Summary
Vi utviklet en metodikk for kvantitativ 3D i silico modellering (q3DISM) av cerebral amyloid-β (Ap) fagocytose av mononukleære fagocytter i gnagermodeller av Alzheimers sykdom. Denne fremgangsmåten kan generaliseres for kvantifisering av praktisk talt alle fagocytisk event in vivo.
Abstract
Nevroinflammasjon er nå anerkjent som en viktig årsaksfaktor i nevrodegenerativ sykdom. Mononukleære fagocytter er medfødte immunceller som er ansvarlige for fagocytose og rydding av rusk og detritus. Disse cellene har CNS-resident makrofager kjent som microglia og mononukleære fagocytter infiltrere fra periferien. Lysmikroskopi har generelt blitt brukt til å visualisere fagocytose i gnager eller menneskelige hjerne prøver. Imidlertid har kvalitative metoder ikke gitt definitive bevis for in vivo fagocytose. Her beskriver vi kvantitativ 3D i silico modellering (q3DISM), en robust metode som åpner for ekte 3D kvantifisering av amyloid-β (Ap) fagocytose av mononukleære fagocytter i gnager Alzheimers sykdom (AD) modeller. Fremgangsmåten involverer fluorescens-visualisering av Ap innkapslet i phagolysosomes i gnagerhjerneseksjoner. Store z-dimensjonale confocal datasett blir deretter 3D rekonstruert for kvantifisering av A &# 946; romlig colocalized innenfor phagolysosome. Vi demonstrerer vellykket bruk av q3DISM til mus og rottehjerner, men denne metoden kan utvides til nesten alle phagocytic hendelse i alle vev.
Introduction
Alzheimers sykdom (AD), den mest vanlige aldersrelatert demens 1, karakterisert ved cerebral amyloid-β (Ap) akkumulering som "senile" p-amyloid plakk, kronisk lav-nivå nevroinflammasjon, tauopati, nevronale tap, og kognitiv forstyrrelse 2 . I AD pasient hjerner, er nevroinflammasjon øremerket av reaktive astrocytter og mononukleære fagocytter (referert til som microglia, selv om deres sentrale vs. perifer opprinnelse er fortsatt uklart) rundt Ap-innskudd 3. Som det medfødte immun voktere av CNS, er microglia sentralt plassert for å tømme hjernen Ap. Imidlertid er microglial rekrutteringen til Ap-plakk ledsaget av meget lite, om noen, Ap fagocytose 4,5. En hypotese er at microglia er i utgangspunktet nervecellene ved phagocytozing små forsamlinger av Ap. Imidlertid, etter hvert disse cellene blir nevrotoksisk som overveldende Ap belastning og / eller aldersrelaterte funksjonelle decline, provoserer microglia inn i en dysfunksjonell proinflammatoriske fenotype, bidra til nevrotoksisitet og kognitiv svikt 6.
Siste Genome-wide Association Studies (GWAS) har identifisert en klynge av AD risiko alleler som hører til kjerne medfødte immun veier 7 som modulerer fagocytose 8-11. Derfor har immunresponsen til cerebral amyloid deponering blitt et stort område av interesse, både i forhold til å forstå AD etiologi og for å utvikle nye terapeutiske tilnærminger 12-14. Likevel er det et stort behov for metoder for å vurdere Ap fagocytose in vivo. For å møte dette udekket behov, har vi utviklet kvantitative 3D i silico modellering (q3DISM) for å aktivere ekte 3D kvantifisering av cerebral Ap fagocytose av mononukleære fagocytter i gnagermodeller av Alzheimer-lignende sykdom.
Bare begrenset av i hvilken grad de rekapitulere sykdom, dyremodeller harvist seg uvurderlig for å forstå AD pathoetiology og for å vurdere eksperimentelle behandlingsformer. På grunn av det faktum at mutasjoner i presenilin (PS) og Amyloid Precursor Protein (APP) gener uavhengig forårsake autosomal dominant AD, har disse mutante transgener blitt mye brukt for å generere transgene gnagermodeller. Transgene APP / PS1 mus samtidig coexpressing "svenske" mutant menneskelige APP (APP swe) og Δ ekson 9 mutant human presenilin 1 (PS1ΔE9) til stede med akselerert cerebral amyloidose og nevroinflammasjon 15,16. Videre har vi generert bi-transgene rotter coinjected med APP swe og PS1ΔE9 konstruksjoner (linje TgF344-AD, på en Fischer 344 bakgrunnen). I motsetning til transgene musemodeller av cerebral amyloidose, TgF344-AD rotter utvikle cerebral amyloid som står foran tauopati, apoptotisk tap av nerveceller, og adferdsvansker 17.
