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Medicine

3D quantitative doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

Nous avons développé une méthodologie pour la 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) de amyloïde cérébrale-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode peut être généralisée pour la quantification de pratiquement tous les cas de phagocytose in vivo.

Abstract

Neuroinflammation est maintenant reconnu comme un facteur étiologique majeur dans les maladies neurodégénératives. Les phagocytes mononucléaires sont des cellules immunitaires innées responsables de la phagocytose et l'élimination des débris et de détritus. Ces cellules comprennent les macrophages CNS-résidents appelés microglie et phagocytes mononucléaires infiltrant de la périphérie. La microscopie optique a généralement été utilisé pour visualiser la phagocytose des rongeurs ou des échantillons de cerveau humain. Cependant, les méthodes qualitatives ont pas fourni la preuve définitive de la phagocytose in vivo. Ici, nous décrivons 3D quantitative dans la modélisation de silico (de q3DISM), une méthode robuste permettant la vraie quantification 3D de l' amyloïde-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans rongeurs maladie d'Alzheimer (AD) modèles. Le procédé consiste à visualiser fluorescence Aß encapsulé dans phagolysosomes dans les sections rongeur du cerveau. Les grands ensembles de données confocale z-dimensionnelle sont ensuite reconstruits 3D pour la quantification de A &# 946; colocalisés dans l'espace à l'intérieur du phagolysosome. Nous démontrons l'application réussie de q3DISM à la souris et le rat des cerveaux, mais cette méthode peut être étendue à pratiquement tous les cas phagocytaire dans les tissus.

Introduction

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Maladie d'Alzheimer (AD), la démence liée à l'âge le plus courant 1, est caractérisée par amyloïde cérébrale-β (Aß) accumulation sous forme de plaques "séniles" ß-amyloïde, chronique neuroinflammation de bas niveau, tauopathie, perte neuronale, et la perturbation cognitive 2 . Dans AD cerveaux de patients, neuroinflammation est affecté par les astrocytes et les phagocytes mononucléaires réactif (appelé microglie, bien que leurs centrales vs. origine périphérique reste incertaine) entourant les dépôts Aß 3. Comme les sentinelles immunitaires innées du SNC, les microglies sont positionnés centralement pour effacer le cerveau Aß. Cependant, le recrutement microglie aux plaques de Aß est accompagnée de très peu, le cas échéant, la phagocytose de Aß 4,5. Une hypothèse est que les microglies sont initialement neuroprotecteur par phagocytozing petits ensembles de Aß. Cependant, par la suite ces cellules deviennent neurotoxiques comme fardeau écrasant Aß et / ou d fonctionnelle liée à l'âgeECLINE, provoque la microglie dans un phénotype proinflammatoire dysfonctionnel, ce qui contribue à la neurotoxicité et déclin cognitif 6.

Association récentes Études de génome entier (GWAS) ont identifié un groupe d'allèles à risque AD appartenant aux principaux voies immunitaires innées 7 qui modulent la phagocytose 8-11. Par conséquent, la réponse immunitaire à un dépôt amyloïde cérébrale est devenue un domaine d'intérêt majeur, tant en termes de compréhension AD étiologie et pour développer de nouvelles approches thérapeutiques 12-14. Pourtant, il y a un besoin vital de méthodologie pour évaluer la phagocytose Aß in vivo. Pour répondre à ce besoin non satisfait, nous avons développé 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) pour permettre vrai quantification 3D de phagocytose Aß cérébrale par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d' Alzheimer-like.

