Summary
פיתחנו מתודולוגיה 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) של-β עמילואיד מוחין (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו ניתן להכליל עבור quantitation של כמעט כל אירוע phagocytic in vivo.
Abstract
Neuroinflammation מוכרת כיום כגורם אטיולוגי מרכזי למחלות ניווניות. פגוציטים mononuclear הם תאי מולד חיסוניים אחראים phagocytosis ופינוי פסול שאריות. תאים אלה כוללים מקרופאגים CNS-תושב המכונה microglia, ואת phagocytes mononuclear שחדר מהפריפריה. במיקרוסקופ אור כבר משמש בדרך כלל כדי לחזות phagocytosis ב מכרסמים או דגימות מוח אנושי. עם זאת, שיטות איכותיות לא ספקו ראיות מוחלטות של in vivo phagocytosis. כאן אנו מתארים 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM), שיטה חזקה המאפשרת לכמת 3D אמיתי של עמילואיד-β (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במחלת מכרסם אלצהיימר (AD) מודלים. השיטה כרוכה fluorescently חזותי Aβ כמוסה בתוך phagolysosomes בסעיפי מוח מכרסם. מערכי נתונים confocal z-ממדי גדולים אז 3D המשוחזר כדי לכמת את A &# 946; מרחבית colocalized בתוך phagolysosome. אנו מדגימים את היישום המוצלח של q3DISM כדי מוח עכבר וחולדה, אבל מתודולוגיה זו ניתן להרחיב כמעט כל אירוע phagocytic בכל רקמה.
Introduction
מחלת אלצהיימר (AD), דמנציה 1 הקשורה הגיל הנפוץ ביותר, מאופיין עמילואיד-β מוחין (Aβ) הצטברות כמו "סנילי" הפלאק β עמילואיד, neuroinflammation ברמה נמוכה כרונית, tauopathy, איבוד עצבי, והפרעה קוגניטיבית 2 . במוחות המטופל לספירה, neuroinflammation מיועד ידי תגובתי אסטרוציטים פגוציטים mononuclear (המכונה microglia, למרות המרכזי שלהם לעומת ממוצא הפריפריה עדיין לא ברור) שמסביב Aβ פיקדונות 3. כמו זקיפים החיסון המולדת של מערכת העצבים המרכזית, microglia ממוקמים מרכזי להצליל Aβ. עם זאת, גיוס microglial הפלאק Aβ מלווה מעט מאוד, אם בכלל, Aβ phagocytosis 4,5. אחת ההשערות היא כי microglia הם בתחילה נוירו ידי phagocytozing מכלולים קטנים של Aβ. עם זאת, בסופו של דבר תאים אלה הופכים הנוירו כמו נטל Aβ המכריע ו / או ד תפקודית כתוצאה מהזדקנותecline, מעורר microglia לתוך פנוטיפ מעודד דלקת מתפקדת, תורם לירידה ברעילות וקוגניטיביות 6.
הגנום כולו אחרונים מחקרים אגודים (GWAS) זיהו מקבץ של אללים לסיכון לחלות באלצהיימר השייכים מסלולי חיסון מולדים ליבת 7 לווסת phagocytosis 8-11. כתוצאה מכך, התגובה החיסונית בתצהיר עמילואיד מוחין הפך אזור מרכזי של עניין, הן מבחינת הבנת האטיולוגיה לספירה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות 12-14. עם זאת, יש צורך חיוני מתודולוגיה להערכת phagocytosis Aβ in vivo. כדי לתת מענה לצורך מסופקים זה, פיתחנו 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) כדי לאפשר quantitation 3D אמיתי של phagocytosis Aβ מוחין ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר דמוי.
