Summary
Alzheimer hastalığı, kemirgen modellerinde mononükleer fagositler tarafından serebral amiloid-β (Aβ) fagositoz silikon modelleme (q3DISM) nicel 3D için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem, in vivo olarak hemen her fagositik olayın kantitatif için genelleştirilebilir.
Abstract
Nöroenflamasyon şimdi nörodejeneratif hastalık önemli bir etyolojik faktör olarak kabul edilmektedir. Mononükleer fagositler fagositoz ve enkaz ve döküntü temizlenmesi için sorumlu doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir. Bu hücreler, çevreden süzücü mikroglia olarak bilinen merkezi sinir sistemi yerleşik makrofajlar ve mononükleer fagositler bulunmaktadır. Işık mikroskobu genellikle kemirgen ya da insan beyni örneklerinde fagositoz görselleştirmek için kullanılır olmuştur. Ancak, kalitatif yöntemler in vivo fagositoz kesin delil değil. Burada, silikon modelleme (q3DISM), kemirgen Alzheimer hastalığı (AD), bir model mononükleer fagositler tarafından amiloid-β (Aβ) fagositoz gerçek 3D niceliğinin belirlenmesine olanak sağlam bir yöntem kantitatif 3D açıklar. yöntem, floresan Aβ kemirgen beyin bölümlerinde fagolizozomları içinde kapsüllenmiş visualising içerir. Büyük z-boyutlu konfokal veri setleri daha sonra 3D A & miktarının belirlenmesi için yeniden inşa edilir# 946; mekansal phagolysosome içinde kolokalize. Bu fare ve sıçan beynine q3DISM başarılı bir uygulama göstermektedir, ancak bu yöntem herhangi bir dokuda hemen hemen herhangi bir fagositik etkinlik için uzatılabilir.
Introduction
Alzheimer hastalığı (AD), en sık yaşa bağlı dementia, 1 "senil" β-amiloid plaklarının kronik düşük seviyeli nöroenflamasyonun, tauopathy, nöronal kayıp, ve bilişsel bozukluk 2 gibi serebral amiloid-β (Aβ) birikimi ile karakterize edilir . AD hasta beyinlerinde, Nöroenflamasyon astrositler ve mononükleer fagositler reaktif tarafından tahsis edilir çevreleyen Aβ mevduat 3 (onların periferik kökenli belirsizdir vs merkezi olmasına rağmen, mikroglia olarak anılacaktır). MSS doğuştan gelen bağışıklık gözcüler olarak, mikroglia merkezi beyin Aβ temizlemek için konumlandırılmış. Bununla birlikte, Aβ plaklara mikrogliyal alımları, eğer varsa, çok az Aβ fagositoz 4,5 eşlik eder. Bir hipotez mikroglia Aβ küçük meclisleri phagocytozing başlangıçta nöro-koruyucu olmasıdır. Ancak, sonunda bu hücrelerin ezici Aβ yükü ve / veya yaşa bağlı fonksiyonel d gibi nörotoksik haleecline, nörotoksisite ve bilişsel gerileme 6 katkıda işlevsiz bir proinflamatuar fenotip içine mikroglia kışkırtır.
Son genom Derneği Çalışmaları (GWAS) fagositoz 8-11 modüle çekirdek doğuştan gelen bağışıklık yolların 7 ait AD risk allelleri bir küme belirledik. Sonuç olarak, serebral amiloid birikimi bağışıklık tepkisi AD etiyolojisinin daha iyi anlaşılması açısından ve yeni tedavi yaklaşımları 12-14 geliştirmek için hem ilgi önemli bir alan haline gelmiştir. Bununla birlikte, in vivo koşullarında Aβ fagositoz değerlendirmek için yöntem için önemli bir ihtiyaç vardır. Bu karşılanmamış gereksinimi karşılamak için, Alzheimer-benzeri hastalığının kemirgen modellerinde mononükleer fagositler tarafından serebral Aβ fagositoz gerçek 3D kantitatif sağlamak için silikon modelleme (q3DISM) 'de niceliksel 3D geliştirdik.