Limitée seulement par la mesure dans laquelle elles récapituler les maladies, les modèles animaux ontprouvé une valeur inestimable pour la compréhension de AD pathoetiology et pour évaluer les traitements expérimentaux. Compte tenu du fait que des mutations dans les présénilines (PS) et Amyloid Precursor Protein (APP), des gènes provoquent indépendamment AD autosomique dominante, ces transgènes mutants ont été largement utilisées pour produire des modèles de rongeurs transgéniques. Les souris transgéniques APP / PS1 coexpression simultanément "suédois" APP humaine mutante (APP SWE) et Δ exon 9 mutant de la préséniline 1 humaine (PS1ΔE9) présente avec l' amylose cérébrale accélérée et neuroinflammation 15,16. En outre, nous avons généré des rats bi-transgéniques APP avec co - injectés swe et constructions PS1ΔE9 (ligne TgF344-AD, sur un fond Fischer 344). Contrairement aux modèles de souris transgéniques de l' amylose cérébrale, rats TgF344-AD développent amyloïde cérébrale qui précède tauopathie, perte apoptotique des neurones, et les troubles du comportement 17.

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour immunostaining microglie, phagolysosomes et dépôts de Aß dans des coupes de cerveau de souris APP / PS1 et rats TgF344-AD, et l'acquisition de grandes images confocale z-dimensionnelle. Nous détaillons dans la production et l' analyse des véritables reconstructions 3D à partir des ensembles de données confocale permettant la quantification de Aß absorption dans phagolysosomes microgliales silico. Plus largement, la méthodologie que nous détaillons ici peut être utilisé pour quantifier pratiquement toute forme de phagocytose in vivo.

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Protocol

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Déclaration d'éthique de la recherche: Toutes les expériences impliquant des animaux détaillés ici ont été approuvés par l'Université de Californie du Sud Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) et réalisée en stricte conformité avec les instituts nationaux de lignes directrices de santé et des recommandations de l'Association pour l' évaluation et l' accréditation des laboratoires animal Care international.

1. Rongeur Isolement du cerveau et préparation pour immunocoloration

JOUR 1:

  1. Placez rats TgF344-AD âgés (14-month-old) ou APP / PS1 souris (12-month-old) sous anesthésie isoflurane profonde continue (4%). Évaluer la profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil et l'absence de réflexe de retrait.
  2. Couper à travers les deux côtés de la cage thoracique et soulever pour exposer le cœur. Insérez une aiguille 23 G dans le ventricule gauche du cœur et de faire une petite incision dans l'oreillette droite. Passez à l'exsanguination par perfusion transcardial avec un tampon phosphate salin glacé(PBS) en utilisant une pompe péristaltique (30 ml pour les souris; 150-200 ml pour les rats).
  3. Faire une incision médiane caudale dans la peau et déplacer la peau et le muscle de côté. Couper à travers le sommet du crâne, le long de la ligne médiane et entre les yeux. Retirez les plaques osseuses et d'isoler l'ensemble du cerveau du crâne.
  4. Placez le cerveau dans une matrice rongeur du cerveau coronal et couper en quartiers. Incuber quarts postérieurs O / N (16 h) dans paraformaldehyde fixateur (4% PFA dans du PBS) à 4 ° C. Laver 3x dans du PBS, puis transfert à l'éthanol à 70%. Attention: PFA est toxique et doit être manipulé sous une hotte chimique avec des équipements de protection individuelle approprié.

JOUR 2:

  1. Placer quarts du cerveau dans des cassettes d'enrobage et déshydrater progressivement dans les tissus successivement plus concentrées, 1 h bains d'éthanol (70%, 80%, 95% et 100% x 3).
  2. Effacer l'éthanol à partir du tissu avec trois successifs bains de xylène 100% (1 h chacun). Attention: Xylène est toxique et should être traitées sous une hotte chimique avec des équipements de protection individuelle approprié.
  3. Incluez tissu dans des blocs de paraffine après deux bains fondus de cire de paraffine (56-58 ° C, 90 min chacun).

JOUR 3:

  1. Couper 10 sections um d'épaisseur de cerveaux de paraffine en utilisant un microtome. sections Tremper dans un bain d'eau (50 ° C pendant 1 min) et d'appliquer des lames de microscope. Laissez les diapositives sécher O / N, assurant l'adhérence des tissus à la diapositive.