I denne rapporten beskriver vi en protokoll for immunostaining microglia, phagolysosomes og Ap-innskudd i hjernen seksjoner fra APP / PS1 mus og TgF344-AD rotter og oppkjøp av store z-dimensjonale confocal bilder. Vi detalj i silico generasjon og analyse av ekte 3D rekonstruksjoner fra confocal datasett tillater kvantifisering av Ap opptak i mikrogliaceller phagolysosomes. I videre forstand, kan den metodikken som vi detalj her brukes for å kvantifisere nesten enhver form for fagocytose in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Erklæringen om forskningsetikk: Alle forsøk med dyr som er beskrevet i dette dokumentet ble godkjent av University of Southern California Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og utført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer og anbefalinger fra Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
1. gnager Brain Isolasjon og forberedelse til Farging
DAG 1:
- Plasser alderen TgF344-AD rotter (14 måneder gammel) eller APP / PS1 mus (12 måneder gammel) under kontinuerlig dyp isoflurananestesi (4%). Vurdere anestesidybden ved tå klype og fravær av tilbaketrekking refleks.
- Skjær gjennom begge sider av brystkassen og løft for å avsløre hjertet. Sett inn en 23 G nål inn i venstre ventrikkel i hjertet og lage et lite snitt i høyre forkammer. Fortsett til blodtapping av transcardial perfusjon med iskald fosfat-bufret saltvann(PBS) under anvendelse av en peristaltisk pumpe (30 ml for mus; 150-200 ml for rotter).
- Lag en halemidtlinjen snitt i huden og flytte hud og muskel side. Skjær gjennom toppen av hodeskallen langs midtlinjen og mellom øynene. Fjern bein plater og isolere hele hjernen fra skallen.
- Plasser hjernen til en koronal gnager hjernen matrise og skjære den i kvartalene. Inkuber bakre fjerde O / N (16 h) i paraformaldehyde fiksativ (4% PFA i PBS) ved 4 ° C. Vask 3x i PBS, og deretter overføre til 70% etanol. Forsiktig: PFA er giftig og bør håndteres under en kjemisk hette med egnet personlig verneutstyr.
DAG 2:
- Plasser hjerne hold til innebygging kassetter og progressivt dehydrere vev i suksessivt mer konsentrerte 1 h etanol bad (70%, 80%, 95% og 100% x3).
- Clear etanol fra vevet med tre påfølgende 100% xylen bad (1 t hver). Forsiktig: Xylen er giftig og shOuld håndteres under en kjemisk hette med egnet personlig verneutstyr.
- Embed vev i parafinblokker etter to smeltet parafinvoks (56 - 58 ° C, 90 min hver).
DAG 3:
- Klipp 10 mikrometer tykke deler av parafininnstøpte hjernen ved hjelp av en mikrotom. Dypp seksjoner i et vannbad (50 ° C i 1 minutt) og anvendelse på objektglass. La lysbilder tørke O / N, noe som sikrer vev vedheft til raset.
2. Farging
Merk: Forskjellige kombinasjoner av antistoffer som kan anvendes for farging prosedyren beskrevet nedenfor. Antistoff cocktails kompatible med hjernevev fra rotter og mus er oppført i Tabell 1.
DAG 4:
- Deparaffinize hjernedelene med 2x 100% xylen bad (12 min hver).
- Rehydrere hjerneseksjoner i suksessive etanol bad - 100% i 10 minutter, 95% etter 5 minutter, 80% i 10 minutter, og til slutt 70% i 15 min - followed x 3 x PBS-vaskinger [5 min ved RT, med lett omrøring]. I mellomtiden, varme antigen henting løsning til 95 - 97 ° C på en varm plate med magnetisk omrøring bar.
- Inkuber hjerneseksjoner i antigen gjenfinning oppløsning ved 95 - 97 ° C i 30 min. Deretter vaskes 3 ganger i PBS (5 min ved RT, med lett omrøring).