מוגבל רק על ידי המידה שבה הם לשחזר מחלה, במודלים של בעלי החיים ישהוכח שלא יסולא בפז להבנה לספירה pathoetiology ולהערכה רפוי ניסיון. בשל העובדה כי מוטציות בגנים presenilin (PS) ו חלבון מקדים עמילואיד (APP) עצמאי לגרום לספירה אוטוזומלית דומיננטית, transgenes מוטציה אלה נעשה שימוש נרחב כדי ליצור מודלים מכרסם מהונדס. מהונדס APP / PS1 עכברים coexpressing זמנית "שוודית" APP האנושי מוטציה (swe APP) ו Δ אקסון 9 presenilin 1 אדם מוטציה (PS1ΔE9) הנוכחי עם עמילואידוזיס מוחין מואץ neuroinflammation 15,16. יתר על כן, יצרנו חולדות דו-מהונדס coinjected עם APP swe ובונה PS1ΔE9 (קו TgF344-AD, על רקע פישר 344). בניגוד למודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס מוחין, חולדות TgF344-AD לפתח עמילואיד מוחין שמקדים tauopathy, אובדן אפופטוטיים של נוירונים, ו ליקוי התנהגותי 17.
בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור IMMunostaining microglia, phagolysosomes ופיקדונות Aβ בסעיפי מוח מעכברי APP / PS1 וחולדות TgF344-AD, ורכישת תמונות confocal z-ממדי גדולות. נפרטנו בדור סיליקון וניתוח של שחזורי 3D אמיתיים ממערכות נתוני confocal המאפשרים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes microglial. באופן כללי יותר, מתודולוגיה נפרט כאן ניתן להשתמש כדי לכמת כמעט כל צורה של phagocytosis in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרה של אתיקה של מחקר: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים המפורטים כאן אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים מוסדיים דרום קליפורניה ועדת שימוש (IACUC) וביצע בהתאם קפדנית עם National Institutes of הנחיות בריאות והמלצות מהאגודה הערכה וההסמכה של מעבדה הבינלאומי טיפול בבעלי חיים.
בידוד מוח 1. מכרסמים והכנת Immunostaining
יום 1:
- מניחים חולדות TgF344-AD בגילאי (14 בן חודש) או APP / עכברים PS1 (12 בן חודש) בהרדמה isoflurane עמוק רציפה (4%). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן והיעדר רפלקס נסיגה.
- חותך דרך משני צידי בית החזה ולהרים כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט 23 G לתוך החדר השמאלי של הלב ולעשות חתך קטן לתוך העלייה הימנית. המשך exsanguination ידי זלוף transcardial עם פוספט שנאגרו מלוחים קר כקרח(PBS) באמצעות משאבת peristaltic (30 מ"ל לעכברים; 150 - 200 מ"ל לחולדות).
- ביצוע חתך קו האמצע הזנב לתוך העור ולהזיז את העור והשרירים בצד. חותך דרך החלק העליון של הגולגולת לאורך קו האמצע בין העיניים. הסר את צלחות עצם ולבודד את המוח כולו מהגולגולת.
- מניח את המוח לתוך מטריצת מוח מכרסם העטרה ופורס אותו לרבעים. דגירת רבעים אחוריים O / N (16 שעות) מקבע paraformaldehyde (PFA 4% PBS) ב 4 ° C.. 3x לשטוף PBS, ולאחר מכן להעביר עד 70% אתנול. זהירות: PFA הוא רעיל יש לטפל מתחת למכסה המנוע כימי עם ציוד מיגון אישי המתאים.
יום 2:
- מניח רבעים מוח לתוך קלטות הטבעה בהדרגה מייבשי רקמה באמבטיות יותר מרוכזות 1 h אתנול ברציפות (70%, 80%, 95% ו -100% x3).
- אתנול מנקה מהרקמה עם שלוש אמבטיות קסילן רצופות 100% (1 h כל אחד). זהירות: קסילן רעיל shולד להיות מטופלים מתחת למכסה המנוע כימי עם ציוד מיגון אישי המתאים.
- הטמע רקמה בבלוקי פרפין לאחר שתי אמבטיות מותכות פרפין שעווה (56 - 58 ° C, 90 דקות כל אחד).
יום 3:
- חותכים 10 סעיפים מיקרומטר בעובי של המוח פרפין מוטבע באמצעות microtome. סעיפים לטבול באמבט מים (50 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות) ולמרוח על שקופיות מיקרוסקופ. השאירו את השקופיות להתייבש O / N, הבטחת הידבקות רקמות לשקופית.