2. immunocoloration

Remarque: Les différentes combinaisons d'anticorps peuvent être utilisés pour la procédure de coloration décrit ci-dessous. Un cocktail d' anticorps compatibles avec les tissus cérébraux provenant de rats et de souris sont indiquées dans le tableau 1.

JOUR 4:

  1. sections Déparaffiner du cerveau en utilisant 2x 100% bains de xylène (12 min chacun).
  2. Réhydrater les coupes de cerveau dans des bains successifs d'éthanol - 100% pendant 10 minutes, 95% pendant 5 minutes, 80% pendant 10 min, et enfin 70% pendant 15 min - followed par des lavages 3x PBS [5 min à température ambiante, avec une légère agitation]. Pendant ce temps, la solution de récupération d'antigène de chaleur à 95-97 ° C sur une plaque chauffante avec barreau magnétique d'agitation.
  3. Incuber des coupes de cerveau dans une solution de récupération d'antigène à 95-97 ° C pendant 30 min. Ensuite, lavez 3x dans du PBS (5 min à température ambiante, avec une légère agitation).
  4. Rapidement diapositives sèches à l'aide des essuie-tâche délicate pour éviter le séchage des tissus, et d'en tirer une barrière hydrophobe autour de la zone de tissu avec un stylo à barrière hydrophobe. Remplir la région de tissu entouré d'un tampon de blocage [PBS contenant 0,3% de Triton X-100 et 10% de sérum d'âne normal (PDN)] et incuber à température ambiante pendant 1 heure dans une chambre humidifiée.
  5. Remplacer le tampon de blocage avec l'anticorps primaire Iba1 (dilué dans du tampon de blocage) pour marquer phagocytes mononucléés, et laisser incuber O / N à 4 ° C dans une chambre humidifiée. Pour les hôtes d'anticorps et des dilutions de travail, voir le tableau 1 et la Table des matières.

JOUR 5:

  1. Rinceranticorps primaire avec des bains 3x PBS (5 min à température ambiante avec une légère agitation). Incuber avec l'anticorps fluorescent secondaire (conjugué à un fluorophore émission 594 nm) pendant 1 h (dans un tampon de blocage à température ambiante dans l'obscurité), suivie par des bains 3x PBS (5 min à température ambiante avec une légère agitation). A ce moment, de maintenir des sections dans l'obscurité pour éviter fluorescent signal de blanchiment.

JOUR 6 - 7:

  1. Répéter les étapes 2.5 et 2.6 avec CD68 (cerveaux de rats) ou LAMPE1 (tissu de souris) et des anticorps secondaires appropriés (couplé à un fluorophore émission 488 nm) pour étiqueter les phagolysosomes.

Jour 7 - 8:

  1. Répéter les étapes 2.5 et 2.6 avec OC (tissu de rat) ou 4G8 (Les cerveaux de souris) et des anticorps secondaires appropriés (couplé à un fluorophore 647 nm) pour marquer des dépôts de Aß.
    NOTE: En variante, l'anticorps 6E10 peut être utilisé avec succès à la fois sur les tissus de la souris et le rat. Pour les combinaisons appropriées d' anticorps, voir la Table des Matières
  2. Autoriser les sections à complètement O sec / N à la température ambiante dans l'obscurité. Ensuite, la couverture des spécimens avec une lamelle scellée par un milieu de montage de fluorescence contenant DAPI.

3. Acquisition de Grande Z-stack confocale datasets

Remarque: Ce protocole nécessite un microscope à balayage laser confocal entièrement automatique équipée d'un objectif 60X et 405 nm, 488 nm, 594 nm et 647 nm lasers. Tout le matériel est contrôlé par imagerie et contrôle laser de logiciels. Avant de commencer le protocole d'imagerie, la puissance sur l'ordinateur, lampe épifluorescence, microscope, les lasers et la caméra.