- Raskt tørre lysbilder ved hjelp av delikate oppgaven vindusviskere for å unngå vev tørking, og tegne en hydrofob barriere rundt vevet med en hydrofob barriere penn. Fylle den omsluttede vevsområde med blokkeringsbuffer [PBS inneholdende 0,3% Triton X-100 og 10% Normal esel Serum (NDS)], og inkuber ved romtemperatur i 1 time i et fuktet kammer.
- Erstatte blokkeringsbuffer med Iba1 primære antistoff (fortynnet i blokkeringsbuffer) til å merke mononukleære fagocytter, og inkuber O / N ved 4 ° C i et fuktet kammer. For antistoff verter og arbeids fortynninger, se tabell 1 og tabell for materialteknologi.
DAG 5:
- Skylleprimære antistoff med 3 x PBS bad (5 min ved RT med lett omrøring). Inkuber med fluorescerende sekundært antistoff (konjugert med en 594 nm emisjon fluorofor) i 1 time (i blokkeringsbuffer ved RT i mørket) etterfulgt av 3 x PBS-bad (5 min ved RT med lett omrøring). På dette tidspunkt opprettholde delene i mørke for å unngå fluorescerende signal bleking.
DAG 6 - 7:
- Gjenta trinn 2,5 og 2,6 med CD68 (rottehjerner) eller LAMP1 (mus vev) antistoffer og passende sekundære antistoffer (kombinert med en 488 nm emisjon fluorophore) til å merke phagolysosomes.
DAG 7-8:
- Gjenta trinn 2,5 og 2,6 med OC (rotte vev) eller 4G8 (mus hjerner) antistoffer og passende sekundære antistoffer (koblet til en 647 nm fluorofor) til å merke Ap-innskudd.
MERK: Alternativt kan 6E10 antistoff brukes med hell både på mus og rotter vev. For riktige antistoffkombinasjoner, se Table of Materials - Tillat deler til helt tørr O / N ved RT i mørket. Deretter eksemplarer deksel med et dekkglass forseglet av fluorescens monterings medier som inneholder DAPI.
3. Erverv av Large Z-stack Confocal datasett
Merk: Denne protokollen krever en helautomatisk laser scanning confocal mikroskop utstyrt med et 60x objektiv og 405 nm, 488 nm, 594 nm, og 647 nm lasere. Alt utstyr er datastyrt ved bildebehandling og laser kontroll programvare. Før start av bildeprotokollen, strøm på datamaskinen, epifluorescent lampe, mikroskop, lasere og kamera.
DAG 9:
- Velg 60X mikroskop objektiv. Legg immersjonsolje objektivet, og plasser prøven på mikroskopet scenen lysbildeholderen. Hev målet til oljen kommer i kontakt med sklie. Juster fokusplanet for å finne amyloid plakk i hippocampus eller cerebral cortex ved hjelp epifluorescent belysning gjennom okularene.
- Acquire konfokal imalderen aktiverte mononukleære fagocytter rundt amyloidavleiringer i hippocampus eller cortex av gnagere av konfokal mikroskopi (60X forstørrelse, z-stack trinn: 0,25 mikrometer <z <0,40 mikrometer, antall trinn 25 <n <35).
4. q3DISM
Merk: For å gi betydelige resultater, foreslår vi å analysere et minimum på 3 bilder per dyr / region av interesse. For hvert bilde, kan det hende at overflod av celler for å analysere variere avhengig av eksperimentelle paradigmer. I de representative resultatene vist i denne rapporten, analyserte vi 3 celler / tilstand (f.eks, mononukleære fagocytter fjernt fra eller i forbindelse med plaketter, se figur 1C - D og 2C - D).
DAG 10:
- Analyser confocal datasett med vitenskapelig 3D bildebehandling og analyse programvare colocalization (coloc) modul for romlig nærhet av Iba1 / CD68 (rotte vev) eller Iba1 / LAMP1 (mus vev) farging i alle z-plan samtidig.Lag Iba + / CD68 + eller Iba + / LAMP1 + colocalization kanaler som tilsvarer phagolysosomes innen aktiverte mononukleære fagocytter.