2. Immunostaining
הערה: שילובים שונים של נוגדנים יכולים להיות מנוצלים עבור ההליך המכתים המתואר להלן. קוקטיילים נוגדן תואם רקמות המוח מפני חולדות ועכברים מפורטים בטבלה 1.
יום 4:
- Deparaffinize החלק במוח באמצעות אמבטיות קסילן 2x 100% (12 דקות כל אחד).
- רעננותם חלקים במוח באמבטיות אתנול רצופות - 100% במשך 10 דקות, 95% במשך 5 דקות, 80% במשך 10 דקות, ולבסוף 70% במשך 15 דקות - followeד על ידי שטיפות 3x PBS [5 דקות ב RT, עם תסיסה אור]. בינתיים, פתרון יחזור אנטיגן חום עד 95 - 97 ° C על פלטה חשמלית עם ערבוב בר מגנטי.
- דגירה חלקה במוח בתמיסה יחזור אנטיגן ב 95 - C ° 97 למשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף 3x ב PBS (5 דקות ב RT, עם תסיסה אור).
- מגלשות יבשות במהירות באמצעות מגבי משימה עדינים כדי למנוע התייבשות רקמה, ולהסיק מחסום הידרופובי מסביב לאזור הרקמה עם עט מחסום הידרופובי. מלא את אזור הרקמה הקיף עם חסימת חיץ [PBS המכיל 0.3% Triton X-100 ו -10% סרום דונקי רגיל (NDS)], לדגור על RT עבור 1 שעות בתא humidified.
- חלף חיץ חסימה עם נוגדן ראשוני Iba1 (מדולל במאגר חסימה) לתייג פגוציטים mononuclear, דגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. עבור המארחים נוגדן דילולים עובדים, ראה טבלה 1 טבלה של חומרים.
יום 5:
- לִשְׁטוֹףנוגדן ראשוני עם אמבטיות 3x PBS (5 דקות ב RT עם תסיסה אור). דגירה עם נוגדנים משני ניאון (מצומדות עם fluorophore פליטה 594 ננומטר) עבור H 1 (בחסימת המאגר ב RT בחושך) ואחריו אמבטיות 3x PBS (5 דקות ב RT עם תסיסה אור). בשלב זה, לשמור על סעיפים בחושך כדי למנוע הלבנת אות ניאון.
יום 6 - 7:
- חזור על שלבי 2.5 & 2.6 עם CD68 (מוח עכברוש) או LAMP1 (רקמות עכבר) נוגדנים ונוגדנים משני מתאימים (בשילוב עם fluorophore פליטה 488 ננומטר) לתייג phagolysosomes.
יום 7 - 8:
- חזור על שלבי 2.5 & 2.6 עם OC (רקמות חולדה) או 4G8 (מוח עכבר) נוגדנים ונוגדנים משני מתאימים (מצמיד את fluorophore 647 ננומטר) לתייג פיקדונות Aβ.
הערה: לחלופין, נוגדני 6E10 יכול לשמש היא בהצלחה על רקמות עכבר וחולדה. עבור שילובים נוגדנים מתאימים, ראה טבלה של חומרים - אפשר סעיפים לגמרי יבש O / N ב RT בחושך. לאחר מכן, לכסות דגימות עם תלוש כיסוי האטום על ידי תקשורת הרכבת קרינה המכילה DAPI.
3. רכישת מערכי נתונים גדולים Confocal Z- מחסנית
הערה: פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר אוטומטי לחלוטין מצויד מטרה 60X ו 405 ננומטר, 488 ננומטר, 594 ננומטר, ו 647 nm לייזרים. כל הציוד הוא מחשב בשליטת תוכנות שליטה הדמיה לייזר. לפני תחילת פרוטוקול ההדמיה, כוח על מנורת המחשב, epifluorescent, מיקרוסקופ, לייזרי מצלמה.
יום 9:
- בחר את מטרת מיקרוסקופ 60X. מוסיפים שמן טבילה העדשה, ומניחים את המדגם על מחזיק השקופיות הבמה מיקרוסקופ. הרם את המטרה עד שהשמן יוצר קשר עם השקופיות. התאם את מישור המוקד לאיתור פלאק עמילואיד בהיפוקמפוס או קליפת המוח באמצעות תאורה epifluorescent דרך oculars.
