Summary
Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.
Abstract
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een buitengewone hulpmiddel voor het bestuderen van cel ultrastructuur, om eiwitten te lokaliseren en te visualiseren macromoleculaire complexen bij zeer hoge resolutie. Echter, om zo dicht mogelijk bij de oorspronkelijke staat te krijgen, is perfect monster- conservering vereist. Conventionele elektronenmicroscopie (EM) fixatie met aldehyden, bijvoorbeeld, biedt geen goede ultrastructurele bewaring. De langzame penetratie van fixatieven induceert cel reorganisatie en het verlies van de verschillende celcomponenten. Daarom is de conventionele EM fixatie niet zorgen voor een onmiddellijke stabilisatie en behoud van structuren en antigeniciteit. De beste keuze voor de behandeling van intracellulaire gebeurtenissen op Cryofixatie gevolgd door vries-substitutie fixatiemethode dat cellen houdt in hun natieve toestand te gebruiken. Hoge druk invriezen / vries-substitutie, die de integriteit van cellulaire ultrastructuur behoudt, is de meest gebruikte methode, maar vereist expensive apparatuur. Hier wordt een eenvoudig te gebruiken en goedkope vries fixatiemethode gevolgd door vries-substitutie voor suspensie celkweken gepresenteerd.
Introduction
Monster voorbereiding is van cruciaal belang voor het succes van een elektronenmicroscopie studie. EM conventionele fixatie was de primaire methode voor het bevestigen van weefsels of cellen voor transmissie elektronenmicroscopie (TEM) 1. Eerst, aldehyden en osmiumtetroxide worden gebruikt om het materiaal bij kamertemperatuur chemisch oplossen. Daarna wordt het materiaal met organische oplosmiddelen gedehydrateerd, geïnfiltreerd en ingebed in epoxyhars. Deze werkwijze is afhankelijk van de penetratiegraad van fixatieven in de cel. Bijgevolg worden de artefacten en winning van celinhoud meestal waargenomen 2.
Cryofixatie is duidelijk een beter alternatief voor het behoud van cellulaire structuren 3, waardoor ze intact. De hoogste kwaliteit van TEM beelden 4 in dunne harssecties kunnen worden verkregen met de Cryofixatie / vries substitutiemethode. Het doel van deze techniek is om verglaasd bi verkrijgensche monsters zonder ijskristallen vormen of met ijskristallen klein genoeg de ultrastructuur van de cellen te beschadigen. Hoge druk invriezen (HPF) en ultrasnelle Cryofixatie, die ook wel plunge freezing (PF), op twee manieren monsters cryofix. HPF immobiliseert moleculen in de cel onmiddellijk en voorkomt schade door conventionele EM fixatie. Verschillende soorten bevriezen machines en automatische vervanging apparaten zijn ontwikkeld 5. Bevriezing machines en materialen (vloeibare stikstof, monsterdragers, etc.) zijn duur, maar ze zorgen voor de productie van hoogwaardige elektronmicrografen 6, 7. PF is een techniek die gebruikt werd in de vroege jaren 1950 en in de literatuur beschreven als eenvoudige en goedkope 8 .Tijdens de PF procedure wordt het voorbereide monster bevroren bij een hoge snelheid te verkrijgen ijskristallen kleiner dan 3 tot 5 nm. Daartoe wordt het monsterondergedompeld in een vloeibaar cryogeen, zoals ethaan, propaan, of een etheen-propeen-mengsel. Sinds de jaren 1950 zijn er verbeteringen van PF gedaan om deze techniek beschikbaar te maken voor een groter aantal gebruikers. Hogedruk vriezen is momenteel de enige werkbare manier om een groot aantal monsters te bevriezen dikker dan 50 urn (tot een dikte van 200 urn voor schijfvormige monsters) 5, terwijl PF grote schaal wordt gebruikt voor beeldvorming kleine voorwerpen (<100 nm ) zoals macromoleculaire complexen gesuspendeerd in een dunne film van amorf ijs 9. Grotere monsters, bijvoorbeeld eukaryote cellen, kunnen worden cryofixed PF, maar vereist monsterhouders, zoals capillaire buizen of koper sandwichsystemen 8, 10, 11.
