Summary
Dette manuskriptet beskriver en lett-å-bruke og rimelig cryofixation metode for visualisering av suspensjonsceller av transmisjonselektronmikroskopi.
Abstract
Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) er en ekstraordinær verktøy for å studere celle ultrastrukturen, for å lokalisere proteiner og visualisere makromolekylære komplekser med meget høy oppløsning. Men for å komme så nær som mulig til den opprinnelige tilstand, perfekt prøve bevaring nødvendig. Konvensjonell elektronmikroskopi (EM) fiksering med aldehyder, for eksempel, gir ikke god ultra konservering. Den langsomme gjennomtrengning av bindemiddel induserer celle reorganisering og tap av forskjellige cellekomponenter. Derfor vil konvensjonell EM fiksering ikke tillater en umiddelbar stabilisering og konservering av strukturer og antigenisitet. Det beste valget for behandlingen av intracellulære hendelser er å bruke cryofixation etterfulgt av frysesubstitusjonsfikseringsmetode som holder cellene i deres native tilstand. Høytrykks frysing / fryse-substitusjon, noe som bevarer integriteten av cellulær ultrastrukturen, er den mest brukte metoden, men krever expensive utstyr. Her blir en lett-å-bruke og rimelig frysefikseringsmetode fulgt av fryse-substitusjon for suspensjon cellekulturer presentert.
Introduction
Prøvepreparering er avgjørende for suksess for et hvilket som helst elektronmikroskopi studien. Konvensjonelle EM fiksering var den primære metode for fiksering av vev eller celler for transmisjons-elektronmikroskopi (TEM) 1. Først blir aldehyder og osmium-tetroksyd som brukes for kjemisk å feste materialet ved romtemperatur. Deretter blir materialet dehydrert med organiske oppløsningsmidler, infiltrert og innstøpt i epoksyharpiks. Denne metode er avhengig av inntrengningshastigheten for bindemiddel inn i cellen. Følgelig blir gjenstander og utvinning av celleinnholdet som vanligvis observeres 2.
Cryofixation er helt klart et bedre alternativ for konservering av cellulære strukturer 3, holde dem intakt. Den høyeste kvalitet av TEM-bilder 4 i tynne harpiks seksjoner kan oppnås ved bruk av cryofixation / fryse-substitusjonsmetoder. Hensikten med denne teknikk er å oppnå forglasset biological samplene uten iskrystaller dannes eller som inneholder iskrystaller som er små nok til ikke å skade den ultrastrukturen av cellene. Høytrykks frysing (HPF) og ultra-hurtig cryofixation, som også kalles stupe frysing (PF), er to fremgangsmåter for å cryofix prøver. HPF immobiliserer molekyler i cellen umiddelbart og unngår skader forårsaket av konvensjonell EM fiksering. Flere typer av frysing maskiner og automatiske substitusjonsinnretninger er blitt utviklet 5. Fryse maskiner og materialer (flytende nitrogen, prøven bærere, etc.) er kostbare, men de gir mulighet for produksjon av høykvalitets-elektronmikros 6, 7. PF er en teknikk som ble brukt i de tidlige 1950-tallet og er omtalt i litteraturen så enkel og billig 8 .During PF prosedyre, blir den preparerte prøven frosset ved en hurtig hastighet for å oppnå iskrystaller størrelse mindre enn 3 til 5 nm. For å oppnå dette, er utvalgetkastet ut i et flytende kryogen, så som etan, propan, eller et etan-propan-blanding. Siden 1950-tallet har forbedringer av PF blitt gjort for å gjøre denne teknikken tilgjengelig for et større antall brukere. Høytrykks frysing er for tiden den eneste mulige måten å fryse en stor rekke prøver tykkere enn 50 um (opp til en tykkelse på 200 pm for skiveformede prøver) 5, mens PF er mye brukt til bilde små gjenstander (<100 nm ), slik som makromolekylære komplekser suspendert i en tynn film av amorft is 9. Større prøver, for eksempel eukaryote celler, kan cryofixed av PF, men krever prøveholdere, slik som kapillar kobberrør eller sandwich-systemer 8, 10, 11.