JOUR 9:

  1. Sélectionnez l'objectif du microscope 60X. Ajouter l'huile d'immersion à la lentille, et placer l'échantillon sur le porte-lame de platine du microscope. Soulever l'objectif jusqu'à ce que l'huile est en contact avec la lame. Ajuster le plan focal pour localiser les plaques d'amyloïde dans l'hippocampe ou du cortex cérébral en utilisant un éclairage à épifluorescence à travers les oculaires.
  2. Acquérir im confocalâges des phagocytes mononucléaires activées autour de dépôts d'amyloïde dans l'hippocampe ou du cortex de rongeurs par microscopie confocale (grossissement 60X, les étapes z pile: 0,25 um <z <0,40 um, le nombre d'étapes 25 <n <35).

4. q3DISM

Remarque: Afin d'obtenir des résultats significatifs, nous vous suggérons de l'analyse d'un minimum de 3 images par animal / région d'intérêt. Pour chaque image, l'abondance des cellules à analyser peut varier en fonction des paradigmes expérimentaux. Dans les résultats représentatifs indiqués dans le présent rapport, nous avons analysé 3 cellules / état (par exemple, les phagocytes mononucléaires éloignés ou associés à des plaques; voir les figures 1C - D et 2C - D).

JOUR 10:

  1. Analyser les ensembles de données confocale avec colocalisation traitement de l'image 3D et analyses scientifiques logiciels (coloc) module pour la proximité spatiale des Iba1 / CD68 (de tissu de rat) ou Iba1 / LAMP1 (tissu de la souris) coloration dans tous les z-plans simultanément.Créer Iba + / CD68 + ou + Iba / LAMPE1 + colocalisation canaux qui correspondent à phagolysosomes dans les phagocytes mononucléaires activées.
    1. Sélectionnez TRITC pour le canal A (correspondant à Iba1 coloration couplée à 594 nm fluorophore) et FITC pour le canal B (correspondant à CD68 ou LAMP1 coloration couplée à 488 nm fluorophore). Sur le côté droit de la fenêtre du logiciel pour 'vérification de mode,' 'seuil ", sélectionnez et pour' intensités de Coloc", sélectionnez "canaux de source».
    2. Cliquez sur "Modifier" pour sélectionner "la couleur de coloc 'sur le côté droit de la fenêtre du logiciel.
    3. Pour chaque canal indépendamment, ajuster les seuils d'inclure une coloration spécifique et d'exclure / signaux non spécifiques fond. Une fois ajusté, ne modifiez pas les seuils entre les images pour assurer une analyse impartiale. Les voxels colocalisés (pixels de tous les z-piles) apparaîtront dans la couleur sélectionnée dans l'étape 4.1.2 dans tous les z-piles SIMultaneously.
    4. Cliquez sur "construire le canal coloc '. Le canal de colocalisation créé apparaîtra dans la fenêtre de réglage de l'affichage.
    5. Cliquez sur le canal coloc pour ouvrir les statistiques de canal. Le «% du volume / matériau A au dessus du seuil colocalisés 'représente le% de signaux (Iba1 voxels correspondant au fluorophore 594 nm) colocalisés avec LAMPE1 ou un signal de CD68 (voxels correspondant à la fluorophore 488 nm). Plus simplement, cela est le volume de monocytes occupé par phagolysosomes (voir les figures 1C et 2C).
      NOTE: '% du volume / matériau B-dessus du seuil colocalisés' correspond à% du signal de LAMP1 ou CD68 colocalisés avec Iba1. Cela devrait être proche de 100%, comme phagolysosomes sont des structures intracellulaires. Les valeurs sont basées sur le ratio des signaux de tous les z-dessus du seuil des piles colocalisés.
  2. En utilisant le module de coloc, analyser le canal coloc créé à l'étape 4.1 pour la proximité spatiale avec OC (ti ratssu) ou 4G8 (tissu de souris) signaux Aß. Ceci permet une quantification de Aß encapsulé dans phagolysosomes.
    1. Sélectionnez le canal Un ensemble de données de coloc (correspondant à la Iba1 / CD68 ou d'un canal Iba1 / LAMPE1 de coloc créé à l'étape 4.1) et Cy5 pour le canal B (correspondant à OC ou 4G8 coloration couplée à 647 nm fluorophore).
    2. Construire un canal de coloc comme décrit dans les étapes 4.1.2 à 4.1.5.
    3. Cliquez sur le canal coloc pour ouvrir les statistiques de canal. Le «% du volume / matériau A au dessus du seuil colocalisés 'représente le% de Iba1 / ou LAMPE1 Iba1 / CD68 (voxels correspondant à la chaîne construite à l'étape coloc 4.1.5.) Colocalisés avec OC 4G8 ou d'un signal (voxels correspondant à la 647 nm fluorophore). Ceci est le volume occupé par phagolysosomique Aß (voir les figures 1D et 2D).
      NOTE: '% du volume / matériau B-dessus du seuil colocalisés' correspond% du signal de Aß totale colocalisés avec phagolysosomes.Ceci peut être utilisé pour évaluer la fraction de dépôts de Aß totaux encapsulées dans les phagolysosomes (non représentés dans les présents résultats représentatifs).
  3. Utilisez le module surpasser pour reconstruire les piles d'images confocale et de générer des modèles 3D de Aß encapsulées dans phagolysosomes monocytes.
    1. Dans la fenêtre 'de réglage de l'affichage ", sélectionnez TRITC (pour montrer que la coloration Iba1). Dans la fenêtre 'propriétés de volume », cliquez sur« ajouter une nouvelle surface.
    2. Dans l'étape «1/5 algorithme», dans les «paramètres», sélectionnez «surface». En outre, dans " la couleur" , sélectionnez le type de couleur dans la palette ou RGB et ajuster la transparence (rouge est fixé à 60% de transparence dans les figures 1B et 2B). Cochez la case 'select région d'intérêt ». Cliquez sur Suivant.
    3. Dans l' étape '2/5 région d'intérêt, «dessiner une fenêtre autour de la cellule d'intérêt en ajustant x, y et z les coordonnées (voir cases blanches dans les figures 1A 2A). Cliquez sur Suivant.
    4. Dans l'étape '3/5 source de canal », sélectionnez le canal source TRITC. Cochez la case «lisse» et régler le niveau de détail de la zone de surface à 0,4 um. Pour 'seuillage ", sélectionnez l'intensité absolue. Cliquez sur Suivant.
    5. Dans l'étape «seuil 4/5, 'ajuster seuil de sorte que le volume créé recouvre parfaitement avec le signal de canal TRITC. Cliquez sur Suivant.
    6. Dans l'étape '5/5 classer surfaces,' dans la section «type de filtre", sélectionnez les objets en fonction de leur taille à inclure ou à exclure des volumes à créer. Cliquez sur Terminer, exécuter toutes les étapes de création, et quitter l'assistant.
    7. Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.6 pour créer une surface 3D pour le canal FITC (LAMP1 + ou CD68 + phagolysosomes).
    8. Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.6 pour créer une surface 3D pour le canal Cy5 (OC + ou dépôts 4G8 + Aß).