- Velge TRITC for kanal A (svarende til Iba1 farging koblet med 594 nm fluorofor) og FITC for kanal B (svarende til CD68 eller LAMP1 farging koblet med 488 nm fluorofor). På høyre side av programvaren vinduet for "-modus sjekk," velg "terskelen", og for 'coloc intensiteter, "velg" kilde kanaler ".
- Klikk på "Rediger" for å velge 'coloc farge "på høyre side av programvaren vinduet.
- For hver kanal uavhengig, justere terskler for å inkludere spesifikk farging og inkluderer bakgrunns / uspesifikke signaler. Når justert, ikke endre terskler mellom bilder for å sikre en objektiv analyse. De colocalized lydelementer (piksler fra alle z-stabler) vises i det valgte i trinn 4.1.2 i alle z-stabler SIM fargeultaneously.
- Klikk "bygge coloc kanal". Den colocalization kanal opprettet vises i displayet justeringsvinduet.
- Klikk på coloc kanal for å åpne kanal statistikker. The '% av volum / material A over terskelen colocalized' representerer% av Iba1 signal (voxel som tilsvarer 594 nm fluorophore) colocalized med LAMP1 eller CD68 signal (voxel som tilsvarer 488 nm fluorophore). Mer enkelt, dette monocyttaktiveringsanalysen volumet som opptas av phagolysosomes (se figurene 1C og 2C).
MERK: «% av volum / material B ovenfor terskelen colocalized 'tilsvarer% av LAMP1 eller CD68 signal colocalized med Iba1. Dette bør være i nærheten av 100%, som phagolysosomes er intracellulære strukturer. Verdiene er basert på forholdet mellom signal fra alle z-stabler over terskelen colocalized.
- Bruke coloc modulen, analysere coloc kanal opprettet i trinn 4.1 for romlig nærhet med OC (rotte tissue) eller 4G8 (mus vev) Ap-signaler. Dette gjør det mulig for kvantifisering av Ap innkapslet i phagolysosomes.
- Velge den kanal A coloc datasett (svarende til Iba1 / CD68 eller Iba1 / LAMP1 coloc kanal opprettet i trinn 4.1) og Cy5 for kanal B (svarende til OC, eller 4G8 farging koblet med 647 nm fluorofor).
- Bygg en coloc kanal som beskrevet i trinn 4.1.2 til 4.1.5.
- Klikk på coloc kanal for å åpne kanal statistikker. The '% av volum / material A over terskelen colocalized' representerer% av Iba1 / LAMP1 eller Iba1 / CD68 (voxel tilsvarer den coloc kanalen bygget i trinn 4.1.5.) Colocalized med OC eller 4G8 signal (voxel svarende til 647 nm fluorophore). Dette er den phagolysosomal volumet som opptas av Ap (se figur 1D og 2D).
MERK: «% av volum / material B ovenfor terskelen colocalized 'tilsvarer% av total Ap signal colocalized med phagolysosomes.Dette kan brukes til å vurdere den fraksjon av de totale Ap-avleiringer innkapslet i phagolysosomes (ikke vist i de foreliggende representative resultater).
- Bruk overgå modulen for å rekonstruere confocal bildestakker og generere 3D-modeller av Ap innkapslet i monocytter phagolysosomes.
- I "skjerm justering 'vinduet velger TRITC (for å vise bare Iba1 farging). I "volum egenskaper-vinduet klikker du" legg til ny overflate ".
- I trinn '1/5 algoritme ", i" innstillinger ", velg" overflaten ". Også i "farge", velg fargetype i paletten eller RGB og justere gjennomsiktighet (rød er satt til 60% gjennomsiktighet i figurene 1B og 2B). Sjekk boksen "velg region av interesse". Klikk på neste.
- I trinn '2/5 region av interesse,' tegner et vindu rundt cellen av interesse ved å justere x, y og z-koordinatene (se hvite bokser i figur 1A 2A). Klikk på neste.
- I trinn '3/5 kilde kanal ", velg TRITC kildekanalen. Kryss av i boksen "glatt", og satt areal detaljnivå til 0,4 mikrometer. For 'thresholding »velger absolutt intensitet. Klikk på neste.
- I trinn '4/5 terskel,' justere terskelen slik at volumet opprettet lapper perfekt med TRITC kanalsignalet. Klikk på neste.