Her, en rask, lett å bruke og rimelig stupe frysing / fryse-substitusjon teknologi som kan anvendes for forskjellige suspensjon cellekulturer er presentert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av Formvar Grid Film
MERK: Utfør kloroform manipulasjon under en avtrekkshette ved hjelp av personlig verneutstyr (hansker, frakk, briller). Bruk 400 mesh elektronmikroskopi kobbernett. Med andre nett-typer (andre maskestørrelser, gull og nikkel rutenett), kvaliteten av frysing er verre.
- Fremstill en 100 ml oppløsning av 0,3% Formvar i kloroform. La den løse over natten uten omrøring.
- Sett 400 mesh (antall hull per kvadrattomme) gitrene elektron microscopycopper (diameter 3,05 mm) i et hetteglass (høyde 3 cm og diameter 2 cm) inneholdende aceton. Omrør hetteglass med en sirkulær bevegelse av hånden. Fjern aceton med en plast overføringspipette. At løsningsmiddelet kan fordampe i 5 min. Overfør gitterne ved å helle dem på et filterpapir og tillate dem å tørke i 5 minutter.
- Polere et 76 x 26 mm 2 glassplate ved å tørke den med en loer til de er blanke / glatte.
- Ta en krystallisator (diameter 15 cm, høyde: 7 cm og kapasitet 1200 ml) og fylle den til randen med destillert vann. Rens vannoverflaten ved å føre en glass bar over overflaten to ganger for å fjerne støv.
- Hold glass-slide mellom to fingre, og dyppe den i Formvar oppløsningen i noen få sekunder. Hold den stående for å tørke under en opp-ned beger i 5 min.
- Når filmen er tørr, score kantene av glass-slide med et skarpt barberblad for å definere grensene for filmen som skal løsnes fra glide.
- Ta et dypt åndedrag og puster tungt inn på lysbildet for å få et lag av vanndamp på og under filmen for å gjengi film litt ugjennomsiktig og styrke sin synlighet.
- Umiddelbart flyter filmen på krystallisatoren vannflaten ved å berøre bunnen av sleiden med en vinkel på omtrent 30 °. La filmen frigjøring fra lysbildet og skrelle den av på krystallisatoren vannoverflaten. trekke filmen forsiktig av medpinsett, om nødvendig.
- Forsiktig lå ristene med forsiden ned på filmen som flyter på vannoverflaten i de områder som er av passende tykkelse (ca. 10 nm) og uten rynker.
- Plukke opp filmen ved å dekke mellom gitrene og Joseph papir som de flyter på vannoverflaten krystallisatoren.
- Holder Joseph papir med en hånd, berører den ene enden av Joseph papir til den ene enden av filmen. Vent til Joseph papiret er helt våt. Fjern Joseph papir med nett fast på.
- Plassere ristene i 24 timer i en dekket petriskål for endelig tørking og lagring før bruk ved romtemperatur.
2. Fremstilling av Freeze-substitusjon Medium
MERK: Osmium-tetroksyd (OSO4) og uranylacetat er farlige kjemikalier. Håndtere dem i avtrekksskap mens iført egnet personlig verneutstyr (PVU) inkludert en laboratoriefrakk og hansker. Føllow sikkerhets advarsler for håndtering (OSO4) og uranylacetat. Bruk O-ring cryovials for å unngå lekkasje av OSO4.
- ultra studier
- Sett glass OsO 4 ampulle i en glasskolbe.
- Brekke ampullen ved risting av kolben.
- Tilsett en passende volum aceton 100% for å oppnå en 4% sluttkonsentrasjon.
- Rør og dispensere 1,5 ml aliquoter i 1,8 ml cryovials.