- רוכשת im confocalהגילאים של פגוציטים mononuclear מופעל שמסביב פיקדונות עמילואיד בהיפוקמפוס או קליפת מכרסמים על ידי מיקרוסקופ confocal (בהגדלה 60X, צעדים Z- מחסנית: 0.25 מיקרומטר <z <0.40 מיקרומטר, מספר צעדים 25 <n <35).
4. q3DISM
הערה: על מנת להניב תוצאות משמעותיות, אנו ממליצים לנתח מינימום של 3 תמונות לכל חיה / אזור של עניין. עבור כל תמונה, השפע של תאים לנתח עשוי להשתנות תלוי פרדיגמות ניסוי. בתוצאות נציג שהוכח בדו"ח זה, ניתחנו מצב 3 תאים / (למשל, mononuclear פגוציטים רחוקים או הקשורים הפלאק; לראות 1C דמויות - D ו- 2C - D).
יום 10:
- לנתח מערכי נתונים confocal עם colocalization תוכנת ניתוח עיבוד תמונה 3D מדעית (coloc) מודול בקרבה מרחבית של Iba1 / CD68 (רקמות חולדה) או Iba1 / LAMP1 (רקמות העכבר) מכתים בכל z-מטוסים בו זמנית.צור איבא + / CD68 + או איבא + / LAMP1 + colocalization הערוצים מתאימות phagolysosomes בתוך פגוציטים mononuclear מופעל.
- בחר TRITC עבור ערוץ A (המקביל ל מכתים Iba1 יחד עם 594 fluorophore ננומטר) FITC עבור B ערוץ (המקביל ל CD68 או מכתים LAMP1 יחד עם 488 fluorophore ננומטר). בצד הימני של חלון התוכנה עבור 'בדיקת מצב, בחר' סף 'ועבור' עוצמות coloc 'בחר' ערוצי מקור '.
- לחץ על 'ערוך' כדי לבחור 'צבע coloc' בצד הימני של חלון התוכנה.
- עבור כל ערוץ בנפרד, להתאים ספים לכלול מכתים ספציפי ואינו כולל אותות רקע / הלא ספציפיים. לאחר מותאם, לא לשנות ספים בין תמונות על מנת להבטיח ניתוח משוחד. ווקסלים colocalized (פיקסלים מכל Z- ערימות) יופיעו בצבע שנבחר בשלב 4.1.2 בכל Z- ערימות SIMultaneously.
- לחץ על 'לבנות ערוץ coloc'. ערוץ colocalization נוצר יופיע בחלון התאמת תצוגה.
- הקישו על ערוץ coloc לפתוח סטטיסטיקת הערוץ. ערך '% נפח / חומר מעל לסף colocalized' מייצגים את% ממסר Iba1 (ווקסלים המתאימים fluorophore 594 ננומטר) colocalized עם LAMP1 או אות CD68 (ווקסלים המתאימים fluorophore 488 ננומטר). יותר פשוט, זה הוא נפח מונוציטים שנכבשו על ידי phagolysosomes (ראה איורים 1 ג ו 2C).
הערה: '% של נפח / חומר B מעל לסף colocalized' תואמת% ממסר LAMP1 או CD68 colocalized עם Iba1. זה צריך להיות קרוב ל -100%, כפי phagolysosomes הם מבנים תאיים. הערכים מבוססים על יחס של אות מכל Z- ערימות מעל לסף colocalized.
- באמצעות מודול coloc, לנתח את ערוץ coloc שנוצרה בשלב 4.1 בקרבה מרחבית עם OC (עכברוש tissue) או 4G8 (רקמות העכבר) אותות Aβ. זה מאפשר לכמת Aβ הכמוס בתוך phagolysosomes.
- בחרו בערוץ מערך נתונים coloc (המקביל ל Iba1 / CD68 או Iba1 / LAMP1 coloc ערוץ שנוצרה בשלב 4.1) ו Cy5 עבור B ערוץ (fluorophore המתאים OC או 4G8 מכתים יחד עם 647 ננומטר).