- I trinn '5/5 klassifisere flater, "i avsnittet" filtertype' velge objekter avhengig av størrelsen som skal inkluderes eller ekskluderes fra volumene som skal opprettes. Klikk finish, utføre alle trinnene Skapende, og avslutte veiviseren.
- Gjenta trinn 4.3.1 til 4.3.6 for å lage en 3D-overflate for FITC kanal (LAMP1 + eller CD68 + phagolysosomes).
- Gjenta trinn 4.3.1 til 4.3.6 for å lage en 3D-overflate for Cy5 kanal (OC + eller 4G8 + Ap-innskudd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke flertrinns metodikk for q3DISM beskrevet ovenfor, er vi i stand til å kvantifisere Ap opptak i monocytter phagolysosomes i hjernen til APP / PS1 mus (figur 1) og TgF344-AD rotter (figur 2). Derfor har q3DISM metodikk aktivert analyse av mononukleære fagocytter i mus og rottemodeller av AD. Interessant er det volumet som opptas av CD68 + phagolysosomes signifikant økt i Iba1 + mononukleære fagocytter er forbundet med i forhold til avstandene fra plakk både i APP / PS1 mus (figur 1 B, C) og TgF344-AD-rotter (figur 2B, C). Disse dataene viser at mononukleære fagocytter nærheten plakk er klar for fagocytose sammenlignet med celler som ligger vekk fra plakk. For å illustrere omfanget av data fra flekker forskjellige Ap-konformasjoner, vi brukt ulike antistoffer i mus og rotte vev (beskrevet i Tagjengelig 1 og diskusjon) - vi søker ikke å direkte sammenligne mus og rottemodeller av AD med hensyn til Ap fagocytose. Likevel, det var bemerkelsesverdig at plakk assosiert mononukleære fagocytter hadde økt Ap opptak i APP / PS1 mus sammenlignet med celler fjernt fra plaketter (figur 1D). TgF344-AD rotter hadde svært beskjeden opptak av Ap-fibriller samlet, og ingen endring i Ap fibrillforskningen fagocytose som funksjon av avstand fra plaketter (figur 2D).
Tabell 1: Farging Mononuclear Fagocytter, Phagolysosomes og amyloid-β i hjernevev fra APP / PS1 Mus eller TgF344-AD Rats. Rotte eller mus spesifikke antistoff cocktails er oppført med sine respektive vert i parentes. Fargene indikerer fluoroforen som brukes for sekundært antistoff. Red: Alexa Fluor 594; green: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647.
Figur 1: Visualisering og kvantifisering av amyloid-β Fagocytose i APP / PS1 Muse Brains. (A) Confocal bilder av hjernen seksjoner fra en APP / PS1 mus viser Iba1 + celler (rød), LAMP1 + phagolysosomes (grønn) og 4G8 + amyloidavleiringer (magenta). Inset en fremhever en mononukleær phagocyte fjernt fra plakk, mens innfelt 2 viser en mononukleær phagocyte forbundet med plakett. Scale bar betegner 50 mikrometer. Mindre paneler på høyre er utvidelser av Iba1, LAMP1 og 4G8 signaler i innfellinger 1 og 2. (B) 3D rekonstruksjon av Iba1, LAMP1 og 4G8 signaler for innfellinger 1 og 2. Scale bar betegner tre mikrometer. (C) Kvantifisering av Iba1 + mononukleære phagocyte volum okkupert av LAMP1 + phagolysosomes. (
