellering (q3DISM) naar echte 3D-kwantificering van cerebrale Ap fagocytose door mononucleaire fagocyten in knaagdier modellen van Alzheimer-achtige ziekte in te schakelen ontwikkeld.
alleen beperkt door de mate waarin zij recapituleren ziekte, dierlijke modellen hebbenbewezen van onschatbare waarde voor het begrijpen van AD pathoetiology en voor het evalueren van experimentele therapieën. Vanwege het feit dat mutaties in de preseniline (PS) en Amyloid Precursor Protein (APP) genen onafhankelijk veroorzaken autosomaal dominante AD, zijn deze mutant transgenen uitgebreid toegepast om transgene knaagdiermodellen genereren. Transgene APP / PS1 muizen gelijktijdig co-expressie "Swedish" mutant menselijk APP (APP swe) en Δ exon 9 mutant menselijk preseniline 1 (PS1ΔE9) aanwezig met versnelde cerebrale amyloïdose en neuroinflammatie 15,16. Verder hebben we bi-transgene ratten gecoïnjecteerd met APP swe en PS1ΔE9 constructies (lijn TgF344-AD, op een Fischer 344 achtergrond) gegenereerd. In tegenstelling tot transgene muismodellen van cerebrale amyloïdose, TgF344-AD ratten ontwikkelen van cerebrale amyloïde dat tauopathie, apoptotische verlies van neuronen, en gedragsmatige impairment 17 voorafgaat.
In dit rapport beschrijven we een protocol voor immunostaining microglia, phagolysosomes en Ap-afzettingen in de hersenen secties van APP / PS1 muizen en TgF344-AD ratten, en de verwerving van grote z-dimensionale confocale beelden. We detail in silico generatie en analyse van de echte 3D-reconstructies van confocale datasets waardoor kwantificering van Ap-opname in microglia phagolysosomes. Meer in het algemeen, kan de methodologie die detail Here We worden gebruikt om vrijwel elke vorm van fagocytose in vivo te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verklaring van het onderzoek ethiek: Alle experimenten met dieren die hierin beschreven werden goedgekeurd door de University of Southern California Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en uitgevoerd in strikte overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en aanbevelingen van de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International.
1. knaagdieren Brain Isolatie en Voorbereiding voor Immunokleuring
DAG 1:
- Plaats de leeftijd TgF344-AD ratten (14 maanden oud) of APP / PS1 muizen (12 maanden oud) onder continue diepe isofluraananesthesie (4%). Beoordeel de diepte van de anesthesie door teen knijpen en de afwezigheid van de terugtrekking reflex.
- Doorsnijden beide zijden van de ribbenkast en optillen om het hart bloot te leggen. Plaats een 23 G naald in de linker hartkamer en een kleine incisie in het rechter atrium. Ga verder met verbloeding door transcardial perfusie met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing(PBS) met behulp van een peristaltische pomp (30 ml muizen, 150-200 ml voor ratten).
- Maak een caudale middellijn incisie in de huid en beweeg de huid en spieren opzij. Knip de bovenkant van de schedel over de middellijn en tussen de ogen. Verwijder het bot borden en isoleren van de gehele hersenen uit de schedel.
- Plaats de hersenen in een coronale knaagdieren hersenen matrix en snijd het in vieren. Incubeer achterste kwart O / N (16 h) in paraformaldehyde fixeermiddel (4% PFA in PBS) bij 4 ° C. 3x wassen in PBS, en vervolgens over tot 70% ethanol. Let op: PFA is giftig en onder een chemische kap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden behandeld.
DAG 2:
- Plaats hersenen quarters in inbedding cassettes geleidelijk uitdrogen weefsel achtereenvolgens geconcentreerder 1 uur baden ethanol (70%, 80%, 95% en 100% x3).
- Clear ethanol uit het weefsel met drie opeenvolgende 100% xyleen baden (1 uur per stuk). Let op: Xyleen is giftig en shOuld onder een chemische kap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen worden behandeld.