Hier een snelle, eenvoudig te gebruiken en voordelig plunge freezing / vries-substitutie technologie geschikt voor diverse suspensie celkweken gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Formvar Grid Film
OPMERKING: Voer chloroform manipulatie onder een zuurkast met behulp van persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas, glazen). Met 400 mesh koper roosters elektronenmicroscopie. Bij andere soorten rooster (andere maaswijdte, goud en nikkel grids), de kwaliteit van het bevriezen is erger.
- Bereid een 100 ml oplossing van 0.3% formvar in chloroform. Laat het overnacht lossen zonder schudden.
- Put 400 mesh (aantal openingen per vierkante inch) elektron microscopycopper roosters (diameter 3,05 mm) in een glazen flesje (hoogte 3 cm en de diameter 2 cm) met aceton. Roer het glazen flesje met een cirkelvormige handbeweging. Verwijder het aceton met een plastic pipet overdracht. Laat het oplosmiddel verdampen gedurende 5 minuten. Breng de rasters door ze te gieten op een filtreerpapier en laat ze drogen gedurende 5 minuten.
- Polijsten een 76 x 26 mm2 glasplaatje schoon met een pluisvrije doek tot glanzend / glad.
- Neem een kristallisator (diameter 15 cm, hoogte: 7 cm en capaciteit 1200 ml) en vul tot de rand met gedestilleerd water. Reinig het wateroppervlak door het passeren van een glasstaaf over het oppervlak twee keer om stof te verwijderen.
- Houd het glasplaatje tussen twee vingers en dompel het in de formvar oplossing voor een paar seconden. Houd deze rechtop te drogen onder een omgekeerde beker gedurende 5 minuten.
- Wanneer de film droog is, de score van de randen van de glasplaat met een scherp scheermesje definiëren de grenzen van de folie losraakt van de glijbaan.
- Haal diep adem en adem zwaar op de dia naar een laag waterdamp te krijgen op en onder de film om de film enigszins ondoorzichtig te maken en de zichtbaarheid te vergroten.
- Onmiddellijk zweven de film op de kristallisator wateroppervlak door op de onderzijde van de schuif met een hoek van ongeveer 30 °. Laat de film afgifte uit de glijbaan en afschilferen op het kristallisator wateroppervlak. Trek de film weg depincet, indien nodig.
- Leg de roosters ondersteboven op de film drijvend op het wateroppervlak in de gebieden die de juiste dikte (ongeveer 10 nm) en zonder rimpels.
- Pak de film door het bedekken van de netten Joseph papier ze drijven op het wateroppervlak kristallisator.
- Houd de Joseph papier met één hand, raakt u het ene uiteinde van de Joseph papier aan één uiteinde van de film. Wacht tot de Joseph papier helemaal nat. Verwijder de Jozef papier met de roosters vast op.
- Plaats de roosters gedurende 24 uur in een afgedekte petrischaal voor de definitieve droging en opslag voorafgaand aan gebruik bij kamertemperatuur.
2. Bereiding van vorst-substitutie Medium
OPMERKING: Osmiumtetroxide (OsO 4) en uranylacetaat zijn gevaarlijke chemische stoffen. Behandel ze in de zuurkast tijdens het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een laboratoriumjas en handschoenen. Follow de veiligheidsvoorschriften voor het omgaan (OsO4) en uranyl acetaat. Gebruik O-ring cryovials lekkage van OsO4 voorkomen.
- ultrastructurele studies
- Zet glas OsO 4 ampul in een glazen fles.
- Breek de ampul door schudden van de kolf.
- Een zodanig volume aceton 100% tot 4% eindconcentratie te verkrijgen.
- Roer en verdeel 1,5 ml porties in 1,8 ml cryovials.
- eiwit immuunlabeling
- Plaats 0,05 g uranyl acetaat in een glazen kolf.