Onlar, hayvan modelleri hastalığı recapitulate ölçüde sadece sınırlıAD pathoetiology anlaşılması için ve deneysel terapötik maddelerin değerlendirilmesi için çok değerli kanıtlanmıştır. Presenilin (PS) ve Amiloid Prekürsör Protein (APP) genlerindeki mutasyonlar, bağımsız bir otozomal baskın AH nedeni olduğu gerçeği nedeniyle, bu mutan transgenler yoğun transjenik rodent modelleri oluşturmak için kullanılmıştır. Transgenik APP / PS1 fareler aynı anda "İsveç" mutant insan APP (APPswe) ve hızlandırılmış serebral amiloidoz ve nöro 15,16 ile mevcut Δ ekson 9 mutant insan presenilin 1 (PS1ΔE9) coexpressing. Ayrıca, biz (bir Fischer 344 arka plan üzerinde çizgi TgF344-AD) APP swe ve PS1ΔE9 yapıları ile birlikte enjekte bi-transgenik fareler yarattı. Serebral amiloidoz transgenik fare modellerinde farklı olarak, TgF344-AD sıçan tauopathy, nöronların apoptotik kaybı ve davranış bozukluğu 17 önce gelen serebral amiloid geliştirme.
Bu yazıda imm için bir protokol açıklarAPP / PS1 fareler ve TgF344-AD sıçan ve büyük z boyutlu eş odaklı görüntü edinme beyin bölümlerinde mikroglia fagolizozomları ve Aβ mevduat unostaining. Siliko üretimi ve mikroglial fagolizozomları içine Aβ alımının kantitatif izin konfokal veri setlerinden gerçek 3D rekonstrüksiyon analizinde Biz ayrıntı. Daha genel olarak, burada ayrıntılı metodoloji in vivo fagositoz hemen hemen herhangi bir şekilde ölçmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırma etiği Beyanı: Burada detaylı hayvanları da içeren tüm deneylerde Southern California Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuar Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği Ulusal Sağlık kılavuzların Enstitüleri ve önerileri ile tam uyum içinde yapıldı hayvan Bakımı Uluslararası.
1. Kemirgen Beyin İzolasyon ve immün için hazırlık
1.GÜN:
- yaşlı TgF344-AD sıçan yerleştirin (14 aylık) veya sürekli derin izofluran anestezisi (% 4) altında APP / PS1 fareler (12 aylık). ayak tutam anestezi derinliği ve çekme refleksinin yokluğu değerlendirin.
- Göğüs kafesinin her iki tarafında kesti ve kalp maruz kaldırın. kalbin sol ventrikül içine bir 23 G iğne takın ve sağ atrium içine küçük bir kesi yapmak. buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su ile transcardial perfüzyon ile kan kaybından geçinperistaltik bir pompa (fareler için 30 mL, 150 - sıçanlar için 200 mL) ile (PBS).
- deri içine bir kuyruk orta hat kesi yapmak ve bir kenara deri ve kas hareket ettirin. orta hat boyunca kafatasının üst kısmından ve gözler arasında kesin. Kemik plakaları kaldırmak ve kafatası tüm beyin izole eder.
- koronal kemirgen beyin matriks içine beyin yerleştirin ve dörde dilim. 4 ° C'de paraformaldehid sabitleme maddesi (PBS içinde% 4 PFA) ile arka çeyrek O / N (16 saat) inkübe edin. PBS yıkama 3x ve sonra% 70 etanol aktarın. Dikkat: PFA toksik ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile kimyasal bir başlık altında ele alınmalıdır.
2. GÜN:
- arka arkaya daha konsantre 1H etanol banyolarında (% 70,% 80,% 95 ve% 100 x3) doku dihidrat kademeli gömme kasetlerine beyin çeyrek koyun.
- arka arkaya üç% 100 ksilen banyoları (1 saat her biri) ile dokudan net etanol. Dikkat: Ksilen toksik ve shUygun kişisel koruyucu teçhizat ile kimyasal başlık altında ele ould.
- (- 58 ° C, 90 dakika her 56) iki erimiş parafin banyoları sonra parafin bloklar doku gömün.
GÜN 3:
- Bir mikrotom kullanılarak parafine gömülü beyinlerin 10 mikron kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. bir su banyosuna (1 dakika için 50 ° C) içine daldırma Bölümler mikroskop lamları için de geçerlidir. slayt doku yapışmasını sağlayarak, O / N kurumaya slaytlar bırakın.
2. immün
Not: Antikorların farklı kombinasyonları aşağıda tarif edilen boyama işlemi için de kullanılabilir. Sıçan ve farelerin beyin dokusu ile uyumlu antikor kokteyli, Tablo 1 'de listelenmiştir.