- protein immunmerking
- Plasser 0,05 g uranylacetat i en glasskolbe.
- Tilsett 50 ml 100% aceton.
- Oppløsningen omrøres med en magnetrører. Når løsningen blir klar, filtrerer det ved bruk av en 0,2 pm filter.
- Utlevere 1,5 ml aliquoter i 1,8 ml cryovials.
NB: Bland de fryseflasker inneholdende fryse substitusjon medium før steget fryseprosessen og holde dem på -84 ° C fryser. Snu glasskolbe til å kaste bortOsO 4 ampulle i farlig avfall.
3. Fremstilling av Cells
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å lykkes med metoden. For alle celletyper, vokser cellene for å oppnå det angitte antall celler. Sentrifuger i den angitte røret ved den spesifiserte tid og hastighet.
- For å oppnå den riktige konsistensen av pelletene fra forskjellige celletyper, dyrke celler som følger:
- For Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pombe inokuler gjær i 5 ml minimal eller fullstendig flytende medium. Inkuber over natten ved 28 ° C, som roterer (180 rpm). Måle den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600) av over natten-kulturen. Fortynn gjærceller til en OD 600 på 0,2 i 50 ml friskt selektivt medium. Fortsett å inkubere cellene ved 28 ° C, rotasjon, for å oppnå 1 x 10 9 gjærceller 7.
- For Leishmania flagellen, inoculate parasitter i 5 ml AM medium med 7,5% FCS (føtalt kalveserum). Inkuber over natten ved 24 ° C, som roterer (180 rpm). Måle OD 600 av over natten-kulturen. Fortynn parasitt cellene til en OD 600 på 0,2 i 50 ml friskt selektivt medium. Fortsett å inkubere cellene ved 24 ° C, rotasjon, for å oppnå 5 x 10 8 celler parasitt 12.
- For Trypanosoma brucei, inokulering av parasitter i 5 ml SDM-79 medium med 10% FCS og 30 ug / ml hygromycin. Inkuber over natten ved 27 ° C, som roterer (180 rpm). Måle OD 600 av over natten-kulturen. Fortynn parasitt cellene til en OD 600 på 0,2 i 50 ml friskt selektivt medium. Fortsett å inkubere cellene ved 27 ° C, rotasjon, for å oppnå 5 x 10 8 celler parasitt 13.
- For Escherichia coli, inokulering av bakterier i 5 ml DYT medium med 100 pg / ml ampicillin. Inkuber over natten ved 37 ° C, som roterer (180rpm). Mål OD 600 av overnatterkulturen. Fortynn bakterieceller til en OD 600 på 0,2 i 50 ml friskt selektivt medium. Fortsett å inkubere celler ved 37 ° C, roter, for å oppnå 5 x 10 10 bakterieceller 14 .
MERK: Etter inkubasjon over natten kan celler i kulturen være i enten logaritmisk eller stasjonær vekstfase. Meget langsomt voksende cellestammer kan kreve inkubasjonstider som er lengre enn en natt, eller inokulering av et større antall celler, som bestemt empirisk.
- For alle celletyper, overfør kulturmediet som inneholder cellene til 50 ml polypropylenrør og sentrifuge i 3 minutter ved 1500 x g.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten av alle celletyper i 1 ml av det aktuelle cellekulturmediet.
- Sentrifuger alle celletyper i et mikrocentrifugerør i 1 min ved 3.900 x g. Fjern helt supernatanten helt.
- Hold cellene på is.
Merk: Håndteres flytende nitrogen med forsiktighet. Bruk personlig verneutstyr, inkludert cryogloves og googles. Propan er potensielt eksplosiv, så utfører kondenseringen i et godt ventilert rom eller under en avtrekkshette. Ingen åpen ild er tillatt.
- Satt ca. 150 ml flytende nitrogen i en polystyren brett. Plasser en messing kopp (høyde 3,6 cm, diameter 2 cm og tykkelse 1,5 mm) i flytende nitrogen under frysing av den. Ikke la den flytende nitrogen å trenge inn i messing koppen.