Figur 2: Visualisering og kvantifisering av amyloid-β Fagocytose i TgF344-AD rottehjerner. (A) Confocal bilder av hjernen seksjoner fra en TgF344-AD rotte viser Iba1 + celler (røde), CD68 + phagolysosomes (grønn), og OC + løselig fibrillar A & # 946; (Magenta). Inset en fremhever en mononukleær phagocyte fjernt fra plakk, mens innfelt 2 viser en mononukleær phagocyte forbundet med plakett. Scale bar betegner 50 mikrometer. Mindre paneler på høyre er utvidelser av Iba1, CD68 og OC signaler i innfellinger 1 og 2. (B) 3D rekonstruksjon av Iba1, CD68 og OC signaler for innfellinger 1 og 2. Scale bar betegner tre mikrometer. (C) Kvantifisering av Iba1 + mononukleære phagocyte volum okkupert av CD68 + phagolysosomes. (D) Kvantitering av intracellulært CD68 + phagolysosomal volumet som opptas av OC + Ap. Verdiene er basert på forholdet mellom signal (voxels) ovenfor terskel som er colocalized. Data er vist som gjennomsnitt ± standardfeil av den midlere (n = 6 celler) for mononukleære fagocytter fjernt fra plakk (1), eller i forbindelse med plakk (2). ** P <0,01 ved Students t-test.rge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som vi beskriver i denne rapporten for ekte 3D kvantifisering av Ap fagocytose in vivo av mononukleære fagocytter er avhengig av spesifikk merking av cellulære og subcellulære avdelinger samt Ap-innskudd. Spesielt bruker vi Iba1 (ionisert kalsium Binding Adaptor molekyl 1), et protein som er involvert i membranen rusket og fagocytose på celleaktivering 18, 19, å farge cerebrale mononukleære fagocytter. Mens Iba1 + celler er generelt ansett som hjernen-resident microglia, er det fortsatt mulig at perifert infiltrere mononukleære fagocytter utgjør en undergruppe av immunolabeled celler. Intracellulære phagolysosomes blir avslørt med antistoffer gjenkjenne medlemmer av lysosomal / endosomal-forbundet membran glykoprotein (LAMP) familie: LAMP1 20 eller CD68 21. Sistnevnte er primært lokalisert til lysosomer og endosomer, med en mindre fraksjon som sirkulerer i cellen surface. LAMP1 og CD68 antistoffer har begge blitt brukt i rotte og mus vev, og beslutningen om å bruke er først og fremst avhengig av mange andre antistoffer som brukes for co-farging (se tabell 1). Det er viktig å være klar over at forskjellige antistoffer kan anvendes for påvisning av Ap. I mus vev, 4G8 (gjenkjenne human og mus aminosyrerester 17-24 i Ap-peptidet 22, figur 1) og 6E10 (gjenkjenner humane aminosyrerester 1 - 17 23, data ikke vist) har vært brukt med hell, slik at påvisning og kvantifisering av Ap innhold i LAMP1 + eller CD68 + phagolysosomes stede i Iba1 + mononukleære fagocytter. Ved hjelp av vår q3DISM metodikk, observerte vi økt Ap belastning i Iba1 + celler forbundet med global reduksjon av Ap belastning i hjernen til APPPS1 / IL-10 - / - mus 16, mens andre viste redusert Ap opptak i Iba1 + < / sup> celler ledsaget av økt Ap belastning og plakk volum i hjernen til Rag-5xfAD mus 24. Disse resultater antyder at den observerte fenomenet er et "øyeblikksbilde" av aktiv Ap fagocytose, selv om fremgangsmåten ikke kan anvendes for å forutsi om den phagocytosed materialet er effektivt fordøyet og fjernet.
I rotte vev, vi har oppdaget Ap-innskudd med OC (gjenkjenne løselige Ap-42 oligomerer / fibriller 25,26, figur 2) eller 6E10 17 (ikke vist). Interessant, svært lite OC + fibriller var tilstede i monocytter phagolysosomes i TgF344-AD rottehjerner. Dette fenomen er tidligere blitt rapportert i APP23 transgene mus ved hjelp av en immunfarging og 3D rekonstruksjon 27. Merk: En rekke av antistoffer for påvisning av ulike Ap-arter / konformasjoner er tilgjengelig og kan potensielt bli testet og ansatt ved brukerens skjønn.