4. GÜN:
- 2x% 100 ksilen banyoları kullanılarak Deparaffinize beyin bölümleri (12 dk).
- arka arkaya etanol banyoları beyin bölümleri rehidrate -% 100 10 dakikada, 5 dakika boyunca% 95, 10 dakika% 80, 15 dakika boyunca son% 70 - Followe3x PBS yıkar [hafif ajitasyon ile oda sıcaklığında 5 dakika,] tarafından, d. Bu arada, 95 Isı antijen alımı çözeltisi - manyetik çubuk karıştırılarak sıcak bir plaka üzerinde 97 ° C.
- 30 dakika boyunca 97 ° C - 95 antijen alma çözeltisi beyin bölümleri inkübe edin. Daha sonra, PBS içinde 3 kez yıkanır (hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 5 dakika).
- Doku kurumasını önlemek ve hidrofobik bir bariyer kalem ile doku alanı çevresinde bir hidrofobik bariyer çizmek için hassas görev silecekleri kullanarak hızlı kuru slaytlar. Ve nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe [PBS% 0.3 Triton X-100 ve% 10 normal eşek serumu (NDS) ihtiva eden] Blokaj tamponu ile çevrelenmiş doku bölgesini doldurun.
- nemli bir odada 4 ° C'de O / N mononükleer fagositler etiket ve kuluçkalanması (bloke tamponu içinde seyreltilmiş) Iba1 primer antikor ile blokaj tamponu değiştirin. Antikor host ve çalışma dilüsyonları için, Tablo 1 ve Malzemelerin Tabloya bakınız.
GÜN 5:
- Durulama3x PBS banyoları ile primer antikor (hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 5 dakika). 3x PBS banyoları ve ardından (karanlıkta, oda sıcaklığında bloklama tamponu içinde) 1 saat boyunca (594 nm emisyon fluorofor ile konjüge edilmiş) fluorescent sekonder antikor (hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 5 dakika) ile inkübe edin. Şu anda, flüoresan sinyal ağartma önlemek için karanlıkta bölümleri muhafaza.
GÜN 6 - 7:
- Tekrarlayın 2.5 ve CD68 ile 2.6 (sıçan beyin) ya da fagolizozomları etiketlemek için LAMP1 (fare doku) antikorları ve uygun ikincil antikorlar (488 nm emisyon fluorofor ile birleştiğinde) yineleyin.
GÜN 7 - 8:
- Yineleyin Aβ mevduat etiketlemek için (bir 647 nm flüorofora bağlı) OC (sıçan doku) ya da 4G8 (fare beyinleri) antikorlar ve uygun sekonder antikor ile 2.5 ve 2.6 adımları.
Not: Alternatif olarak, 6E10 antikoru, fare ve sıçan dokusu üzerinde başarılı bir şekilde de kullanılabilir. Uygun antikor kombinasyonlar için, Malzeme Tabloya bakınız - İzin bölümleri tamamen kuru Ç / karanlıkta oda sıcaklığında N. Ardından, kapak DAPI içeren floresan montaj medya tarafından mühürlenmiş bir kapak kayma ile numune.
Büyük Z-yığını Confocal Veri kümeleri 3. kazanılması
Not: Bu protokol, 60X objektif ve 405 nm, 488 nm, 594 nm ve 647 nm lazer ile donatılmış bir tam otomatik lazer tarama konfokal mikroskop gerektirir. Tüm ekipman görüntüleme ve lazer kontrol yazılımı tarafından kontrol bilgisayardır. Bilgisayar, epifluorescent lamba, mikroskop, lazerler ve kamera üzerinde görüntüleme protokolü, güç başlamadan önce.
GÜN 9:
- 60X mikroskop hedefi seçin. lens daldırma yağı ekleyin ve mikroskop sahne slayt tutucu üzerine numuneyi yerleştirin. Yağ slayt ile temas edinceye kadar objektif kaldırın. Okülerin aracılığıyla epifluorescent aydınlatma kullanarak hipokampus veya serebral korteks amiloid plaklar bulmak için odak düzlemi ayarlayın.
- konfokal im Edinmehipokamp veya konfokal mikroskopi ile kemirgen korteks amiloid birikimlerinin Çevre aktive mononükleer fagositler yaşları (60X büyütme, z-yığın adımları: 0.25 um <z <0.40 um, adım sayısı 25 <n <35).