- Vent til boblene avta å være sikker på at messingkopp er frosset.
- Sett slange koblet til propanflasken i kontakt med den messing koppveggen.
- Forsiktig for å åpne propanflaskeventilen.
MERK: På dette trinnet, flytende propan i messing cup. - Stopp flytende ved lukking av propanflasken ventilen og hurtig fjerning av gasslangen.
- Fyll polystyren brett med væske nitrogen inntil 5 mm fra toppen av messing koppen. Ikke la den flytende nitrogen å trenge inn i messing koppen.
5. Plunge Frysing av Sample
- Satt ca. 200 ml flytende nitrogen i polystyren skuffen. Fryse små messing kopper (høyde 1,5 cm diameter 2,5 cm og tykkelse 1 mm) ved å sette dem i flytende nitrogen. Sette en kopp for en suspensjonscelleprøve. Vær forsiktig med å blande prøvene. For å oppnå dette, setter prøve 1 i kopp 1, prøve 2 i kopp 2, etc.
- Fryse pinsett ved å dyppe sin spiss i flytende nitrogen.
- Styrter en dobbel kant dissekere nål i pelleten oppnådd i 3.5.
- Ved hjelp av pinsett, ta en 400 mesh kobbermikros gitter belagt med Formvar fremstilt i avsnitt 1.
- Ved hjelp av dissekere nål, plassere en dråpe av pelleten i 3,5 på risten. Prøve forskjellige dråpestørrelser (for eksempel 2, 5 og 10 ul).
- Meget hurtig neddykke gitteret holdes av pinsetten til flytende propan genvurdert i seksjon 4 og rør gitter med sirkulære bevegelse i noen få sekunder.
- Overfører man raskt den frosne gitter med pinsett til den lille messing koppen frosset i avsnitt 5.1.
MERK: For hver prøve, må minst 3 rutenett. pinsetten alltid fryse lot et kobbergitter.
6. Fryse substitusjon
MERK: osmiumtetroksid er potensielt flyktig, så bruker en gassmaske med damper av. Frysing fiksativ i flytende nitrogen før stupe frysing er også en løsning.
- For ultra studier, åpner 1,8 ml kryoampulle rør som inneholder fryse substitusjon medium fremstilt i avsnitt 2.1. For immunolocalization studier, åpner 1,8 ml kryoampulle rør som inneholder fryse substitusjon medium fremstilt i avsnitt 2.2. Sett lokket på cryovials.
- Fryse pinsett ved å dyppe sin spiss i flytende nitrogen.
- Raskt å fjerne hetten og overføre de frosne gitrene inFor cryovials ved hjelp av pinsett.
- Sett hetten tilbake på cryovials.
- Gjenta operasjonen for hvert gitter for hver prøve.
- Lukke alle hettene og røre cryovials med en sirkulær bevegelse av hånden for å sikre at prøvene er i den fryse substitusjon medium.
- Plasser cryovials i en lufttett boks for 3 dager i en -84 ° C fryser under frysesubstitusjonsprosessen.
7. Prøve Warming
- ultrastructure studier
- Bære cryovials i en polystyren brett (for å unngå en plutselig økning i temperatur) til en -30 ° C fryser. Plassere dem i -30 ° C fryser i 1 time.
- Plasser cryovials i en -15 ° C fryser i 2 timer. Plassere prøvene ved 4 ° C i 2 timer og deretter i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fjern det fryse substitusjon medium med en plast overføringspipette. Tilsett ca. 500 pl 100% aceton.
- Rør i 1,8 ml kryoampullemed en sirkulær bevegelse av hånden og hurtig helle aceton (1,5 ml) inneholdende tavlene i et hetteglass (høyde 3 cm og diameter 2 cm).