- Insluiten weefsel in paraffineblokken na twee gesmolten paraffinewas baden (56-58 ° C, 90 min elk).
DAG 3:
- Cut 10 urn dikke secties van in paraffine ingebedde hersenen met behulp van een microtoom. Dip secties in een waterbad (50 ° C gedurende 1 min) en gelden voor dia's microscoop. Laat de dia's aan O / N te drogen, waardoor het weefsel hechting aan de dia.
2. Immunokleuring
Opmerking: Verschillende combinaties van antilichamen kan worden gebruikt voor de kleuring onderstaande procedure. Antilichaam cocktails compatibel met hersenweefsel van ratten en muizen worden in Tabel 1.
DAG 4:
- Deparaffinize hersenen secties met behulp van 2x 100% xyleen baden (12 min elk).
- Rehydrateren hersensecties achtereenvolgens ethanol baden - 100% gedurende 10 min, 95% gedurende 5 min, 80% gedurende 10 min en tenslotte 70% gedurende 15 min - followed door 3x PBS wassen [5 min bij RT, met een lichte agitatie]. Verhit ondertussen antigeenterugtrekking oplossing 95-97 ° C op een hete plaat met magnetisch roeren bar.
- Incubeer hersensecties in antigeenterugtrekking oplossing bij 95-97 ° C gedurende 30 minuten. Vervolgens wassen 3x in PBS (5 min bij RT, met een lichte agitatie).
- Snel droog dia's met behulp delicate taak ruitenwissers om weefsel te voorkomen dat ze uitdrogen, en trek een hydrofobe barrière rond het weefsel met een hydrofobe barrière pen. Vul het omcirkelde weefselgebied met blokkerende buffer [PBS bevattende 0,3% Triton X-100 en 10% normaal serum ezel (NDS)] en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in een bevochtigde kamer.
- Vervang blokkerende buffer met Iba1 primair antilichaam (verdund in blokkerende buffer) aan mononucleaire fagocyten labelen, en incubeer O / N bij 4 ° C in een vochtige kamer. Voor antilichaam gastheren en werken verdunningen, zie tabel 1 en de Table of Materials.
Dag 5:
- Spoelenprimair antilichaam met 3x PBS baden (5 min bij RT met licht schudden). Incubeer met fluorescerende secundair antilichaam (geconjugeerd met een 594 nm emissie fluorofoor) gedurende 1 uur (in blokkerende buffer bij kamertemperatuur in het donker), gevolgd door 3x PBS baden (5 min bij kamertemperatuur onder licht schudden). Momenteel handhaven secties in het donker fluorescentiesignaal bleken voorkomen.
Dag 6 - 7:
- Herhaal de stappen 2.5 en 2.6 met CD68 (rattenhersenen) of LAMP1 (muis weefsel) antilichamen en passende secundaire antilichamen (in combinatie met een 488 nm emissie fluorofoor) naar phagolysosomes labelen.
Dag 7 - 8:
- Herhaal de stappen 2.5 en 2.6 met OC (rat weefsel) of 4G8 (muizenhersenen) antilichamen en passende secundaire antilichamen (gekoppeld aan een 647 nm fluorofoor) naar Aß afzettingen te labelen.
OPMERKING: U 6E10 antilichaam met succes kan worden gebruikt zowel op de muis en rat weefsel. Voor de juiste antilichaam combinaties, zie de tabel van Materialen - Laat secties om volledig droog O / N bij kamertemperatuur in het donker. Dan, cover exemplaren met een deksel slip afgedicht met behulp van fluorescentie montage media met DAPI.
3. Overname van Grote Z-stack confocale Datasets
Opmerking: Dit protocol is een volledig geautomatiseerde laser scanning confocale microscoop uitgerust met een 60X objectief en 405 nm, 488 nm, 594 nm en 647 nm lasers. Alle apparatuur is computergestuurd door beeldvorming en laser besturingssoftware. Voorafgaand aan het begin van de imaging-protocol, macht op de computer, epifluorescerende lamp, microscoop, lasers en camera.