nt "> Vår q3DISM teknikken har blitt adoptert av oss og andre til å kvantifisere Ap fagocytose i sammenheng med AD 16,24,28. Imidlertid kan metoden tilpasses evaluere nesten enhver form for fagocytose. Det kan også brukes på vev annet enn hjernen, og til andre dyrearter (inkludert mennesker). prosedyrene er beskrevet i denne protokollen er avhengige av standard farging, oppdaget med fluorescens og avbildes med en konfokalmikroskop. i denne rapporten har vi brukt parafin-embedded tissue i henhold til retningslinjer levert av antistoff-produsenter. om ønsket kan den foreliggende protokoll kan også optimeres for friskt vev (innleiret i 2% agarose i PBS). kan protokollen også optimaliseres for å detektere fagocytose av coaggregating proteiner. Dette er gjort mulig ved farging og anskaffe -bilder sammensatt av mer enn 4 29 fluoriserende farger. i dette tilfelle, vil opprettelsen av den første colocalization kanalen (monocytt / phagolysosome) bli etterfulgt av etableringenav en andre colocalization kanal (aggregert protein 1 / co-aggregerte protein 2). Deretter vil de to kanalene brukes for 3D-analyse og modellering.Den q3DISM teknikk er begrenset hovedsakelig av spesifisiteten og sensitiviteten av immunofarging, kvalitet av antistoffer, og colocalization tilnærming. Denne flertrinns-prosess har noen potensielle farene som kan påvirke kvaliteten av fargingen, og derfor 3D kvantifisering av Ap-opptak. Den første kritiske trinn i fremgangsmåten er isoleringen av gnager hjerner. Faktisk er forsiktig vev håndtering fundamental for å unngå skader på hjernen og for å garantere at strukturer i hjernen forblir intakt når seksjonert. For det andre er vev fiksering tid ganske viktig siden over-fiksering (mer enn 16 timer i 4% PFA) begrenser deteksjon av subcellulære phagolysosomes og Ap innhold. Viktigere, 3) Ap er den påfølgende farging av 1) monocytter, 2) phagolysosomes og kritisk for suksessen til fremgangsmåten. Det er Essential å bruke antistoffer consecutively- ikke samtidig. I tillegg oppkjøp av z-stack confocal bilder er av største betydning, siden 3D modellering av celler, phagolysosomes og Ap peptid samt colocalization analyser avhenger av kvaliteten på avbildning av cellulære og subcellulære strukturer gjennom tykkelsen av vevet delen. Til slutt, er justering av terskler i programvaren avgjørende for 3D-modellering og for colocalization analyse. Faktisk, terskler for de ulike kanalene må nøye valgt, siden de vil avgjøre hvilket signal er inkludert (spesifikk) eller ekskludert (bakgrunn) fra analysen. Det er også grunnleggende at tersklene velges forblir konsistente mellom prøver i tilfellet av sammenligningen av forskjellige dyr / prøver. Så langt har klassisk immunohistostaining, magnetic resonance imaging og positronemisjonstomografi vært imaging metoder av valget for in vivo visualisering og kvantifisering av Ap30. Selv om svært nyttig for storskala kvantifisering av amyloid byrde i hjernen hos gnagere eller AD pasienter, disse metodene er ineffektive for visualisering av intracellulær Ap. Andre teknikker som bruker konfokalmikroskopi, fluorescens spektroskopi og flowcytometri eksisterer og har blitt brukt av oss og andre til å diskriminere og kvantifisere intracellulære Ap innhold in vitro 16,31,32. En immunfarging kombinert med 3D rekonstruksjon ble tidligere brukt til å markere fraværet av amyloidfibriler innen microglia in vivo i APP23 transgene mus 27, og en annen studie med hell brukt confocal bildebehandling og 3D overflate rekonstruksjon av microglia-assosiert med p-amyloid plakk vise begrenset Ap samhandling og opptak 33. Men disse teknikkene ikke tillate for kvantifisering av intra-phagolysosomal Ap-arter. Andre har nylig utviklet en fluorescens-basert in vivo-assay som tillater målingenav fagocytisk aktivitet ved perifere makrofager hos rotter 34. Denne metoden gir genialt for kvantifisering av fluorescerende bioprobes i phagolysosomes in vivo, men data tilgjengelig så langt er begrenset til periferien.
Så vidt vi vet, er q3DISM den første metoden som gir 3D-visualisering og kvantifisering av Ap fagocytose i hjernen til gnagere AD-modeller. Denne formidable verktøyet vil utvilsomt bane vei til en dypere forståelse av cerebral Ap fagocytose, og kan også være nyttig i andre sammenhenger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23 G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10x | Bioland Scientific | PBS01-02 | Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10x | DAKO | S1699 | Working concentration 1x |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1,000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. |
References
- Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
- Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774 (2010).
- Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
- Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
- Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
- Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
- Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949 (2012).
- Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
- Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
- Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185 (2012).
- Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
- Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
- Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
- Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
- Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
- Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
- Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
- Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
- Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33 (2015).
- Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).
- Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
- Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
- Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
- Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
- Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).