- Skyll det samme kryoampulle med 1 ml av 100% aceton for å være sikker på å ha overført alle gitterne. Omrør kryoampulle med en sirkulær bevegelse av hånden og helle innholdet i kryoampulle inn i et hetteglass.
- Skyll hvert hetteglass med 3 ml av 100% aceton 3 ganger i 10 min.
- Følg koblingen og inklusjonsfremgangsmåter som beskrevet i referanse 15. Impregnere prøven med økende konsentrasjoner av epoxyharpiks i aceton (25%, 50% og 75%) og legge prøven med 100% epoksyharpiks i gelatinkapsler.
- immunmerking studier
- Bære de 1,8 ml cryovials i en polystyren brett (for å unngå en plutselig økning i temperatur) til -30 ° C fryser.
- Plasser cryovials i 2 timer i en -30 ° C fryser.
- I noen -30 ° C fryser, rør kryoampulle med en sirkulær bevegelse av hånden og hurtig helle det fryse substitusjon medium i et polypropylen-hetteglass (høyde 5 cm og diameter 1,5 cm).
- Sett på fryse substitusjon medium med 2 ml friskt fryse substitusjon medium.
- Plasser polypropylen-hetteglass i 2 timer i en -30 ° C fryser.
- Skyll polypropylen-hetteglass i 1 time med 2 ml av 100% aceton og tre ganger i 1 time med 2 ml av 100% etanol.
- Følg koblingen og inklusjonsfremgangsmåter som beskrevet i referanse 15. Impregnere prøven med økende konsentrasjoner av akrylharpiks (25%, 50% og 75% i aceton) og legge prøven med 100% acrylharpiks i gelatinkapsler.
8. Visualisering av prøver
- Etter innstøping, må 80 nm-ultra-tynne snitt av prøvene med en ultramikrotom. Kontrast seksjoner med 2% bly-citrat ved romtemperatur i 1 minass = "ekstern referanse"> 15.
- Bruker en 80 kV eller 120 kV elektronmikroskop for å observere seksjonene 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikkelen er en lett-å-bruke og rimelig stupe frysemetode for ultra (figurene 1 og figur 2) og immunmerking (figur 3) studier presentert. Vi viser at det ikke er nødvendig å ha spesialutstyr for fryse-substitusjon prosedyre og at oppvarmingen prosedyren tar mindre enn 6 timer i stedet for 24 timer ved hjelp av et eget system.
PF / fryse-substitusjons metode resulterte i forbedret bevaring av de intracellulære strukturer av Saccharomyces cerevisiae (figur 1A og 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (figur 1B og C), Leishmania flagell (figur 2 A og B), Trypanosoma brucei (figur 2 C og D), og Escherichia coli (figur 2E). Strukturene er ikke krympet og cytoplasma vises tett. Videre membranene er glatte, noe som er et bevis på god konservering. Alle de organeller, slik som nucleus (figur 1 A, B og D figur 2A-D), mitokondrier (figur 1A-C, E og H), og vakuoler (figur 1 A, C, F og H), kan være helt identifiseres . I kjernen, en dobbel membrandannende kjerneomslaget, kjerne pore, spindel stavlegemet, og ribosomer festet på den ytre membran av atom konvolutten er tydelig synlige (figur 1D og figur 2B, 2D). I mitokondriene, de indre membran invaginations, kalt cristae (figur 1E), er klart synlige. De vakuoler er kritiske organeller fordi store iskrystaller kan utvikle seg lett inne i dem. Som illustrert i figur 1, er vakuoler perfekt bevart uten iskrystall skade (figur 1 A, C, F og H). Til slutt, som den ultrastruktur er godt bevart, forskjellige biologiske forandringer kan observeres og analyseres, slik som autophagy (figur 1C, F og H), mitokondriell morfologi (figur 1E), sekretoriske vesikler (figur 1 g), og kjerne divisjon (figur 1A Figur 2 B, ennd 2C).