Dag 9:
- Selecteer de 60X microscoop doelstelling. Voeg immersie olie aan de lens en plaats het monster op de microscoop podium diahouder. Til de doelstelling tot de olie contact met de glijbaan maakt. Pas de focal plane om amyloïde plaques in de hippocampus of cerebrale cortex met behulp van epifluorescerende verlichting door de oculairen te lokaliseren.
- Acquire confocale imleeftijden van geactiveerde mononucleaire fagocyten omliggende amyloïde afzettingen in de hippocampus of cortex van knaagdieren door confocale microscopie (60x vergroting, z-stack stappen: 0.25 pm <z <0,40 pm, aantal stappen 25 <n <35).
4. q3DISM
Let op: om significante resultaten op, raden we het analyseren van een minimum van 3 beelden per dier / regio van belang. Voor elk beeld, kan de veelheid van cellen te analyseren variabel experimentele paradigma. In de representatieve resultaten die in dit rapport, analyseerden we 3 cellen / conditie (bijvoorbeeld mononucleaire fagocyten ver van of geassocieerd met plaques; zie figuren 1C - D en 2C - D).
Dag 10:
- Analyseer confocale datasets met wetenschappelijke 3D-beeldverwerking en analyse software colocalisatie (Coloc) module voor ruimtelijke nabijheid van Iba1 / CD68 (rat weefsel) of Iba1 / LAMP1 (muis weefsel) kleuring in alle z-vliegtuigen tegelijk.Maak Iba + / CD68 + of Iba + / + LAMP1 colocalisatie kanalen die overeenkomen met phagolysosomes binnen geactiveerde mononucleaire fagocyten.
- Selecteer TRITC voor kanaal A (overeenkomend met Iba1 kleuring gecombineerd met 594 nm fluorofoor) en FITC voor kanaal B (overeenkomend met CD68 of LAMP1 kleuring gecombineerd met 488 nm fluorofoor). Aan de rechterzijde van de software venster voor het 'mode controle,' 'drempel' te selecteren en voor 'Coloc intensiteiten,' select 'source-kanalen'.
- Klik op 'Bewerken' om 'Coloc kleur' aan de rechterzijde van de software-venster te selecteren.
- Voor elk kanaal onafhankelijk te passen drempels om specifieke kleuring opnemen en uitsluiten achtergrond / niet-specifieke signalen. Eenmaal aangepast, geen drempels tussen de beelden wijzigen in een onpartijdige analyse te waarborgen. De colocalized voxels (pixels uit alle z-stacks) zal verschijnen in de gekozen in stap 4.1.2 in alle z-stacks sim kleurultaneously.
- Klik op 'bouwen Coloc channel'. De colocalization kanaal aangemaakt zal verschijnen in het display aanpassing.
- Klik op de Coloc kanaal naar kanaal statistieken te openen. De '% volume / materiaal A boven de drempel colocalized' vertegenwoordigt het% Iba1 signaal (voxels corresponderen met de 594 nm fluorofoor) colocalized met LAMP1 of CD68 signaal (voxels corresponderen met de 488 nm fluorofoor). Eenvoudiger, dit is de monocyte volume ingenomen door phagolysosomes (zie figuren 1C en 2C).
LET OP: '% van het volume / materiaal B boven de drempel colocalized' komt overeen met% van LAMP1 of CD68 signaal colocalized met Iba1. Dit moet dicht bij 100% bedraagt phagolysosomes intracellulaire structuren. Waarden zijn gebaseerd op de verhouding van signaal van alle z-stacks boven de drempel colocalized.
- Met behulp van de Coloc module, het analyseren van de Coloc kanaal gecreëerd in stap 4.1 voor ruimtelijke nabijheid met OC (rat tissue) of 4G8 (muis weefsel) Ap signalen. Dit maakt kwantificering van Aß ingekapseld in phagolysosomes.
- Selecteer het kanaal A Coloc dataset (overeenkomend met de Iba1 / CD68 of Iba1 / LAMP1 Coloc kanaal in stap 4,1) en Cy5 voor kanaal B (overeenkomend met OC of 4G8 kleuring gecombineerd met 647 nm fluorofoor).