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Representative Results

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En utilisant la méthodologie multi-scène pour q3DISM détaillée ci - dessus, nous sommes en mesure de quantifier Aß absorption dans phagolysosomes de monocytes dans le cerveau des APP / PS1 souris (figure 1) et les rats TgF344-AD (Figure 2). Par conséquent, la méthodologie de q3DISM a permis l'analyse des phagocytes mononucléaires dans des modèles de souris et de rat de la MA. Fait intéressant, le volume occupé par CD68 + phagolysosomes est significativement augmentée dans Iba1 + phagocytes mononucléaires associés à la comparaison avec éloignées des plaques à la fois dans l' APP / PS1 de souris (figure 1B, C) et des rats TgF344-AD (figure 2B, C). Ces données montrent que près de phagocytes mononucléés plaques sont prêtes pour la phagocytose par rapport aux cellules situées à l'écart de la plaque. Afin d'illustrer l'éventail des données de coloration différentes conformations Aß, nous avons utilisé divers anticorps chez la souris et le tissu de rat (détaillées dans Table 1 et discussion) - nous ne cherchons pas à comparer directement les modèles de souris et de rat de AD en ce qui concerne Aß phagocytose. Néanmoins, il convient de noter que la plaque associée phagocytes mononucléaires ont augmenté Aß absorption chez les souris APP / PS1 par rapport aux cellules éloignées des plaques (figure 1D). Rats TgF344-AD avaient très modeste absorption de fibrilles Aß globale, et aucun changement dans Aß fibrillaire phagocytose en fonction de la distance à partir de plaques (figure 2D).