4. q3DISM
Not: önemli sonuçlar elde etmek amacıyla, ilgi hayvan / bölge başına 3 görüntü en az analiz öneririz. Her bir görüntü için, analiz etmek için hücre bolluğu deneysel paradigmalar bağlı olarak değişebilir. (; - D ve 2C - D Şekil 1C bakın örneğin, uzak veya plaklar ile ilişkili mononükleer fagositler), bu raporda gösterilen temsilcisi sonuçları, biz 3 hücre / durumunu analiz etti.
GÜN 10:
- Bilimsel 3D görüntü işleme ve analiz yazılımı ko (coloc) aynı anda tüm z-düzlemlerde Iba1 / CD68 (sıçan doku) ya da Iba1 / LAMP1 (fare doku) boyanma mekansal yakınlığı modülü ile konfokal veri setlerini analiz edin.Iba + / CD68 + veya aktive mononükleer fagositler içinde fagolizozomları karşılık Iba + / LAMP1 + ko kanalları oluşturun.
- (CD68 karşı gelen ya da 488 nm fluorofor ile birlikte LAMP1 boyama) b kanalı için (594 nm fluorofor ile birlikte Iba1 boyama karşılık gelir) kanalı için TRITC ve FITC seçin. 'Modunda çek,' seçeneğini 'eşik' ve 'coloc şiddetleri,' seçeneğini 'kaynak kanalları' için yazılım penceresinin sağ tarafta.
- yazılım penceresinin sağ taraftaki 'coloc renk' öğesini seçmek için 'Düzenle'yi tıklayın.
- bağımsız olarak her kanal için, belirli boyama dahil ve arka plan / non-spesifik sinyaller dışlamak için eşik ayarlayın. ayarlanabilir sonra, tarafsız bir analizini sağlamak için görüntüler arasında eşikleri değişmez. kolokalize vokseller (tüm z-yığınlardan alınan piksel) tüm z-yığınları sim adım 4.1.2 seçilen renkte görünecekultaneously.
- 'Coloc kanalı inşa tıklayın. oluşturulan ko kanal görüntüleme ayar penceresinde görüntülenir.
- Kanal istatistiklerini açmak için coloc kanalında tıklayın. 'Kolokalize eşiğin üzerinde hacim / A maddesinin%' LAMP1 veya CD68 sinyali (488 nm florofor tekabül vokseller) ile kolokalize Iba1 sinyali (594 nm florofor tekabül vokseller) ve% temsil eder. Daha basit, bu fagolizozomları (Şekil 1C ve 2C bakınız) tarafından işgal monosit birimdir.
NOT: 'kolokalize eşiğin üstünde hacim / malzeme B'nin%' Iba1 ile kolokalize LAMP1 veya CD68 sinyalinin% tekabül etmektedir. fagolizozomları hücre yapılar gibi bu% 100'e yakın olmalıdır. Değerler kolokalize eşiğin üzerinde tüm Z-yığınlarının sinyalin oranına dayanmaktadır.
- coloc modülü kullanılarak, OC (sıçan ti ile mekansal yakınlık için adım 4.1 oluşturulan coloc kanalı analizssue) ya da 4G8 (fare doku) Aβ sinyaller. Bu fagolizozomları içinde kapalı Aβ nicelendirilmesi sağlar.
- kanal (OK veya 647 nm fluorofor ile birlikte 4G8 boyama tekabül eder) b kanalı için ve Cy5 (Iba1 / CD68 veya Iba1 / LAMP1 coloc kanal adım 4.1 oluşturulan karşılık gelen) bir coloc veri kümesi seçin.
- 4.1.5 oluşturma adımları 4.1.2 de tarif edildiği gibi, bir coloc kanal oluşturun.
- Kanal istatistiklerini açmak için coloc kanalında tıklayın. 'Kolokalize eşiğin üzerinde hacim / A maddesinin%' Iba1 / LAMP1 veya Iba1 / CD68 (vokseller adım 4.1.5 yerleşik coloc kanala tekabül etmektedir.) OK veya 4G8 sinyali (vokseller 647 karşılık gelen kolokalize ve% temsil nm fluorofor). Bu Aβ (Şekil 1D ve 2D bakınız) tarafından işgal fagolizozomal birimdir.
NOT: 'kolokalize eşiğin üstünde hacim / malzeme B'nin%' fagolizozomları ile kolokalize toplam Aβ sinyalin% tekabül eder.Bu fagolizozomları (Bu Örnek sonuçlar gösterilmemiştir) içinde kapalı tutulan toplam Aβ yataklarının kısmını değerlendirmek için de kullanılabilir.