- Bouw een Coloc kanaal, zoals beschreven in de stappen 4.1.2 tot 4.1.5.
- Klik op de Coloc kanaal naar kanaal statistieken te openen. De '% van het volume / materiaal A boven de drempel colocalized' staat voor het% Iba1 / LAMP1 of Iba1 / CD68 (voxels die overeenkomt met de Coloc kanaal gebouwd in stap 4.1.5.) Colocalized met OC of 4G8 signaal (voxels die overeenkomt met de 647 nm fluorofoor). Dit is de phagolysosomal volume bezet door AB (zie figuren 1D en 2D).
LET OP: '% van het volume / materiaal B boven de drempel colocalized' komt overeen met% van de totale AB signaal colocalized met phagolysosomes.Dit kan worden gebruikt om de fractie van totaal Aß afzettingen ingekapseld in phagolysosomes (niet getoond in deze representatieve resultaten) te evalueren.
- Gebruik de overtreffen module om de confocale afbeelding stacks te reconstrueren en het genereren van 3D-modellen van AB ingekapseld in monocyten phagolysosomes.
- In het venster 'aanpassing van de weergave', selecteer TRITC (alleen Iba1 kleuring tonen). In het venster 'volume eigenschappen', klik op 'add new oppervlak'.
- In stap '1/5 algoritme', in 'instellingen' te selecteren 'oppervlak.' Ook in 'kleur' selecteert u het type kleur in het palet of RGB en transparantie aan te passen (rood wordt vastgesteld op 60% transparantie in de figuren 1B en 2B). Selectievakje 'te selecteren regio of interest'. Klik op Volgende.
- In Stap '2/5 regio van belang, "trek een venster rond de cel van belang door het aanpassen van x, y en z coördinaten (zie witte dozen in de figuren 1A 2A). Klik op Volgende.
- In Stap '3/5 source channel', selecteert u de TRITC bron kanaal. Vink het vakje 'glad' en stel oppervlakte detailniveau tot 0,4 urn. Voor 'drempelwaarde,' te selecteren absolute intensiteit. Klik op Volgende.
- In Stap '4/5 drempel,' aan te passen drempel, zodat het volume gemaakt overlapt perfect bij de TRITC kanaalsignaal. Klik op Volgende.
- In Stap '5/5 classificeren oppervlakken,' in de rubriek "type filter, 'objecten selecteren, afhankelijk van hun grootte te worden opgenomen of uitgesloten van de volumes worden gemaakt. Klik afwerking, voeren de hele schepping stappen, en verlaat de wizard.
- Herhaal de stappen 4.3.1 tot 4.3.6 om een 3D-oppervlak te creëren voor de FITC kanaal (LAMP1 + of CD68 + phagolysosomes).
- Herhaal de stappen 4.3.1 tot 4.3.6 om een 3D-oppervlak te creëren voor de Cy5 kanaal (OC + of 4G8 + Ap-deposito's).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de multi-stage methodologie voor q3DISM hierboven beschreven, zijn we in staat om Ap opname te kwantificeren in monocyten phagolysosomes in de hersenen van APP / PS1 muizen (figuur 1) en TgF344-AD ratten (figuur 2). Daarom is de methode q3DISM analyse van mononucleaire fagocyten in muis en ratmodellen van AD ingeschakeld. Interessant is dat het volume ingenomen door CD68 + phagolysosomes aanzienlijk toegenomen in Iba1 + mononucleaire fagocyten geassocieerd met tegenover ver van plaques zowel APP / PS1 muizen (Figuur 1B, C) en TgF344 AD-ratten (Figuur 2B, C). Deze gegevens tonen dat mononucleaire fagocyten dichtbij plaques klaar voor fagocytose vergeleken met cellen verwijderd van de plaat bevindt. Om het gegevensbereik illustreren van verschillende kleuren Aß conformeren, gebruikten we verschillende antilichamen bij muizen en ratten weefsel (gespecificeerd in Table 1 en discussie) - we zijn niet op zoek naar muis en rat modellen van AD rechtstreeks te vergelijken met betrekking tot AB fagocytose. Toch was het opmerkelijk dat plaque geassocieerd mononucleaire fagocyten Ap opname in APP / PS1 muizen was toegenomen vergeleken met cellen ver van plaques (figuur 1D). TgF344-AD ratten zeer geringe opname van Aß fibrillen algemeen, en geen verandering in Aß fibrillen fagocytose als functie van de afstand tot plaques (figuur 2D).