- Voeg 50 ml 100% aceton.
- Roer de oplossing met een magnetische roerder. Wanneer de oplossing helder wordt, filteren met behulp van een 0,2 urn filter.
- Afzien van 1,5 ml porties in 1,8 ml cryovials.
OPMERKING: Bereid de cryovaatjes met freeze-substitutie medium voorafgaand aan de duik invriezen en bewaar ze in -84 ° C vriezer. Keer de glazen fles weg te gooien hetOsO 4 ampul in het gevaarlijk afval.
3. Bereiding van Cellen
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor het succes van de methode. Voor alle celtypen, groeien de cellen aan het aangegeven aantal cellen te verkrijgen. Centrifugeer de buis aangegeven op de aangegeven tijd en snelheid.
- Om de geschikte consistentie van de pellets van verschillende celtypen te verkrijgen, groeien de cellen als volgt:
- Voor Saccharomyces cerevisiae en Schizosaccharomyces pombe, gist inoculeren in 5 ml minimaal of volledig vloeibaar medium. Incubeer overnacht bij 28 ° C, roterende (180 rpm). Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van de overnacht kweek. Verdun gistcellen tot een OD600 van 0,2 in 50 ml vers selectief medium. Blijven cellen incuberen bij 28 ° C, het roteren, tot 1 x 10 7 9 gistcellen te verkrijgen.
- Voor Leishmania flagellum, inokeningen parasieten in 5 ml AM-medium met 7,5% FCS (foetaal kalfsserum). Incubeer overnacht bij 24 ° C, roterende (180 rpm). Meet de OD 600 van de nachtelijke cultuur. Verdun parasiet cellen aan een OD600 van 0,2 in 50 ml vers selectief medium. Blijven cellen incuberen bij 24 ° C, het roteren, 5 x 10 8 cellen parasiet 12 te verkrijgen.
- Voor Trypanosoma brucei, parasieten inoculeren in 5 ml SDM-79 medium met 10% FCS en 30 ug / ml hygromycine. Incubeer overnacht bij 27 ° C, roterende (180 rpm). Meet de OD 600 van de nachtelijke cultuur. Verdun parasiet cellen aan een OD600 van 0,2 in 50 ml vers selectief medium. Blijven cellen incuberen bij 27 ° C, het roteren, 5 x 10 8 cellen parasiet 13 te verkrijgen.
- Voor Escherichia coli, bacteriën inoculeren in 5 ml DYT medium met 100 ug / ml ampicilline. Incubeer overnacht bij 37 ° C, roterende (180rpm). Meet de OD 600 van de nachtelijke cultuur. Verdun bacteriecellen een OD600 van 0,2 in 50 ml vers selectief medium. Blijven cellen incuberen bij 37 ° C, het roteren, 5 x 10 10 bacteriecellen 14 te verkrijgen.
OPMERKING: Na overnacht incubatie kunnen cellen in kweek in hetzij logaritmische en stationaire groeifase. Zeer langzaam groeiende cel stammen kunnen incubatietijd langer dan één nacht, of enten van een groter aantal cellen nodig hebben, zoals empirisch bepaald.
- Voor alle celtypes, breng het kweekmedium dat de cellen tot 50 ml polypropyleen buis en centrifugeer gedurende 3 min bij 1.500 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van alle celtypes in 1 ml van de desbetreffende celkweekmedium.
- Centrifuge alle celtypes in een microcentrifuge buis gedurende 1 min bij 3.900 x g. Volledig verwijderen van de bovenstaande vloeistof.
- Houd de cellen op ijs.
Opmerking: Behandel vloeibare stikstof voorzichtig. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder cryogloves en googles. Propaan potentieel explosief, zodat voeren de vloeibaarmaking in een goed geventileerde ruimte of in een zuurkast. Geen open vuur zijn niet toegestaan.
- Zet ongeveer 150 ml vloeibare stikstof in een schotel van polystyrene. Plaats een koperen kop (hoogte 3,6 cm, diameter 2 cm en de dikte 1,5 mm) in vloeibare stikstof te bevriezen. Laat de vloeibare stikstof door te dringen in de koperen beker.