In situ lokalisering av proteiner med spesifikke antistoffer er et av de kraftigste og mest populære metoder i cellebiologi. PF kan også anvendes som en metode for å utføre protein immunolocalization. Denne fremgangsmåten bevarer protein antigenisitet og, som nevnt ovenfor, organeller identitet. Forskjellige antistoffer målrettet mot forskjellige gjærproteiner, slik som anti-ATP syntase 7, 15 (figur 3A, 3C og 3D), anti-GFP (figur 3B), anti-porine 16 (figur 3E), og anti-fox2 17 (figur 3F), har allerede blitt testet. Det er også mulig å utføre disse eksperimenter på forskjellige organismer, slik som Leishmania 12.
Figur 1 : TEM-bilder av ultrastrukturelle studier av gjær Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pombe . ( A ) Oversikt over S. cerevisiae . ( B ) Oversikt over S. pombe . ( C ) Del av S. pombe cytoplasma. ( D ) Høy forstørrelse av en kjerne. ( E ) Detalj av et mitokondrion med cristae tydelig synlig. ( F ) Vacuolær morfologi under autofagi. ( G ) Gjærpinne med sekresjonsvesikler inni. (H) Eksempel på intime kontakter mellom vakuoler og mitokondrier under autofageprosessen. N, kjernen; V, vakuol; M, mitokondrion; SV, sekresjon vesisykluser; r, ribosomer. Skala Stolper = 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: TEM-bilder av ultra studier av Leishmania amazonesis, Trypanosoma brucei og E. coli. (A) Oversikt over Leishmania. (B) Detalj av Leishmania cytoplasma med atom pore og endoplasmatisk retikulum. (C) Oversikt over T. brucei. (D) høy forstørrelse av T. brucei kjerne. (E) Oversikt over E. coli celle. N: Kjerne; V, vakuolen; m, Mitochondrion; NP, nukleær pore; F, flagellum; FP, flagellar lomme; K, kinetoplast; R, ribosomer. Skalestenger = 200 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Eksempler på proteinmerking ved bruk av monoklonalt og polyklonalt antistoff. ( A ) Oversikt over S. cerevisiae . ( B ) Immunolabeling av amyloid-p med anti-GFP antistoffer. ( CD ) Eksempel på mitokondriamerkning med anti-ATP-syntasantistoffer. ( E ) Porin lokalisering i ekstern membran av et mitokondrion. ( F ) Fox2-protein påvises i mitokondrion ved immunomerkning. ( G ) Lokalisering av Ld Flabarin iet lengdesnitt av et flagell av Leishmania amazonesis. Alle antistoffene blir påvist ved anvendelse av 10 nm gull-polyklonale antistoffer. N, kjerne; V, vakuolen; m, mitokondrie. Skala Stolper = 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TEM er en kraftig metode for ultra observasjon av organeller, celler og vev. Cryofixation / fryse-substitusjonen er i dag den beste metode for bevaring av både ultrastruktur og protein antigenisitet. Kjemiske fiksativer penetrere og virke meget sakte og derved tillate strukturelle rearrangementer før den fullstendige stabilisering av ultra 2. Omvendt, cryofixation / fryse-substitusjon vendte stabiliserer cellestrukturer 4. Imidlertid cryofixation / fryse-substitusjons teknikker omfatter et antall begrensninger og vanskeligheter som derved begrenser deres anvendelsesområde. Dette gjelder prøven, fryse gjenstander, realisering av teknikken, kostnad og utstyr. Høytrykks frysing / fryse-substitusjon teknikk har muliggjort en stor grad av konservering av cellulære detaljer 6, 7. I kontrast er PF allerede brukt for obsErving små objekter opphengt på tynnfilmer av amorft, is 9. Her, PF / fryse-substitusjonsmetode for ultra og immunmerking studier gir bilder av høy kvalitet gjær, parasitter og bakterier ultrastrukturen sammenlignes med høytrykksfryse bilder.