Tabel 1: Immunokleuring mononucleaire Fagocyten, Phagolysosomes en amyloid-β in hersenweefsel van APP / PS1 muizen of TgF344-AD Rats. Rat of muis antilichaam cocktails worden vermeld met hun respectievelijke gastheer haakjes. Kleuren geven de fluorofoor gebruikt voor het secundaire antilichaam. Rood: Alexa Fluor 594; groen: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647.
Figuur 1: Visualisatie en kwantificering van amyloid-β Phagocytosis in APP / PS1 Mouse Brains. (A) confocale beelden van de hersenen secties van een APP / PS1 muizen toont Iba1 + cellen (rood), LAMP1 + phagolysosomes (groen) en 4G8 + amyloïde deposito's (magenta). Inzet 1 wijst op een mononucleaire fagocyt ver van de plaque, terwijl de inzet 2 toont een mononucleaire fagocyt in verband met de plaquette. Schaal bar geeft 50 micrometer. Kleinere panelen rechts zijn uitbreidingen van Iba1, LAMP1 en 4G8 signalen in bijvoegsels 1 en 2 (B) 3D-reconstructie van Iba1, LAMP1 en 4G8 signalen voor bijvoegsels 1 en 2. Schalingsbalk zit je 3 urn. (C) Kwantificering van Iba1 + mononucleaire fagocyt volume ingenomen door LAMP1 + phagolysosomes. (
Figuur 2: Visualisatie en kwantificering van amyloid-β Phagocytosis in TgF344-AD Rat Brains. (A) confocale beelden van de hersenen secties van een TgF344-AD rat tonen Iba1 + cellen (rood), CD68 + phagolysosomes (groen) en OC + oplosbare fibrillaire A & # 946; (magenta). Inzet 1 wijst op een mononucleaire fagocyt ver van de plaque, terwijl de inzet 2 toont een mononucleaire fagocyt in verband met de plaquette. Schaal bar geeft 50 micrometer. Kleinere panelen aan de rechterkant zijn uitbreidingen van Iba1, CD68 en OC signalen binnen inzetstukken 1 en 2 (B) 3D-reconstructie van Iba1, CD68 en OC signalen voor inzetstukken 1 en 2. Schaal bar geeft 3 micrometer. (C) Kwantificering van Iba1 + mononucleaire fagocyt volume ingenomen door CD68 + phagolysosomes. (D) kwantificering van intracellulaire CD68 + phagolysosomal volume ingenomen door OC + Ap. Waarden zijn gebaseerd op de verhouding van signaal (voxels) boven de drempel die colocalized. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (n = 6 cellen) voor mononucleaire fagocyten ver van plaques (1), of geassocieerd met plaques (2). ** P <0,01 door t-test van Student.rge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol dat we beschrijven in dit verslag voor echte 3D-kwantificering van Ap fagocytose in vivo door mononucleaire fagocyten steunt op specifieke etikettering van cellulaire en subcellulaire compartimenten evenals Ap-deposito's. Specifiek gebruiken we Iba1 (geïoniseerd-calcium bindende adapter molecuul 1), een eiwit dat betrokken is bij membraan roffelende en fagocytose na celactivering 18, 19, cerebrale mononucleaire fagocyten vlekken. Terwijl Iba1 + cellen gewoonlijk als brain-resident microglia worden beschouwd, blijft het mogelijk dat de omtrek infiltrerende mononucleaire fagocyten omvatten een immunologisch subset van cellen. Intracellulaire phagolysosomes worden onthuld met antilichamen die de leden van het lysosomale / endosomale-geassocieerde membraan glycoproteïne (LAMP) gezin: LAMP1 20 of CD68 21. Dit laatste is vooral gelokaliseerd in lysosomen en endosomen, met een kleiner deel circuleert de cel sjouw gezicht. LAMP1 en CD68-antilichamen zijn beide met succes gebruikt in de rat en muis weefsel, en de beslissing over welke te gebruiken is vooral afhankelijk van de gastheer van andere antilichamen gebruikt voor co-kleuring (zie tabel 1). Het is belangrijk te weten dat verschillende antilichamen kunnen worden gebruikt voor de detectie van AB. In muis weefsel, 4G8 (herkennen mens en muis aminozuurresten 17-24 van Aß peptide 22, figuur 1) en 6E10 (herkennen humane aminozuurresiduen 1-17 23, gegevens niet getoond) zijn met succes toegepast, waardoor detectie en kwantificering