- בניית ערוץ coloc כמתואר 4.1.2 צעדים 4.1.5.
- הקישו על ערוץ coloc לפתוח סטטיסטיקת הערוץ. ערך '% נפח / חומר מעל לסף colocalized' מייצגים את% של Iba1 / LAMP1 או Iba1 / CD68 (ווקסלים מקבילים לערוץ coloc נבנה בשלב 4.1.5.) Colocalized עם OC או אות 4G8 (ווקסלים מתאימים 647 fluorophore ננומטר). זהו נפח phagolysosomal שנכבשו על ידי Aβ (ראו תרשימים 1D ו 2 ד).
הערה: '% של נפח / חומר B מעל לסף colocalized' מתכתב עם% ממסר Aβ הכולל colocalized עם phagolysosomes.זה יכול לשמש כדי להעריך את החלק היחסי של פיקדונות Aβ הכוללים כמוסות בתוך phagolysosomes (לא מוצג בתוצאות הנציג הנוכחיות).
- השתמש מודול לעלות לשחזר את ערימות תמונת confocal וליצור מודלי 3D של Aβ הכמוס בתוך phagolysosomes מונוציטים.
- בחלון 'תצוגת ההתאמה', בחר TRITC (כדי להציג רק מכתים Iba1). בחלון 'מאפייני נפח', לחץ על 'הוסף שטח חדש'.
- בשלב '1/5 אלגוריתם', ב 'הגדרות', בחר 'משטח'. כמו כן, ב 'צבע', בחר סוג צבע צבעים או RGB ולהתאים שקיפות (אדום מוגדר ב 60% שקיפות איורים 1B ו -2). סמן תיבה 'בחר אזור של אינטרס ". לחץ הבא.
- בשלב '2/5 האזור של עניין, "לצייר חלון סביב תא העניין על ידי התאמת x, y ו- z קואורדינטות (ראו תיבות לבנות איורי 1A 2 א). לחץ הבא.
- בשלב 'ערוץ מקור 3/5', בחרו בערוץ מקור TRITC. סמן את התיבה 'חלקה' ורמת פירוט שטח מוגדר 0.4 מיקרומטר. עבור 'thresholding,' לבחור עוצמת מוחלטת. לחץ הבא.
- בשלב '4/5 סף, "להתאים סף כך הנפח נוצר חופף באופן מושלם עם אות ערוץ TRITC. לחץ הבא.
- בשלב '5/5 לסווג משטחים, "בסעיף" סוג מסנן, "בחר אובייקטים בהתאם לגודלם להיכלל או מחוץ כרכים להיווצר. לחץ על סיום, לבצע את כל שלבי היצירה, וצא האשף.
- חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.6 כדי ליצור משטח 3D עבור הערוץ FITC (LAMP1 + או CD68 + phagolysosomes).
- חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.6 כדי ליצור משטח 3D עבור הערוץ Cy5 (OC + או 4G8 + Aβ פיקדונות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות מתודולוגיה רב שלבית עבור q3DISM שפורטו לעיל, אנו מסוגלים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes מונוציטים במוחם של עכברים APP / PS1 (איור 1) וחולדות TgF344-AD (איור 2). לכן, המתודולוגיה q3DISM אפשרה ניתוח פגוציטים mononuclear במודלים של עכברים וחולדה של AD. מעניין לציין, כי נפח שנכבשו על ידי CD68 + phagolysosomes הוא גדל באופן משמעותי ב phagocytes mononuclear Iba1 + הקשורים לעומת רחוקים הפלאק הן APP / עכברים PS1 (איור 1 ב ', ג') וחולדות TgF344-AD (תרשים 2B, C). נתונים אלה מראים כי phagocytes mononuclear ליד לוחות עומדים על phagocytosis לעומת התאים ממוקמים הרחק פלאק. כדי להמחיש את מגוון נתוני מכתים conformers Aβ השונה השתמשנו נוגדנים שונים עכבר ורקמות חולדה (מפורט Table 1 ודיון) - איננו מחפשים להשוות עכבר וחולדה מודלים של מחלת אלצהיימר ישירות לגבי phagocytosis Aβ. אף על פי כן, זה היה ראוי לציון כי phagocytes mononuclear הקשורים פלאק עלה ספיגת Aβ בעכברים APP / PS1 בהשוואה לתאים רחוקים הפלאק (1D איור). חולדות TgF344-AD היו ספיגות מאוד צנוע של סיבי Aβ הכולל, ואין שינוי phagocytosis ליפון Aβ כפונקציה של מרחק בין לוחות (איור 2 ד).