- Wacht totdat de bellen verdwijnen om zeker te zijn dat de koperen beker is bevroren.
- Zet de slang verbonden met de gasfles in contact met de koperen bekerwand.
- Open voorzichtig propaan cilinderafsluiter.
LET OP: Bij deze stap, de propaan vloeibaar wordt in de koperen beker. - Stop het vloeibaar maken door het sluiten van propaan cilinder en snel verwijderen van de gasslang.
- Vul het polystyreen bak met vloeistof niTrogen tot 5 mm van de bovenkant van de koperen beker. Laat de vloeibare stikstof door te dringen in messing beker.
5. Plunge Bevriezing van het monster
- Zet ongeveer 200 ml vloeibare stikstof in polystyreen tray. Vries kleine messing bekers (hoogte 1,5 cm diameter 2,5 cm en de dikte 1 mm) door ze in vloeibare stikstof. Zet een cup voor een draagkabel celmonster. Zorg dat er geen monsters te mengen. Daartoe zet monster 1 in de beker 1, monster 2 in de beker 2, enz.
- Bevries de pincet door dompelen de tip in vloeibare stikstof.
- Storten dubbele rand dissectie naald in de verkregen pellet in 3,5.
- Met een pincet, neem een 400 mesh koper microscopie rooster bekleed met formvar bereid in paragraaf 1.
- Met het ontleden naald, een druppel van de verkregen pellet in 3,5 op de grid. Probeer verschillende druppel maten (bv 2, 5 en 10 pi).
- Zeer snel dompelen de raster bezit van het pincet in vloeibaar propaan genbeoordeelde hoofdstuk 4 en roer het raster met cirkelvormige beweging gedurende enkele seconden.
- Een snelle overdracht van de bevroren rooster met de pincet om de kleine koperen beker bevroren in paragraaf 5.1.
LET OP: Voor elk monster te maken ten minste 3 roosters. bevriezen altijd het pincet alvorens een koperen raster.
6. Freeze-substitutie
OPMERKING: Osmiumtetroxide is potentieel explosief, zodat een luchtverfrisser ademhalingstoestel met damppatronen. Het bevriezen van het fixeermiddel in vloeibare stikstof voordat plunge invriezen is ook een oplossing.
- Voor ultrastructuur studies, opent de cryovial 1,8 ml buisjes met vries-substitutie medium bereid in paragraaf 2.1. Voor immunolokalisatiestudies Open de cryovial 1,8 ml buisjes met vries-substitutie medium bereid in paragraaf 2.2. Plaats de dop op de cryovials.
- Bevries de pincet door dompelen de tip in vloeibare stikstof.
- Snel verwijder de dop en breng de bevroren roosters iNTO de cryovials met de pincet.
- Plaats de dop terug op de cryovials.
- Herhaal dit voor elk raster van elk monster.
- Sluit alle doppen en roer het cryovials met een cirkelvormige handbeweging te zorgen voor de monsters de vries-substitutie medium.
- Plaats de cryovials in een luchtdichte doos voor 3 dagen in een -84 ° C vriezer gedurende het invriezen en vervangingsproces.
7. Monster Warming
- ultrastructuur studies
- Dragen de cryovials in een schotel van polystyrene een -30 ° C vriezer (een snelle verwarming te vermijden). Plaats ze in de -30 ° C vriezer gedurende 1 uur.
- Plaats de cryovials in een -15 ° C vriezer gedurende 2 uur. Plaats de monsters bij 4 ° C gedurende 2 uur en daarna gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder het bevriezen substitutie medium met een kunststof pipet overdracht. Voeg ongeveer 500 pi van 100% aceton.
- Roer het cryoflesje 1,8 mlmet een cirkelvormige handbeweging snel en giet het aceton (1,5 ml) dat de roosters in een glazen flesje (hoogte 3 cm en een diameter van 2 cm).