- konfokal görüntü yığınlarını yeniden ve monosit fagolizozomları içinde kapsüllü Aβ 3D modellerini oluşturmak için aşmak modülünü kullanın.
- 'Ekran ayarı' penceresinde, (sadece Iba1 boyama göstermek için) TRITC seçin. 'Hacim gayrimenkullerin penceresinde,' yeni yüzey eklemek tıklayın.
- içinde '1/5 algoritma' adımında 'ayarları' yüzey 'seçeneğini seçin. Ayrıca 'renk' (kırmızı Şekil 1B ve 2B% 60 şeffaflık ayarlanır) paletinde veya RGB renk türünü seçin ve saydamlığını ayarlamak. kutusunu işaretleyin 'ilgi bölgeyi seçin'. Bir sonraki tıklayın.
- Adım 'ilgi 2/5 bölge,' x, y ayarlayarak ilgi hücre etrafında bir pencere çizin ve z koordinatları (Şekil 1A beyaz kutuları bakın 2A). Bir sonraki tıklayın.
- Adım '3/5 kaynak kanalı' olarak, TRITC kaynak kanalı seçin. 0.4 mikron kutu 'yumuşak' ve set yüzey alanı ayrıntı seviyesini kontrol edin. Için 'eşikleme,' mutlak yoğunluğunu seçin. Bir sonraki tıklayın.
- oluşturulan birim TRITC kanal sinyali ile mükemmel örtüşür şekilde Adım içinde '4/5 eşik,' eşik ayarlayın. Bir sonraki tıklayın.
- Adım '5/5 yüzeyleri sınıflandırmak,' bölümünde 'filtre türü,' dahil veya oluşturulacak miktarlar hariç tutulacak onların büyüklüğüne göre nesneleri seçin. , Bitirmek tıklayın bütün oluşturma adımlarını yürütmek ve sihirbazdan çıkın.
- Yineleyin FITC kanalı (LAMP1 + veya CD68 + fagolizozomları) için 3D yüzey oluşturmak için 4.3.1 4.3.6 için yineleyin.
- Yineleyin Cy5 kanalı için (OC + veya 4G8 + Aβ mevduat) 3D yüzey oluşturmak için 4.3.1 4.3.6 için yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Q3DISM yukarıda ayrıntıları için çok-aşamalı bir yöntem kullanarak, APP / PS1 farelerde (Şekil 1) ve TgF344 AD farelerde (Şekil 2) beyinlerinde monosit fagolizozomları halinde Aβ alımını ölçmek mümkündür. Bu nedenle, q3DISM yöntemi AD fare ve sıçan modellerinde mononükleer fagositler analizi sağladı. İlginç bir şekilde, CD68 + fagolizozomları tarafından işgal edilen hacim miktarı hem APP / PS1 fareleri (Şekil 1B, C) ve TgF344 AD farelerde (Şekil 2B, C) plaklar uzak karşılaştırıldığında ilişkili Iba1 + mononükleer fagositler artar. Bu veriler plaklar yakın mononükleer fagositler uzak plak mesafede bulunan hücrelere göre fagositoz için hazır olduğunu göstermektedir. Farklı Aβ konformerleri boyama veri aralığını göstermek amacıyla, fare ve sıçan dokusunda çeşitli antikorlar kullanılmıştır (Ta ayrıntılı1 ve tartışma) ble - doğrudan Aβ fagositoz konusunda AD fare ve sıçan modellerini karşılaştırmak isteyen değildir. Bununla birlikte, plak ilişkili mononükleer fagositler plaklar (Şekil 1D) uzak hücrelere kıyasla APP / PS1 farelerde Aβ alımını arttığı dikkat çekmektedir. TgF344 AD sıçanlar çok mütevazı genel Aβ fibrillerinin alımını ve plakların mesafenin bir fonksiyonu olarak Aβ fibril fagositoz bir değişiklik (Şekil 2D) vardı.
Tablo 1: immün mononükleer Fagositler, fagolizozomları ve APP / PS1 Fare veya TgF344-AD Rats Beyin Doku Amiloid-β. Sıçan veya fare spesifik antikor kokteyller parantez içinde kendi ev sahibi ile listelenir. Renkler ikincil antikor kullanılmıştır fluorofor göstermektedir. Kırmızı: Alexa Fluor 594; Yeşil: Alexa Fluor 488;eflatun: Alexa Fluor 647.