Fiksering Kvaliteten avhenger av avkjølingshastigheter 18. Ved høye avkjølingshastigheter, er vann i den glassaktige tilstand og viser ikke synlig krystallinsk struktur ved elektronmikroskopi nivå. Forglassingen skjer utelukkende i et meget tynt overflatelag (200 pm generelt) og, derfor, vil god tykkelse frysing gradvis avta fra overflaten av prøven til de indre lagene 4. I planteceller, kan voksaktig belegg eller mellomrom er fylt med gass bremse kjølehastigheter. Med PF, overraskende ble det ikke observert noen reduksjon i kvaliteten på fryse ytelse. I alle forsøkene, er prosentandelen av brønn frosne celler g reater enn 50%. Andelen varierer mellom 50% til mer enn 90% og er avhengig av forskjellige parametre (dyrkningsmedium, fysiologiske status av cellene, utendørs temperatur og fuktighetsnivå). Som nevnt ovenfor, dannelsen av iskrystaller ødelegger cellestrukturen og iskrystallene er spesielt synlig i vakuoler. I PF / frysesubstitusjonsprosessen, må det gis spesiell oppmerksomhet til frysetemperaturen. Frys substitusjon Trinnet må ikke utføres over -82 ° C, ellers det vitrøse vannet blir omdannet til krystallinsk vann. For å unngå dannelsen av iskrystaller skade, blir kryobeskyttende middel for tiden brukes, men som fører til forandringer i den ultrastrukturen av cellene 19. Gjær, bakterier, og parasitt dyrkningsmedia kan inneholde en komponent som er kryobeskyttende middel. I denne sammenheng ble det besluttet ikke å bruke ekstra cryoprotectant for å være så nær som mulig til selve mobilnettet staten.
ve_content "> Suksessen med PF / fryse substitusjon er avhengig av mange kritiske trinn under utviklingsfasen av fremgangsmåten. For det første er et kritisk punkt for å oppnå den riktige konsistensen av pelletene. Resten oppnådd etter sentrifugering pellet må være kompakt nok til å kastes ut på en elektronmikroskopi gitter. Hvis pellet er også kompakt, kan det fryseerstatningsvæske ikke trenge inn i dråpen, og den ultrastruktur vil ikke være godt bevart. Motsatt, dersom pelleten ikke er tilstrekkelig kompakt, kan leftkulturmediet utvikle iskrystaller og forringe celleultrastruktur. for å oppnå den riktige konsistensen av pellets fra de forskjellige celletyper, er det nødvendig å respektere de kulturbetingelser for å oppnå det indikerte antall celler og sentrifugering for parametere som er angitt i protokollen (se ovenfor) for alle celletyper. imidlertid er mengden av materialet satt på kobbergitter ikke kritisk. forskjellige dråpestørrelser kan testes. for det andre gittertype that er brukt som en bærer er viktig. Flere gull, nikkel, kobber og gitre med forskjellige maskestørrelser ble testet. De beste resultater ble oppnådd med en 400 mesh kobbergitter med tynne stenger. For det tredje, med hensyn til frysetrinnet er en messing kopp foretrukket å kondensere propan. Flytende propan i kobber kopp har en tendens til å fryse og således kompliserer eksperimentet. Til slutt må manipulatoren arbeide raskt og under kalde forhold for å unngå utilsiktet prøve warm-up. Hvis det skjer, må prøven kasseres. For eksempel, for å forhindre at prøven oppvarming, pinsett må være forhåndsavkjølt før anvendelse av dem og fryse substitusjonsmiddel skal fremstilles i god tid før prosedyren. Kjølt pinsett må også brukes under stup fryseprosessen becauseif steget fryse realiseres uten å fryse pinsett, en rekke røykutvikling som pinsett så dyppes i propan (på grunn av varme / kulde utveksling). Dette har uunngåelig en innvirkning på kjølehastigheter. Forsøk med samples frosset med fryste pinsett synes ikke å være riktig frosset.Videre vil bruk av farlige kjemikalier slik som O S O 