- Spoel dezelfde cryovial met 1 ml 100% aceton om zeker alle rasters te hebben overgedragen. Roer de cryovial met een cirkelvormige handbeweging en giet de inhoud van de cryovial in een glazen flesje.
- Spoel alle glazen flacon met 3 ml 100% aceton 3 keer gedurende 10 min.
- Volg de procedures inbedding en integratie zoals beschreven in referentie 15. Impregneren monster met toenemende concentraties van epoxyhars in aceton (25%, 50% en 75%) en verankeren van het monster met 100% epoxyhars gelatinecapsules.
- immuunlabeling studies
- Draag de 1,8 ml cryovials in een schotel van polystyrene de -30 ° C vriezer (een snelle verwarming te vermijden).
- Plaats de cryovials gedurende 2 uur in een -30 ° C vriezer.
- Bij een -30 ° C vriezer, roer het cryoflesje met een cirkelvormige handbeweging snel en giet de bevriezing substitutie medium in een polypropeen flesje (5 cm en diameter 1,5 cm).
- Vervang het bevriezen substitutie medium met 2 ml vers medium vries-substitutie.
- Plaats de polypropyleen flesje gedurende 2 uur in een -30 ° C vriezer.
- Spoel het polypropeen flesje gedurende 1 uur met 2 ml 100% aceton en drie keer gedurende 1 uur met 2 ml 100% ethanol.
- Volg de procedures inbedding en integratie zoals beschreven in referentie 15. Impregneren monster met toenemende concentraties van acrylhars (25%, 50% en 75% in aceton) en verankeren van het monster met 100% acrylhars in gelatinecapsules.
8. Visualisatie van monsters
- Na inbedden, maakt 80 nm ultradunne secties van de monsters met een ultramicrotoom. Contrast secties met 2% loodcitraat bij kamertemperatuur gedurende 1 minass = "xref"> 15.
- Gebruik een 80 kV en 120 kV elektronenmicroscoop aan de secties 15 te observeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit artikel wordt een eenvoudig te gebruiken en goedkope plunge freezing werkwijze voor ultrastructurele (figuur 1 en figuur 2) en immunokleuring (figuur 3) studies gepresenteerd. We laten zien dat het niet nodig is om speciale apparatuur voor de vries-substitutie procedure en dat de opwarming procedure duurt minder dan 6 uur in plaats van de 24 uur met behulp van een speciaal systeem.
PF / vries-substitutiemethode resulteerde in verbeterde bescherming van de intracellulaire structuren van Saccharomyces cerevisiae (Figuur 1A en 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (figuur 1B en C), Leishmania flagellum (Figuur 2 A en B), Trypanosoma brucei (figuur 2C en D), en Escherichia coli (Figuur 2E). De structuren zijn niet gekrompen en het cytoplasma lijkt dicht. Verder zijn de membranen glad, wat een bewijs van goede conservering. Alle organellen, zoals nucleus (Figuur 1A, B en D figuur 2A-D), mitochondria (Figuur 1 A-C, E en H) en vacuolen (figuur 1 A, C, F en H), kan perfect worden geïdentificeerd . In de kern, een dubbele membraanvormende kern envelop, kernporie, spindle paallichaam en ribosomen bevestigd aan het buitenste membraan van de kern envelop zijn duidelijk zichtbaar (Figuur 1D en figuur 2B, 2D). In de mitochondria, de interne membraan instulpingen, genaamd cristae (Figuur 1E), zijn duidelijk zichtbaar. De vacuolen zijn kritisch organellen omdat grote ijskristallen gemakkelijk kan ontwikkelen binnen hen. Zoals geïllustreerd in figuur 1, worden vacuolen perfect behouden zonder ijs kristalschade (figuur 1 A, C, F en H). Tenslotte, aangezien de ultrastructuur goed bewaard gebleven, verschillende biologische gebeurtenissen kan worden waargenomen en geanalyseerd, zoals autophagy (figuur 1 C, F en H), mitochondriale morfologie (figuur 1E), secretoire vesikels (figuur 1G) en kerndeling (figuur 1A Figuur 2 B, eennd 2C).