van Ap-gehalte in LAMP1 + of CD68 + phagolysosomes aanwezig in Iba1 + mononucleaire fagocyten. Met onze q3DISM methodologie zagen we verhoogde Aß lading in Iba1 + cellen geassocieerd met totale verlaging van Aß lading in hersenen van APPPS1 / IL-10 - / - muizen 16, terwijl anderen toonde verminderde Ap opname in Iba1 + < / sup> cellen gepaard met een verhoogde Aß lading en plaque volume in de hersenen van Rag-5xfAD muizen 24. Deze resultaten suggereren dat de waargenomen verschijnsel is een "snapshot" van actieve Aß fagocytose, hoewel onze werkwijze niet kan worden gebruikt om te voorspellen of de gefagocyteerde materiaal efficiënt gedigereerd en gewist.
In rattenweefsel, we Aß afzettingen middels OC gedetecteerd (erkenning oplosbaar Aß 42 oligomeren / fibrillen 25,26, figuur 2) of 6E10 17 (niet getoond). Interessant, waren zeer weinig OC + fibrillen aanwezig is in monocyten phagolysosomes in TgF344-AD rattenhersenen. Dit fenomeen is eerder vermeld in APP23 transgene muizen, waarbij immunogoudkleuring en 3D reconstructie 27. Opmerking: verschillende antilichamen voor de detectie van verschillende soorten Aß / conformeren beschikbaar en kan eventueel worden getest en gebruikt naar keuze van de gebruiker.
nt "> Ons q3DISM techniek werd door ons en anderen aangenomen Ap fagocytose kwantificeren in het kader van AD 16,24,28. Toch kan de werkwijze worden aangepast aan vrijwel elke vorm van fagocytose evalueren. Het kan ook worden toegepast op weefsels behalve de hersenen en andere diersoorten (waaronder mensen). de in dit protocol beschreven procedures afhankelijk standaard immunokleuring gedetecteerd met fluorescentie en afgebeeld met een confocale microscoop. in dit verslag hebben wij in paraffine ingebed weefsel gebruikt volgens de richtlijnen door het antilichaam fabrikanten. Desgewenst kunnen de onderhavige protocol kan ook worden geoptimaliseerd voor vers weefsel (ingebed in 2% agarose in PBS). het protocol kan ook worden geoptimaliseerd om fagocytose van coaggregating eiwitten te detecteren. Dit wordt mogelijk gemaakt door kleuring en het verwerven beelden samengesteld uit meer dan 4 fluorescerende kleuren 29. In dit geval zou de oprichting van de eerste colocalization kanaal (monocyten / fagolysosoom) worden gevolgd door de scheppingvan een tweede colocalization kanaal (geaggregeerde eiwit 1 / co-geaggregeerde proteïne 2). Dan zouden de twee kanalen worden gebruikt voor 3D-modellering en analyse.De q3DISM techniek wordt voornamelijk beperkt door de specificiteit en gevoeligheid van immunokleuring, kwaliteit van antilichamen en colocalization benadering. Deze meerstaps procedure enkele mogelijke valkuilen dat de kwaliteit van de kleuring en derhalve 3D kwantificering van Aß opname beïnvloeden. De eerste belangrijke stap van de werkwijze is het isoleren van knaagdieren hersenen. Inderdaad, zorgvuldige weefsel handling is fundamenteel voor schade aan de hersenen te voorkomen en te waarborgen dat hersenstructuren intact blijven wanneer doorgesneden. Ten tweede, weefsel fixatie tijd is heel belangrijk, omdat over-fixatie (meer dan 16 uur in 4% PFA) beperkt detectie van subcellulaire phagolysosomes en Ap-content. Belangrijk is dat de opeenvolgende kleuring van 1) monocyten, 2) en 3 phagolysosomes) Aß is essentieel voor het succes van de werkwijze. Het is essential het gebruik van de antilichamen consecutively- niet gelijktijdig. Bovendien acquisitie van de z-stack confocale beelden van het grootste belang, aangezien 3D modelleren van cellen, phagolysosomes en Aß peptide en colocalization analyses afhankelijk van de kwaliteit van de beeldvorming van cellulaire en subcellulaire structuren over de dikte van de weefselsectie. Tot slot, de aanpassing van de drempels in de software is cruciaal voor 3D-modellering en voor colocalization analyse. Inderdaad, drempels