Şekil 1: Görüntüleme ve APP / PS1 Fare Brain cinsinden Amiloid-β Fagositoz miktar tayini. (A) Beyin Iba1 + hücreleri (kırmızı) gösteren bir APP / PS1 fare bölümleri, LAMP1 + fagolizozomları (yeşil) ve 4G8 + amiloid mevduat (Eflatun) Konfokal görüntüler. içerlek 2 plak ile ilişkili bir mononükleer fagosit gösterirken Ankastre 1, plak uzak bir mononükleer fagosit vurgulamaktadır. Ölçek çubuğu 50 uM ifade eder. Sağdaki küçük paneller ilavelerde 1 ve 2 Ölçek bar Iba1, LAMP1 ve genişlemeler ve ilavelerde 1 ve Iba1, LAMP1 2. (B) 3D rekonstrüksiyon içinde 4G8 sinyalleri ve 4G8 sinyallerdir 3 mikron ifade eder. LAMP1 + fagolizozomları tarafından işgal Iba1 + mononükleer fagosit hacminin (C) kantitasyonu. (
TgF344-AD Sıçan Brain cinsinden Görselleştirme ve Amiloid-β Fagositoz miktar tayini: Şekil 2. (A) Konfokal Iba1 + hücreler gösteren bir TgF344-AD sıçan beyin bölümlerinin görüntüleri (kırmızı), CD68 + fagolizozomları (yeşil) ve OC + çözünür fibriler A & # 946; (Eflatun). içerlek 2 plak ile ilişkili bir mononükleer fagosit gösterirken Ankastre 1, plak uzak bir mononükleer fagosit vurgulamaktadır. Ölçek çubuğu 50 uM ifade eder. Sağdaki küçük paneller ilavelerde 1 ve 2 Ölçek çubuğu ilavelerde 1 ve Iba1, CD68 2. (B) 3D rekonstrüksiyon ve OC sinyalleri içinde Iba1, CD68 ve genişlemeler ve OC sinyalleri 3 mikron ifade eder. CD68 + fagolizozomları tarafından işgal Iba1 + mononükleer fagosit hacminin (C) kantitasyonu. OC + Aβ tarafından işgal hücre içi CD68 + fagolizozomal hacminin (D) kantitasyonu. Değerler lokalize olan eşik değerinin üzerinde sinyalin oranı (vokseller) dayanmaktadır. Veriler ortalama ± plaklar uzak mononükleer fagositler için ortalama (n = 6 hücre) standart hatası gösterilmiştir (1) ya da lekeleri ile ilişkili (2). ** Öğrencinin t-testi ile p <0.01.rge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz mononükleer fagositler tarafından in vivo Aβ fagositoz gerçek 3D kantitatif için bu raporda tarif protokol spesifik hücresel ve hücre içi bölmelerin etiketleme yanı sıra Aβ mevduat dayanmaktadır. Özellikle, Iba1 (İyonize kalsiyum Adaptör molekülü 1. Bağlayıcı), hücre aktivasyonunun 18, 19 üzerine doğrudan membran kırışması oluşur ve fagositoz dahil olan bir proteinin, serebral mononükleer fagositler leke için kullanın. Iba1 + hücreleri, genellikle beyin ikamet mikroglia olarak olsa da, bu çevresel infiltrasyonlu mononükleer fagositler imüno-işaretli hücrelerin bir alt kümesi içermesi mümkün olur. LAMP1 20 veya CD68 21: Hücre içi fagolizozomları antikorlar Lizozomal / endosome ilişkili membran glikoprotein (LAMP) ailesinin üyelerini tanımak ile ortaya çıkar. İkincisi, öncelikle küçük bir kısmı hücre s dolaşan, lizozomlar ve endozomlardan lokalizeSenin yüzün. LAMP1 ve CD68 antikorları hem de başarılı bir şekilde sıçan ve farede kullanılmıştır, ve kullanımı ile ilgili bir karar ko-lekeleme (bakınız Tablo 1) için kullanılan diğer antikorların ana öncelikle bağlıdır. Çeşitli antikorlar, Aβ saptanması için kullanılabilir farkında olması önemlidir. Fare dokusunda, 4G8 (17 İnsan ve fare amino asit kalıntıları tanıyan - 24 Aβ peptidi 22 Şekil 1) - saptanması ve nicelenmesi sağlayan başarılı bir şekilde kullanılmıştır ve 6E10 (17 23, gösterilmemiş olan veriler, insan amino asit kalıntıları 1 tanıyan) LAMP1 + veya CD68 + Iba1 + mononükleer fagositler mevcut fagolizozomları içinde Aβ içeriği. Diğer göstermesine karşın, farelerin 16 <Iba1 + içine Aβ alımını azalma - / - bizim q3DISM yöntem kullanarak, APPPS1 / IL-10 beyinlerinde Aβ yükün genel bir azalma ile ilişkili Iba1 + hücrelerinde artmış Aβ yük görülmektedir / sup> Rag-5xfAD farelerin 24 beyinlerinde artmış Aβ yük ve plak hacmi eşliğinde hücreler. Bu sonuçlar fagosite malzeme verimli sindirilir ve temizlendi mi bizim metodoloji tahmin etmek kullanılamaz rağmen gözlemlenen olgu, aktif Aβ fagositoz bir "anlık" olduğunu göstermektedir.