Tableau 1
Tableau 1: immunocoloration mononucléaires phagocytes, phagolysosomes et amyloïde-β dans le tissu cérébral de souris APP / PS1 ou Rats TgF344-AD. Rat ou souris cocktails d'anticorps spécifiques sont répertoriés avec leur hôte respectif entre parenthèses. Les couleurs indiquent le fluorophore utilisé pour l'anticorps secondaire. Rouge: Alexa Fluor 594; vert: Alexa Fluor 488;Magenta: Alexa Fluor 647.

Figure 1
Figure 1: Visualisation et quantification de l' amylose amyloïde-β phagocytose Brains APP / PS1 souris. (A) Les images confocales de coupes de cerveau à partir d' un APP / PS1 souris montrant Iba1 + cellules (rouge), LAMP1 + phagolysosomes (vert) et 4G8 + dépôts amyloïdes (magenta). Encart 1 met en évidence un phagocyte mononucléaire éloigné de la plaque, tout en encadré 2 montre un phagocyte mononucléaire associé à la plaque. La barre d'échelle représente 50 um. Les petits panneaux sur la droite sont des agrandissements de Iba1, LAMP1 et 4G8 signaux dans empiècements 1 et reconstruction 2. (B) 3D de Iba1, LAMP1 et signaux 4G8 pour empiècements 1 et 2. La barre d'échelle désigne 3 pm. (C) Quantification de Iba1 + le volume des mononucléaires phagocytes occupé par LAMP1 + phagolysosomes. ( + intracellulaire phagolysosomique le volume occupé par 4G8 + Aß. Les valeurs sont basées sur le ratio signal (voxels) au dessus du seuil qui sont colocalisés. Les données sont présentées en tant que moyenne ± écart-type de la moyenne (n = 6 cellules) pour phagocytes mononucléaires éloignés des plaques (1), ou associés à des plaques (2). ** P <0,01 par le test t de l'étudiant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Visualisation et quantification de l' amylose amyloïde-β phagocytose dans le cerveau de rat TgF344-AD. (A) des images confocale des coupes de cerveau d'un rat TgF344-AD montrant Iba1 cellules + (rouge), CD68 + phagolysosomes (vert) et OC + soluble fibrillaire A & # 946; (magenta). Encart 1 met en évidence un phagocyte mononucléaire éloigné de la plaque, tout en encadré 2 montre un phagocyte mononucléaire associé à la plaque. La barre d'échelle représente 50 um. Les petits panneaux sur la droite sont des agrandissements de Iba1, CD68 et les signaux d'OC au sein de empiècements 1 et 2. (B) la reconstruction 3D de Iba1, CD68 et les signaux d'OC pour empiècements 1 et 2. La barre d'échelle représente 3 pm. (C) Quantification de Iba1 + le volume des mononucléaires phagocytes occupé par CD68 + phagolysosomes. (D) Quantification de CD68 + phagolysosomiale le volume intracellulaire occupé par OC + Aß. Les valeurs sont basées sur le ratio signal (voxels) au dessus du seuil qui sont colocalisés. Les données sont présentées en tant que moyenne ± écart-type de la moyenne (n = 6 cellules) pour phagocytes mononucléaires éloignés des plaques (1), ou associés à des plaques (2). ** P <0,01 par le test t de l'étudiant.rge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Le protocole que nous décrivons dans ce rapport pour une véritable quantification 3D de Aß phagocytose in vivo par des phagocytes mononucléaires repose sur un étiquetage spécifique des compartiments cellulaires et intracellulaires ainsi que les dépôts Aß. Plus précisément, on utilise Iba1 (ionisée calcium Binding molécule adaptatrice 1), une protéine qui est impliquée dans fronçage de la membrane et une phagocytose lors de l' activation des cellules 18, 19, pour colorer phagocytes mononucléaires cérébraux. Alors que les cellules Iba1 + sont généralement considérés comme des cerveaux résidant microglie, il reste possible que infiltrant périphériquement phagocytes mononucléaires comprennent un sous - ensemble de cellules immunomarquées. Phagolysosomes intracellulaires sont révélés avec des anticorps reconnaissant les membres de la famille lysosomale / glycoprotéine de membrane endosomale associée (LAMP): LAMPE1 20 ou 21 CD68. Celle-ci est principalement localisée au niveau des lysosomes et endosomes, avec une petite fraction de circulation dans la cellule deta tête. Anticorps LAMPE1 et CD68 ont tous deux été utilisés avec succès dans les tissus de rat et de la souris, et la décision sur laquelle l'utilisation est principalement dépendante de la foule d'autres anticorps utilisés pour co-coloration (voir tableau 1). Il est important de noter que différents anticorps peuvent être utilisés pour la détection de Aß. Dans les tissus de souris, 4G8 (reconnaissant les résidus 17 acide humaine et amino souris - 24 du peptide Aß 22, figure 1) et 6E10 (reconnaissant les résidus d'acides aminés humaine 1 - 17 23, données non présentées) ont été utilisés avec succès, ce qui permet la détection et la quantification du contenu Aß dans LAMP1 + ou CD68 + phagolysosomes présents dans Iba1 + phagocytes mononucléaires. Grâce à notre méthodologie de q3DISM, nous avons observé une augmentation de charge Aß dans Iba1 + cellules associées à la réduction globale de la charge Aß dans les cerveaux de APPPS1 / IL-10 - / - souris 16, tandis que d' autres ont montré une diminution absorption Aß en Iba1 + < / sup> cellules accompagnée par une augmentation de la charge et de la plaque de volume Aß dans les cerveaux de Rag-5xfAD souris 24. Ces résultats suggèrent que le phénomène observé est un «instantané» de la phagocytose Aß actif, bien que notre méthode ne peut être utilisée pour prédire si le matériel phagocyté est efficacement digéré et effacé.