voor de verschillende kanalen moeten zorgvuldig worden gekozen, omdat zij zullen bepalen welk signaal is opgenomen (specifieke) of uitgesloten (achtergrond) uit de analyse. Fundamenteel is ook dat de gekozen drempels coherent blijven tussen monsters bij de vergelijking van verschillende dieren / monsters. Tot nu toe zijn klassieke immunohistostaining, magnetische resonantie en positron emissie tomografie de beeldvorming van de keuze voor in vivo visualisatie en kwantificering van Aß geweest30. Hoewel ze zeer bruikbaar voor grootschalige kwantificering van amyloïdbelasting in hersenen van knaagdieren of AD patiënten zijn deze werkwijzen inefficiënt voor visualisatie van intracellulaire Aß. Andere technieken met behulp van confocale microscopie, fluorescentie spectroscopie en flowcytometrie bestaan en zijn gebruikt door ons en anderen om te discrimineren en te kwantificeren intracellulaire Ap-gehalte in vitro 16,31,32. Immunogoudkleuring combinatie met 3D reconstructie is eerder gebruikt om de afwezigheid van amyloïde fibrillen binnen microglia in vivo in APP23 transgene muizen 27 te markeren en een andere studie met succes gebruikt confocale beeldvorming en 3D-oppervlak reconstructie van microglia geassocieerd met β-amyloïde plaques beperkte Aß tonen interactie en opname 33. Echter, deze technieken niet toe kwantificering van intra-phagolysosomal Aß species. Anderen hebben onlangs een fluorescentie-gebaseerde in vivo assay waarbij de metingvan fagocytische activiteit van de perifere macrofagen in de rat 34. Deze werkwijze maakt ingenieuze voor kwantificering van fluorescentie bioprobes in phagolysosomes in vivo echter momenteel beschikbare gegevens zijn beperkt tot de periferie.
Voor zover wij weten, q3DISM is de eerste methode die 3D-visualisatie en kwantificering van Aß fagocytose in hersenen van AD knaagdier modellen verschaft. Deze geduchte tool zal ongetwijfeld de weg effenen naar een dieper begrip van cerebrale Ap fagocytose, en kan ook nuttig zijn in andere contexten te bewijzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23 G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10x | Bioland Scientific | PBS01-02 | Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10x | DAKO | S1699 | Working concentration 1x |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1,000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. |
References
- Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
- Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774 (2010).
- Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
- Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
- Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
- Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
- Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949 (2012).
- Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
- Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
- Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185 (2012).
- Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
- Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
- Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
- Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
- Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
- Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
- Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
- Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
- Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33 (2015).
- Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).
- Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
- Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
- Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
- Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
- Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).