In situ lokalisatie van eiwitten met specifieke antilichamen is één van de meest krachtige en populaire technieken in de celbiologie. PF kan ook worden gebruikt als een methode om eiwit immuunlokalisatie voeren. Deze werkwijze behoudt eiwit antigeniteit en, zoals hierboven genoemd, organel identiteit. Verschillende antilichamen gericht verschillende gisteiwitten, zoals anti-ATP synthase 7, 15 (figuur 3A, 3C en 3D), anti-GFP (Figuur 3B), anti-porine 16 (figuur 3 E) en anti-fox2 17 (fig 3F), zijn al getest. Het is ook mogelijk om deze experimenten uit te voeren op verschillende organismen, zoals Leishmania 12.
Figuur 1: TEM beelden van ultrastructurele studies van gist Saccharomyces cerevisiae en Schizosaccharomyces pombe. (A) Overzicht van S. cerevisiae. (B) Overzicht van S. pombe. (C) Een deel van S. pombe cytoplasma. (D) Hoge vergroting van een kern. (E) Detail van een mitochondrion met cristae duidelijk zichtbaar. (F) vacuole morfologie tijdens autofagie. (G) Yeast kiem met secretie blaasjes binnen. (H) Voorbeeld intieme contact tussen vacuolen en mitochondria gedurende het proces autofagie. N, nucleus; V, vacuole; m, mitochondrion; SV, secretie Vesikelen; r, ribosomen. Schaalbalken = 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: TEM beelden van ultrastructurele studies van Leishmania amazonesis, Trypanosoma brucei en E. coli. (A) Overzicht van Leishmania. (B) Detail van Leishmania cytoplasma nucleaire porie en endoplasmatisch reticulum. (C) Overzicht van T. brucei. (D) met hoge vergroting van T. brucei kern. (E) Overzicht van E. coli-cel. N: nucleus; V, vacuole; m, mitochondrion; NP, nucleaire porie; F, flagellum; FP, flagellar zak; K, kinetoplast; r, ribosomen. Schaalbalken = 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Voorbeelden van eiwitmarkerende met behulp van monoklonale en polyklonale antilichamen. (A) Overzicht van S. cerevisiae. (B) Immunologisch merken van amyloïde-β met anti-GFP antilichamen. (CD) Voorbeeld van mitochondria merken met anti-ATP synthase antilichamen. (E) Porin lokalisatie externe membraan van een mitochondrion. (F) Fox2 eiwit wordt gedetecteerd in mitochondrion door immunokleuring. (G) Lokalisatie van Ld in Flabarineen langsdoorsnede van een flagellum van Leishmania amazonesis. Alle antilichamen worden gedetecteerd met behulp van 10 nm goud polyklonale antilichamen. N, nucleus; V, vacuole; m, mitochondrion. Schaalbalken = 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TEM is een krachtige methode voor ultrastructurele waarneming van organellen, cellen en weefsels. Cryofixatie / vries-substitutie is momenteel de beste methode voor het behoud van zowel ultrastructuur en eiwitten antigeniciteit. Chemische fixatieven penetreren en handelen langzaam waardoor structurele herschikkingen vóór de volledige stabilisatie van de ultrastructuur 2. Omgekeerd Cryofixatie / vries-substitutie stabiliseert direct cellulaire structuren 4. Echter, Cryofixatie / vries-substitutie technieken omvatten een aantal beperkingen en problemen voordoen waardoor hun toepassingsgebied te beperken. Dit betreft monster, bevriezing artefacten, realisatie van de techniek, kosten en apparatuur. De hoge druk invriezen / vries-substitutie techniek is een hoge mate van conservering van cellulaire gegevens 6, 7 ingeschakeld. Daarentegen wordt PF al gebruikt voor observing kleine voorwerpen opgehangen aan dunne films van amorf ijs 9. Hier, PF / vries-substitutie methode voor het ultrastructurele en immuunlabeling studies biedt een hoge kwaliteit beelden van gisten, parasieten en bacteriën ultrastructuur vergelijkbaar met hoge druk het stilzetten van beelden.