4 og uranylacetat i den fryse substitusjon medium krever, under fremstillingen av løsninger og fryse-substitusjonsprosessen, for å arbeide under avtrekkshette med tilstrekkelig PPE. For å hindre lekkasje av OSO4 og innånding av damper, må fryseflasker har en hard O-ring for å sikre at rørene forbli forseglet under frysesubstitusjonsprosessen. For å hindre unødvendig eksponering for osmium damp under fremstillingen av fryse substitusjon medium, kan det OSO4 ampullen brytes i en glasskolbe. Tilstedeværelsen av glasskår i harpiksen blokken etter inklusjon kan unngås ved anvendelse av tynn tupp overføringspipetter under acetones skyllinger og trinn for å bygge. Utføre inkludering trinnet med et stereo løkke og realisering av halv tynne seksjoner også gjør det mulig å verifisere at det ikke er noen glasskår.Når forsøkene ikke kan gjennomføres under en avtrekkshette (særlig i det første trinn av fryseprosessen substitusjon), bruker en gassmaske med damper av. Manipulatoren må også være forsiktig når man arbeider under kalde betingelser med flytende nitrogen eller under frysing trinn. Bruk av hansker og briller anbefales. Videre er propan potensielt eksplosiv, så flytendegjøring må utføres i et godt ventilert rom eller under en avtrekkshette og er åpen ild er tillatt.
En rekke artikler har vist at, på en lang rekke prøver som hjernevev, eføy blad, eller rotspissene av A. thaliana og N. benthamiana, er bevaringen av ultrastruktur forbedres med HPF-teknikk sammenlignet med kjemisk fiksering 20, 21. Med PF ble forsøkene utført på celler i suspensjon. Derfor er det ingen indikasjon på hvor vellykket denne teknikken på laRger prøver som vev. Ytterligere eksperimenter må gjennomføres for å løse dette punktet. Metoden har imidlertid blitt testet med filamentøs sopp Podospora anserina som ikke er isolerte celler, men er snarere av myceliumform 22 .
Metoden som presenteres i denne artikkelen representerer en signifikant forbedring i forhold til dagens metoder for kjemisk fiksering eller HPF. For eksempel krever PF ikke dyrt utstyr eller forbruksvarer i motsetning til HPF 23 . Det må også utvises forsiktighet fordi HPF-teknikken bruker en stor mengde flytende nitrogen (ca. 80 liter per eksperiment). Med den foreslåtte teknikken er det en stor fordel at ingen viktig utstyr er nødvendig 23 . Dermed er kostnadene ved et eksperiment mye lavere (omtrent hundre ganger billigere). En annen fordel er at ingen spesiell kompetanse er nødvendig fordi teknikken er enkel å bruke. Dessuten er prøveprosessen of PF / fryse-substitusjon er mye kortere enn HPF / fryse-substitusjon på grunn av oppvarmingen som tar mindre enn 6 timer istedenfor 24 timer 24. Det er ikke mer tidkrevende enn den konvensjonelle kjemiske fiksering. Fordelen er at den cellulære ultrastruktur er perfekt bevart med et minimum av gjenstander og er mye tettere til cellens opprinnelige tilstand. Anvendelse av denne teknologien vil helt sikkert være til nytte for å studere forskjellige hurtige biologiske hendelser eller for å lokalisere proteiner med høy oppløsning for celler dyrket i suspensjon og for prøver av noen få mikrometer tykkelse, for eksempel fungal hyfer 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi uttrykker vår takknemlighet til M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet og A. Devin for deres hjelp og kommentarer til manuskriptet. Vi er takknemlige for den elektroniske billedkolonnen i Bordeaux Imaging Center hvor bildene ble tatt. Dette arbeidet ble støttet av Center National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8.5 mL | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