טבלה 1: Immunostaining mononuclear Phagocytes, Phagolysosomes ו עמילואיד-β ברקמת המוח מעכברים APP / PS1 או חולדות TgF344-AD. עכברוש או עכבר קוקטיילי נוגדן ספציפיים מפורטים עם המארח שלהם בסוגריים. הצבעים מציינים את fluorophore המשמש נוגדנים משני. אדום: Alexa פלואוריד 594; ירוק: Alexa פלואוריד 488;מגנט: Alexa פלואוריד 647.
איור 1: ויזואליזציה כימות של עמילואיד-β Phagocytosis ב APP / PS1 עכבר המוח. (א) תמונות Confocal של חלקים במוח של העכבר APP / PS1 מראה Iba1 + תאים (אדום), LAMP1 + phagolysosomes (ירוק) ו 4G8 + פיקדונות עמילואיד (מג'נטה). הבלעה 1 מדגיש תָא בַּלעָן mononuclear רחוק מן פלאק, תוך הבלעה 2 מציג תָא בַּלעָן mononuclear הקשורים פלאק. סרגל קנה מידה מציין 50 מיקרומטר. קטן לוחות מימין הם הגדלות של Iba1, LAMP1 ו 4G8 אותות בתוך ריבועי 1 ו -2 (ב) שחזור 3D של Iba1, LAMP1 ו 4G8 אותות עבור ריבועי 1 ו -2 בר סולם מציין 3 מיקרומטר. (C) כימות של נפח תָא בַּלעָן mononuclear Iba1 + שנכבשו על ידי LAMP1 + phagolysosomes. (
איור 2: ויזואליזציה כימות של עמילואיד-β Phagocytosis במוחות העכברים TgF344-AD. (א) תמונות Confocal של חלקים במוח של חולדה TgF344-AD מראה תאים Iba1 + (אדום), CD68 + phagolysosomes (ירוק), ו OC + A סיבי מסיסים & # 946; (מַגֶנטָה). הבלעה 1 מדגיש תָא בַּלעָן mononuclear רחוק מן פלאק, תוך הבלעה 2 מציג תָא בַּלעָן mononuclear הקשורים פלאק. סרגל קנה מידה מציין 50 מיקרומטר. לוחות קטנים יותר בצד ימין הם הגדלות של Iba1, CD68 אותות OC בתוך ריבועי 1 ו -2 (ב) שחזור 3D של Iba1, CD68 אותות OC עבור ריבועי 1 ו בר סולם 2. מציין 3 מיקרומטר. (C) כימות של נפח תָא בַּלעָן mononuclear Iba1 + שנכבשו על ידי CD68 + phagolysosomes. (ד) כימות של נפח CD68 + phagolysosomal התאי שנכבש על ידי OC + Aβ. הערכים מבוססים על יחס של אות (ווקסלים) מעל סף אשר colocalized. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (n = 6 תאים) עבור פגוציטים mononuclear רחוקים הפלאק (1), או הקשורים הפלאק (2). ** P <0.01 על ידי מבחן t.rge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול זה אנו מתארים בדוח זה כדי לכמת 3D אמיתי של phagocytosis Aβ in vivo על ידי פגוציטים mononuclear מסתמך על תיוג ספציפי של תאים סלולריים ו subcellular וכן פיקדונות Aβ. באופן ספציפי, אנו משתמשים Iba1 (מיונן בסידן כריכה מתאם המולקולה 1), חלבון כי הוא מעורב עלעול קרום phagocytosis על תא הפעלה 18, 19, להכתים פגוציטים mononuclear מוחין. בעוד Iba1 + תאים נחשבים בדרך כלל microglia מוח-תושב, אפשרי עדיין כי שולי פגוציטים mononuclear שחדר מהווים תת-קבוצה של תאי immunolabeled. Phagolysosomes התאי מתגלה עם נוגדני הכרת חברי גליקופרוטאין הקרום ליזוזומלית / קשור-endosomal (LAMP) המשפחה: LAMP1 20 או CD68 21. זה האחרון הוא מקומי בעיקר lysosomes ו endosomes, עם חלק קטן יותר במחזור לתא surface. נוגדנים LAMP1 ו CD68 כבר הן השתמשו בהצלחה רקמות חולדה ועכבר, וההחלטה שעליה להשתמש תלויה בעיקר על שורה של נוגדנים אחרים המשמשים שיתוף מכתים (ראה טבלה 1). חשוב להיות מודעים לכך נוגדנים שונים יכול לשמש לגילוי של Aβ. ברקמת עכבר, 4G8 (הכרת שאריות חומצת אדם ועכבר אמינו 17 - 24 מתוך Aβ פפטיד 22, איור 1) ו 6E10 (הכרת שאריות חומצת אמינו אדם 1 - 17 23, מידע לא מוצג) שמש בהצלחה, המאפשרת איתור quantitation תוכן Aβ ב LAMP1 + או CD68 + phagolysosomes נוכח פגוציטים mononuclear Iba1 +. שימוש במתודולוגיה q3DISM שלנו, צפינו עומס Aβ מוגבר Iba1 + תאים קשורים להפחתה הגלובלית של עומס Aβ במוחות של APPPS1 / IL-10 - / - עכברים 16, בעוד שבאחרים נרשמו ירידה ספיגה Aβ לתוך Iba1 + < / sup> תאי מלווה נפח מטען ורובד Aβ מוגבר במוחם של עכברי Rag-5xfAD 24. תוצאות אלו מצביעות כי תופעה שנצפתה היא "תמונת מצב" של phagocytosis Aβ פעיל, למרות המתודולוגיה שלנו לא יכול לשמש כדי לחזות אם החומר phagocytosed מתעכל ביעילות ופינה.
ברקמות עכברוש, זיהינו פיקדונות Aβ באמצעות OC (הכרה מסיסים Aβ 42 oligomers / הסיבים 25,26, איור 2) או 6E10 17 (לא מוצג). מעניין לציין, כי הסיבים OC + מעט מאוד נכחו phagolysosomes מונוציטים במוחות העכברים TgF344-AD. תופעה זו דווחה בעבר בעכברים טרנסגניים APP23 באמצעות מכתים immunogold ושחזור 3D 27. הערה: מגוון של נוגדנים לגילוי של מיני Aβ שונה / conformers זמין וניתן נבדק המועסקים על פי שיקול דעתו של המשתמש.
NT "> טכניקת q3DISM שלנו אומצה על ידינו ואחרים לכמת phagocytosis Aβ בהקשר של 16,24,28 לספירה. עם זאת, השיטה יכולה להיות מותאמת להעריך כמעט כל צורה של phagocytosis. זה עלול לחול גם על רקמות מלבד המוח, וכדי בעלי חיים אחרים (כולל בני אדם). הנהלים המתוארים בפרוטוקול זה להסתמך על immunostaining הרגיל, מזוהה עם קרינה צלמה באמצעות מיקרוסקופ confocal. בדו"ח זה, השתמשנו רקמות מוטבעות פרפין פי הנחיות המסופק על ידי יצרני הנוגדן. אם תרצה, בפרוטוקול הנוכחי גם יכול להיות מותאם במיוחד רקמה טריה (מוטבע agarose 2% ב PBS). הפרוטוקול יכול להיות מותאם גם לזהות phagocytosis של חלבוני coaggregating. זה מתאפשר על ידי צביעה והרכישה תמונות שמורכבות יותר מ -4 בצבעי ניאון 29. במקרה זה, יצירת ערוץ colocalization הראשון (מונוציטים / phagolysosome) תהיה ואחריו יצירהשל ערוץ colocalization השני (סכום מצרפי 1 / שיתוף מצטברים חלבונים 2 חלבון). לאחר מכן, שני הערוצים ישמשו לניתוח 3D דוגמנות.טכניקת q3DISM מוגבלת בעיקר על ידי ספציפי והרגישות של immunostaining, איכות נוגדנים, ואת גישת colocalization. יש הליך רב שלבים זה כמה בעיות פוטנציאליות שיכול להשפיע על איכות המכתימה, ולכן quantitation 3D של ספיגת Aβ. השלב הקריטי הראשון של ההליך הוא הבידוד של מוח מכרסם. ואכן, הטיפול ברקמה זהיר הוא יסוד כדי למנוע נזק למוח ועל מנת להבטיח כי מבנים מוחיים נותרו על כנן כאשר מחולק. שנית, זמן קיבעון רקמות חשוב למדי מאז יתר קיבעון (יותר מ -16 שעות ב 4% PFA) לתחום הגילוי של phagolysosomes subcellular ותוכן Aβ. חשוב לציין כי המכתים הרצוף של 1) מונוציטים, 2) phagolysosomes ו -3) Aβ הוא קריטי להצלחת השיטה. זה essential להשתמש נוגדנים consecutively- לא בו זמנית. בנוסף, רכישת תמונות confocal Z- מחסנית הוא בעל חשיבות עליונה, שכן מודלים 3D של תאים, phagolysosomes ו Aβ peptide וכן colocalization מנתח תלוי באיכות של הדמיה של מבנים הסלולר subcellular דרך עובי של קטע רקמה. לבסוף, התאמה של ספים בתוכנה היא חיונית עבור מודלי 3D ו לניתוח colocalization. ואכן, ספים עבור הערוצים השונים צריכים להיות שנבחרו בקפידה, שכן הם יקבעו מי אות כלולה (ספציפי) או נשלל (ברקע) מהניתוח. זהו גם יסוד כי הספים בחרו להישאר עקביים בין דגימות במקרה של ההשוואה של חיות / דגימות שונות. עד כה, קלאסית immunohistostaining, תהודה מגנטית ו פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה היו שיטות ההדמיה שבה נקטה in vivo הדמיה לכמת Aβ30. למרות שימושי מאוד כדי לכמת את בקנה מידה גדולה של ניטל עמילואיד במוחם של מכרסמים או חולי אלצהיימר, שיטות אלה אינן יעילות עבור להדמיה של Aβ התאי. טכניקות אחרות באמצעות מיקרוסקופ confocal, ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי cytometry זרימה קיימות כבר בשימוש על ידי אותנו ואחרים להפלות ולכמת תוכן Aβ תאי במבחנה 16,31,32. מכתים immunogold יחד עם שחזור 3D שימש בעבר כדי להדגיש את היעדר סיבי עמילואיד בתוך microglia in vivo ב APP23 העכברים הטרנסגניים 27, ולימוד אחר השתמשו בהצלחה שחזור משטח הדמיה 3D confocal של microglia הקשורים עם הפלאק β עמילואיד להראות Aβ מוגבל האינטראקציה ספיגת 33. עם זאת, טכניקות אלה אינן מאפשרות לכמת מיני Aβ תוך phagolysosomal. אחרים לאחרונה פתחו קרינה מבוססת ב assay vivo המאפשרים המדידפעילות phagocytic ידי מקרופאגים היקפיים בחולדה 34. שיטה זו מאפשרת בצורה מתוחכמת כדי לכמת bioprobes ניאון phagolysosomes in vivo, לעומת זאת, נתונים זמינים עד כה מוגבלים בפריפריה.
למיטב ידיעתנו, q3DISM היא השיטה הראשונה שמקנה הדמיית 3D ו לכמת phagocytosis Aβ במוחות של במודלים של מכרסמים לספירה. כלי אימתני זה ללא ספק יסלול את הדרך להבנה עמוקה יותר של phagocytosis Aβ מוחות, ועשוי להיות יעיל גם בהקשרים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23 G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10x | Bioland Scientific | PBS01-02 | Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10x | DAKO | S1699 | Working concentration 1x |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1,000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. |
References
- Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
- Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774 (2010).
- Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
- Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
- Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
- Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
- Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949 (2012).
- Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
- Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
- Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185 (2012).
- Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
- Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
- Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
- Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
- Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
- Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
- Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
- Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
- Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33 (2015).
- Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).
- Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
- Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
- Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
- Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
- Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).