Fixatie kwaliteit hangt af van koelsnelheden 18. Bij hoge koelsnelheden, water in de glasachtige toestand en geen zichtbare kristallijne structuur tonen op elektronenmicroscopie niveau. Verglazing vindt slechts plaats in een zeer dunne oppervlaktelaag (200 pm in het algemeen) en zal derhalve goede dikte bevriezen geleidelijk af van het oppervlak van het monster tot de binnenlagen 4. In plantencellen, kunnen waslaag of ruimtes gevuld met gas trage koelsnelheid. Met PF, verrassend, geen afname van de kwaliteit van de bevriezing prestaties werd waargenomen. In alle experimenten, het percentage van goed bevroren cellen is g reater dan 50%. Dit percentage varieert van 50% tot meer dan 90% en is afhankelijk van diverse parameters (kweekmedium, fysiologische toestand van de cellen, buitentemperatuur en vochtigheid). Zoals hierboven vermeld, de vorming van ijskristallen vernietigt de celstructuur en ijskristallen bijzonder zichtbaar in vacuolen. In de PF / vries vervanging proces, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de vriestemperatuur. De bevriezing substitutiestap mag niet boven -82 ° C worden uitgevoerd, anders is het glaslichaam water wordt omgezet in kristallijn water. Om de vorming van ijskristallen schade te voorkomen, wordt cryoprotectant momenteel gebruikt, maar die leidt tot veranderingen in de ultrastructuur van de cellen 19. Gisten, bacteriën en parasieten cultuur mediums kan een component die cryoprotectiemiddel bevatten. In dit verband werd niet besloten om extra koude beschermend middel te gebruiken om zo dicht mogelijk bij de feitelijke cellulaire staat te zijn.
ve_content "> Het succes van PF / bevriezen substitutie afhankelijk van vele kritische stappen in de ontwikkelingsfase van de werkwijze. Eerst wordt een kritisch punt is om de juiste consistentie van de pellets te verkrijgen. De verkregen pellet na centrifugatie dient klein genoeg te walsen worden op een elektronenmicroscopie rooster. Als de pellet is te compact, de vries-substitutie oplossing kan niet de drop te dringen, en de ultrastructuur worden niet goed bewaard gebleven. Omgekeerd, als de pellet is niet compact genoeg is, kan de overgebleven kweekmedium ontwikkelen ijskristallen en beïnvloeden de cel ultrastructuur. om de geschikte consistentie van de pellets uit verschillende celtypen te verkrijgen, is het noodzakelijk de kweekomstandigheden betrekking tot het aangegeven aantal cellen en centrifugeren parameters van het protocol te verkrijgen (zie hierboven) voor alle celtypen. de hoeveelheid materiaal die op de koperen rooster is niet kritisch. Verschillende druppelgrootte kan worden onderzocht. Ten tweede, het rastertype that wordt gebruikt als drager is belangrijk. Verschillende goud, nikkel en koper roosters met verschillende maaswijdte werden getest. De beste resultaten werden verkregen met een 400 mesh koperen rooster met dunne staven. Ten derde, met betrekking tot het invriezen, een koperen beker de voorkeur de vloeibaar propaan. Vloeibare propaan kop koper de neiging te bevriezen en derhalve bemoeilijkt het experiment. Ten slotte moet de manipulator snel en in koude omstandigheden werken om toevallige steekproef warm-up te voorkomen. Als het gebeurt, moet het monster worden weggegooid. Bijvoorbeeld, monster opwarming voorkomen, de pincetten worden voorgekoeld alvorens hen en de bevriezing substitutie medium moet ruim vóór voordat de procedure worden bereid. Gekoelde pincet moet tijdens de duik vriesproces becauseif de sprong invriezen worden gerealiseerd zonder bevriezen van de pincet, veel rook vormen de pincetten worden ondergedompeld in propaan (vanwege de warmte / koude-uitwisseling). Dit heeft onvermijdelijk een impact op de koeling tarieven. Proeven met samples bevroren met bevroren pincet lijken niet goed te worden bevroren.Bovendien