Sıçan doku olarak, ° C ile Aβ yatakları tespit ya da (gösterilmemiş olan) 6E10 17 (çözünebilir Aβ 42 oligomerler / fibriller 25,26, Şekil 2, kabul). İlginç bir şekilde, çok az OC + fibriller TgF344-AD sıçan beyinlerinde monosit fagolizozomları mevcuttu. Bu olgu daha önce immünolojik boyama ve 3D rekonstrüksiyonu 27 kullanılarak APP23 transjenik farelerde bildirilmiştir. Not: Farklı Aβ tür / konformerlere saptanması için çeşitli antikorlar mevcut ve potansiyel olarak test edilmiş ve kullanıcının takdirine bağlı olarak kullanılabilir.
Bizim q3DISM tekniği bize ve diğerleri tarafından kabul edilmiştir> NT "AD 16,24,28 bağlamında Aβ fagositoz ölçmek için. Bununla birlikte, yöntem, fagositoz hemen hemen hiçbir şekilde değerlendirmek için adapte edilebilir. Aynı zamanda, dokulara tatbik edilebilir beynin daha ve (insanlar dahil) diğer hayvan türlerinin diğer. Bu protokol açıklanan prosedürler floresan ile tespit ve konfokal mikroskop ile görüntülenmiş, standart immün güveniyor. Bu yazıda, kurallarına göre parafine gömülü doku kullanmış Eğer arzu edilirse, antikor üreticileri tarafından sağlanan., bu protokol, (PBS içinde% 2 agaroz gömülü) taze doku için optimize edilebilir. protokol, proteinler coaggregating fagositozunu tespit etmek için optimize edilebilir. Bu boyama ve elde ile mümkün olmaktadır görüntüleri 4'ten fazla floresan renkler 29 oluşmaktadır. Bu durumda, ilk ko kanalı (monosit / phagolysosome) oluşturulması yaratılması takip ediyorumİkinci ko kanalının (protein 1 / ko-toplanmış protein 2 toplanmış). Sonra, iki kanal 3D analiz ve modelleme için kullanılacaktır.q3DISM tekniği özgüllük ve immün, antikorlar kalitesi hassasiyetle ve ko yaklaşım esas olarak sınırlıdır. Bu aşamalı bir süreçtir, bu nedenle boyama kalitesi ve, Aβ alımı 3D kantitatif etkileyebilir birkaç potansiyel tuzaklar vardır. prosedürün ilk kritik adım kemirgen beyinlerinin izolasyon olduğunu. Nitekim, dikkatli doku taşıma beyne zarar vermemek için ve kesitli zaman beyin yapıları bozulmadan kalmasını garanti etmek esastır. İkinci olarak, doku tespit süresi aşırı fiksasyon (% 4 PFA fazla 16 saat) hücre içi fagolizozomları ve Aβ içeriğinin tespiti sınırlar çünkü oldukça önemlidir. Önemli olarak, birbirini takip eden 1) monositler, 2) fagolizozomları boyanması ve 3) Aβ yöntemin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu Essent olduğunuial antikorlar eş zamanlı olmayan consecutively- kullanımı. 3D hücreleri fagolizozomları ve Aβ peptidi modellenmesi ve ko doku bölümünün kalınlığı boyunca hücresel ve hücre içi yapıların görüntüleme kalitesine bağlı analiz ettiğinden Ayrıca, z-yığın konfokal görüntülerin elde edilmesi, son derece önemlidir. Son olarak, yazılımda eşikleri ayarlama 3D modelleme ve ko analizi için çok önemlidir. Nitekim, farklı kanallar için eşik dikkatle analizden onlar (özel) dahil edildiği sinyali belirler, çünkü seçilmiş ya da dışarıda (arka plan) olması gerekir. Seçilmiş eşikler farklı hayvan / numunelerin karşılaştırılması durumunda numuneler arasında tutarlı kalmasını da esastır. Şimdiye kadar, klasik immunohistostaining, manyetik rezonans görüntüleme ve pozitron emisyon tomografisi Aβ in vivo görselleştirme ve kantitatif için tercih edilen görüntüleme yöntemleri olmuştur30. kemirgen ya AD hastalarının beyinlerinde amiloid büyük ölçekli miktar tayini için son derece kullanışlı olmasına rağmen, bu yöntemler, hücre-içi Aβ görüntülenmesi için yetersizdir. Konfokal mikroskopi, floresan spektroskopisi ve akış kullanarak diğer teknikler sitometri var ve ayrımcılık ve in vitro 16,31,32 hücre içi Aβ içeriği ölçmek için bize ve başkaları tarafından kullanılmıştır. 3D rekonstrüksiyonu ile bağlanmış immunogold boyama daha önce APP23 transjenik fareler 27 in vivo olarak mikroglia olan Amiloid fibrillerin olmadığını vurgulamak için kullanılmıştır, ve diğer bir çalışmada başarılı sınırlı Aβ göstermek için mikroglia ilişkili β-amiloid plaklar ile konfokal Görüntüleme ve 3D yüzey yeniden kullanılan etkileşim ve 33 alıma izin verir. Bununla birlikte, bu teknikler, içi fagolizozomal Aβ türlerinin miktarının belirlenmesi için izin yoktur. Diğer en son bir ölçüm sağlar in vivo analiz flüoresan bazlı gelişmişsıçan 34 periferik makrofajlar tarafından fagositik aktivite. Bu yöntem, ustalıkla vivo fagolizozomları floresan bioprobes nicelendirilmesi için, ancak, mevcut veriler kadar çevre sınırlıdır sağlar.