Dans les tissus de rat, nous avons détecté des dépôts de Aß en utilisant OC (reconnaissant Aß solubles 42 / oligomères fibrilles 25,26, figure 2) ou 6E10 17 (non représenté). Fait intéressant, très peu OC + fibrilles étaient présents dans phagolysosomes de monocytes dans le cerveau de rats TgF344-AD. Ce phénomène a déjà été rapporté chez des souris transgéniques APP23 utilisant immunomarquage et reconstruction 3D 27. Remarque: une variété d'anticorps pour la détection de différentes espèces Aß / conformères sont disponibles et peuvent potentiellement être testé et utilisé à la discrétion de l'utilisateur.

nt "> Notre technique de q3DISM a été adoptée par nous et d' autres pour quantifier la phagocytose de Aß dans le cadre de la MA 16,24,28. Cependant, le procédé peut être adapté pour évaluer pratiquement toute forme de phagocytose. Il peut également être appliqué à des tissus autre que le cerveau, et à d'autres espèces animales (y compris les humains). les procédures décrites dans ce protocole reposent sur immunocoloration standard, détectée avec fluorescence et imagé avec un microscope confocal. dans ce rapport, nous avons utilisé des tissus de paraffine selon les directives fournies par les fabricants d'anticorps. Si on le désire, le présent protocole peut également être optimisée pour les tissus frais (incorporé dans 2% d'agarose dans du PBS). le protocole peut également être optimisé pour détecter la phagocytose des coaggregating protéines. Ceci est rendu possible par la coloration et l'acquisition d' images composées de plus de 4 couleurs fluorescentes 29. Dans ce cas, la création de la première chaîne de colocalisation (monocytes / phagolysosome) sera suivie par la créationd'un second canal de colocalisation (protéine agrégée 1 / co-protéine agrégée 2). Ensuite, les deux voies seront utilisées pour l'analyse et la modélisation 3D.