is het gebruik van gevaarlijke chemicaliën zoals O S O 4 en uranyl acetaat in de freeze-substitutie medium vereist tijdens de bereiding van oplossingen en vries-substitutie werkwijze werkzaamheden onder zuurkast met voldoende PPE. Lekkage van OsO4 en dampen te voorkomen, moet cryovials een harde O-ring zodat de buizen verzegeld blijven tijdens bevroren substitutie proces. Onnodige blootstelling aan osmium damp tijdens de bereiding vries-substitutie medium te voorkomen, kan het OsO4 ampul wordt gebroken in een glazen kolf. De aanwezigheid van glasscherven in de hars blok na opname kan worden voorkomen door fijne punt pipetten tijdens ketonen spoelen en stappen inbedden. Het uitvoeren van het opnemen trap onder een binoculaire lus en de realisatie van semi-dunne secties maakt ook verifiëren dat er geen glasscherven.Wanneer de experimenten niet onder een zuurkast (met name in de eerste stap van het bevriezen vervangingsproces) kan worden uitgevoerd, gebruikt een lucht ademhalingstoestel met damppatronen. De manipulator moet voorzichtig zijn bij het werken in koude vloeibare stikstof of bij vorst stappen. Het gebruik van handschoenen en een bril worden aanbevolen. Verder propaan potentieel explosief, zodat het vloeibaar worden uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte of in een zuurkast en geen open vlammen toegestaan.
Verschillende artikelen bleek dat een groot aantal monsters, zoals hersenweefsel, klimopblad of wortelpuntjes van A. thaliana en N. benthamiana, het behoud van de ultrastructuur wordt verbeterd met het HPF techniek in vergelijking met chemische fixatie 20, 21. Met PF, werden de experimenten uitgevoerd op cellen in suspensie. Daarom is er geen indicatie van het succes van deze techniek op de larger monsters zoals weefsels. Verdere experimenten moeten worden uitgevoerd om dit punt aan te pakken. De werkwijze is met succes getest met filamenteuze schimmel Podospora anserina die niet geïsoleerde cellen maar eerder van myceliumvorm 22.
De methode in dit artikel een belangrijke verbetering vergeleken met de huidige werkwijzen van chemische fixatie of HPF. Zo heeft PF geen dure apparatuur of verbruiksgoederen nodig, in tegenstelling tot HPF 23. Ook moet worden genomen, omdat de HPF techniek maakt gebruik van een grote hoeveelheid vloeibare stikstof (ongeveer 80 liter per experiment). Met de voorgestelde techniek, een groot voordeel is dat er geen belangrijke apparatuur die nodig 23 is. Dus de kosten van een experiment veel lager (ongeveer honderd maal goedkoper). Een ander voordeel is dat er geen bijzondere expertise is nodig omdat de techniek is eenvoudig te gebruiken. De steekproef verwerking of PF / vries-substitutie is veel korter dan HPF / vries-substitutie als gevolg van het opwarmingsproces minder dan 6 uur duurt in plaats van 24 uur 24. Het is niet meer tijd in beslag dan de gebruikelijke chemische fixatie. Het voordeel is dat de cellulaire ultrastructuur perfect bewaard gebleven met een minimum aan artefacten en is veel dichter bij de originele staat van de cellen. De toepassing van deze technologie zal zeker van nut verschillende snelle biologische gebeurtenissen te bestuderen of om eiwitten te lokaliseren met een hoge resolutie cellen gekweekt in suspensie en voor monsters van enkele micrometers dikte, zoals fungale schimmeldraden 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij spreken onze dank uit aan M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, en A. Devin voor hun hulp en opmerkingen over de manuscript. We zijn dankbaar voor de elektronische beeldvorming pool van Bordeaux Imaging Center waar de beelden werden genomen. Dit werk werd ondersteund door het Centre National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8.5 mL | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