Bildiğimiz kadarıyla, q3DISM kemirgen AD modelleri beyinlerinde 3 boyutlu görselleştirme ve Aβ fagositoz kantitatif tanıyor ilk yöntemdir. Bu müthiş bir araç kuşkusuz serebral Aβ fagositoz daha derin bir anlayışa yol açacaktır, hem de diğer bağlamlarda yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| Dissecting scissors | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting scissors Blunt tip | VWR | 82027-588 | |
| Tweezers | VWR | 94024-408 | |
| 23 G needle | VWR | BD305145 | |
| peristaltic pump FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10x | Bioland Scientific | PBS01-02 | Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x |
| Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-200C | |
| Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm | Kent Scientific | RBMS-305C | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | EMS | 15714-S | Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | Various concentrations, see protocol |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| Embedding and Infiltration Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| Disposable Microtome Blades | VWR | 25608-964 | |
| Water bath Leica HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | Caution: Toxic |
| Target Retrieval Solution 10x | DAKO | S1699 | Working concentration 1x |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| Hydrophobic PAP pen | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Glass Slide Rack | VWR | 100492-942 | |
| Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) | Wako | 019-19741 | Working concentration 1:200 |
| Iba1 antibody (polyclonal, goat) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | Working concentration 1:200 |
| rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) | Abcam | ab955 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) | Abcam | ab53444 | Working concentration 1:200 |
| mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) | Affymetrix | 14-1071 | Working concentration 1:100 |
| Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39220 | Working concentration 1:200 |
| Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) | Covance | SIG-39320 | Working concentration 1:200 |
| OC antibody (polyclonal, rabbit) | Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) | Working concentration 1:200 | |
| Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11001 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 488 rat secondary antibody | Invitrogen | A-11006 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11037 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A-11080 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody | Invitrogen | A-21235 | Working concentration 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-21443 | Working concentration 1:1,000 |
| Immersion oil | Nikon | ||
| A1 Confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements Advanced Research software | Nikon | ||
| Imaris:Bitplane software version 7.6 | Bitplane | "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets. |
References
- Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
- Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774 (2010).
- Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
- Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
- Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
- Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
- Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949 (2012).
- Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
- Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
- Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185 (2012).
- Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
- Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
- Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
- Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
- Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
- Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
- Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
- Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
- Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
- Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33 (2015).
- Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).
- Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
- Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
- Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
- Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
- Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).