La technique de q3DISM est limitée principalement par la spécificité et la sensibilité de l'immunocoloration, la qualité des anticorps, et l'approche de colocalisation. Cette procédure en plusieurs étapes a quelques pièges potentiels qui peuvent affecter la qualité de la coloration et, par conséquent, la quantification de Aß 3D d'absorption. La première étape critique du procédé est l'isolement des cerveaux de rongeurs. En effet, la manipulation des tissus attention est fondamentale pour éviter des dommages au cerveau et de garantir que les structures cérébrales restent intactes lorsque sectionnée. Deuxièmement, le temps de fixation de tissu est très important puisque plus-fixation (plus de 16 h à 4% PFA) limite la détection de phagolysosomes subcellulaires et contenu Aß. Surtout, la coloration successive de 1), 2) les monocytes et les phagolysosomes 3) Aß est critique pour le succès de la méthode. Il est essential à utiliser les anticorps consecutively- pas concomitantly. En outre, l'acquisition des images confocales z pile est d'une importance capitale, car la modélisation en 3D des cellules, des phagolysosomes et le peptide Aß, ainsi que colocalisation des analyses dépendent de la qualité de l'imagerie des structures cellulaires et sous-cellulaires à travers l'épaisseur de la section de tissu. Enfin, l'ajustement des seuils dans le logiciel est crucial pour la modélisation 3D et pour l'analyse de colocalisation. En effet, les seuils pour les différents canaux doivent être choisis avec soin, car ils détermineront quel signal est inclus (spécifique) ou exclu (arrière-plan) de l'analyse. Il est également fondamental que les seuils choisis restent cohérents entre les échantillons dans le cas de la comparaison des différents animaux / spécimens. Jusqu'à présent, immunohistostaining classique, l' imagerie par résonance magnétique et la tomographie par émission de positons ont été les méthodes d'imagerie de choix pour la visualisation et la quantification in vivo de Aß30. Bien que très utile pour la quantification à grande échelle de la charge amyloïde dans le cerveau des rongeurs ou des patients AD, ces méthodes sont inefficaces pour la visualisation de intracellulaire Aß. D' autres techniques utilisant la microscopie confocale, la spectroscopie de fluorescence et de débit existent cytométrie et ont été utilisés par nous et d' autres pour discriminer et quantifier le contenu Aß intracellulaire in vitro 16,31,32. Immunomarquage couplée à la reconstruction 3D a déjà été utilisé pour mettre en évidence l'absence de fibrilles amyloïdes dans les microglies in vivo chez APP23 souris transgéniques 27, et une autre étude a utilisé avec succès imagerie confocale et reconstruction 3D de la surface de la microglie associée avec des plaques de bêta-amyloïde pour montrer Aß limitée l' interaction et l' absorption 33. Cependant, ces techniques ne permettent pas de quantification intra-espèces Aß phagolysosomique. D' autres ont récemment développé une base de fluorescence dans un essai in vivo permettant la mesurede l' activité phagocytaire par les macrophages périphériques chez le rat 34. Cette méthode permet ingénieusement pour la quantification de bioprobes fluorescent phagolysosomes in vivo, cependant, les données disponibles à ce jour sont limitées à la périphérie.

A notre connaissance, q3DISM est la première méthode qui permet la visualisation 3D et la quantification de la phagocytose de Aß dans le cerveau des modèles de rongeurs de la MA. Ce formidable outil sera sans aucun doute ouvrir la voie à une compréhension plus profonde de la phagocytose cérébrale Aß, et peut également se révéler utile dans d'autres contextes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

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3D quantitative<em&gt; In Silico</em&gt; Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie d&#39;Alzheimer
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Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

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