Summary
Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.
Abstract
İletim Elektron Mikroskobu (TEM), proteinleri lokalize etmek ve macromoleküler kompleksleri çok yüksek çözünürlükte görselleştirmek için hücre altyapısını incelemek için olağanüstü bir araçtır. Bununla birlikte, doğa devletine olabildiğince yakın olabilmek için, mükemmel örnek muhafaza edilmesi gerekiyor. Örneğin, aldehitlerle konvansiyonel elektron mikroskopisi (EM) fiksasyonu, iyi bir ultrastrüktürel koruma sağlamaz. Sabitleştiricilerin yavaş nüfuz etmesi hücrenin yeniden düzenlenmesini ve çeşitli hücre bileşenlerini kaybetmesini sağlar. Bu nedenle, klasik EM fiksasyonu yapıların anlık statikleşmesini ve korunmasını ve antijenikliğine izin vermez. Hücre içi olayları incelemek için en iyi seçim, hücreleri kendi doğal hallerinde tutan dondurma-ikame sabitleme yönteminin ardından kriyofizasyonu kullanmaktır. Hücresel altyapı bütünlüğünü koruyan yüksek basınçlı dondurma / dondurma ikamesi, en sık kullanılan yöntemdir, ancak maliyeti gerektirirekipmanı ettik. Burada, süspansiyon hücre kültürleri için dondurularak ikamesi ile devam kullanımlı kolay ve düşük maliyetli dondurarak sabitleme yöntemi sunulmuştur.
Introduction
Örnek hazırlama herhangi elektron mikroskopisi çalışmanın başarısı için kritik öneme sahiptir. Geleneksel EM sabitleme transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) 1 için doku veya hücrelerin sabitlenmesi için birincil yöntem oldu. İlk olarak, aldehit ve ozmiyum tetroksit kimyasal olarak oda sıcaklığında malzeme sabitlemek için kullanılır. Daha sonra, malzeme, organik çözücüler ile dehidre infiltre ve epoksi reçine içine gömülü olan. Bu yöntem, hücre içine fiksatif nüfuz hızına bağlıdır. Sonuç olarak, hücre içerikleri eserler ve ekstraksiyon, genellikle 2 görülmektedir.
Cryofixation açık hücresel yapıların 3 korunması için daha iyi bir alternatif, onları etkilemeden onlara tutuyor. Ince bir reçine bölümlerde TEM görüntüleri 4 yüksek kalitede cryofixation / dondurma ikame yöntem kullanılarak elde edilebilir. Bu tekniğin amacı vitrifiye bi elde etmektirBuz kristallerinin oluşumu ya da hücrelerin ultrastrüktürel zarar vermemek için yeterince küçük içeren buz kristalleri olmadan ological örnekleri. Yüksek basınçlı dondurma (HPF) ve aynı zamanda (PF) dondurma dalma denir ultra hızlı cryofixation, numune cryofix için iki yöntem bulunmaktadır. HPF anlık hücrede molekülleri immobilize eden ve geleneksel EM tespit neden olduğu zarar görmesini engeller. Donma makineleri ve otomatik ikame cihazlarının çeşitli tipleri 5 geliştirilmiştir. Dondurma makinesi ve malzemeler (sıvı azot, vb taşıyıcılar, numune) pahalıdır, ancak yüksek kaliteli bir elektron mikrograflannı 6, 7 üretmek için izin verir. PF 1950'lerin başında kullanılan ve basit ve PF prosedürü sırasında bu şirketin 8 ucuz, hazırlanan numune, buz kristallerinin en az 3 mil 5 için boyutu elde etmek için hızla dondurulur olarak literatürde tarif edilen bir tekniktir. Bu amaçla, örnekörneğin, etan, propan, ya da etan-propan karışımı gibi bir sıvı cryojen daldırıldı. 1950 yılından bu yana, PF iyileştirmeler kullanıcıların daha fazla sayıda bu teknik kullanılabilir hale getirmek için yapılmıştır. PF yaygın (görüntü küçük nesneleri için kullanılır ise yüksek basınç dondurma, şu anda daha kalın 50 5 um (disk şeklindeki numuneler için 200 um bir kalınlığa kadar) Numunelerin büyük bir çeşitlilik dondurmak için tek uygun bir şekilde <100 nm ), şekilsiz bir buz 9'un ince bir film içerisinde süspanse makromoleküler kompleksler gibi. Büyük örnekler, örneğin, ökaryotik hücreler için, PF cryofixed, ancak bu tür kılcal boru veya sandviç sistemleri 8, 10, 11 ya da numune tutucu, gerektirir.
Burada, hızlı, kolay kullanımlı ve çeşitli süspansiyon hücre kültürleri için kullanılabilir düşük maliyetli dalma donma / dondurularak ikame teknolojisi sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Formvar Izgara Film hazırlanması 1.
NOT: Kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük) kullanılarak davlumbaz altında kloroform manipülasyon gerçekleştirin. 400 göz elektron mikroskopisi bakır ızgaralar kullanın. Diğer grid türleri (diğer örgü boyutları, altın, nikel ızgaraları) ile, dondurma işleminin kalitesi kötüdür.
- kloroform içinde% 0.3 formvar 100 mL'lik bir çözelti hazırlayın. o ajitasyon olmadan gecede çözülmeye bırakın.
- 400 mesh elektron microscopycopper ızgaraları (çap 3.05 mm) bir cam şişede (yüksekliği 3 cm ve çapı 2 cm) aseton içeren (inç kare başına delik sayısı) koyun. elin dairesel bir hareketi ile bir cam şişe karıştırın. Plastik bir transfer pipet yardımıyla aseton çıkarın. Çözücü, 5 dakika için buharlaşmasına izin verin. bir filtre kağıdı üzerine onları dökülerek ızgaraları transferi ve bunları 5 dakika boyunca kurumaya bırakılır.
- Kaygan / parlak kadar tüysüz bir bez ile silerek bir 76 x 26 mm2 bir cam slayt parlatmak.
- Bir kristalleştirici (çap 15 cm, yükseklik: 7 cm kapasitesi 1200 mL) almak ve damıtılmış su ile ağzına kadar doldurun. tozu gidermek için iki kez yüzeyi üzerinde bir cam çubuk geçirerek su yüzeyini temizleyin.
- iki parmak arasındaki cam slayt tutun ve birkaç saniye formvar çözeltide daldırın. o dik 5 dakika boyunca baş aşağı beher altında kurumaya tutun.
- Şerit, kuru bir olduğunda, filmin sınırları slayt yerinden oynamasına tanımlamak için keskin bir tıraş bıçağı ile bir cam slayt kenarlarını skoru.
- Derin bir nefes alın ve üzerine ve biraz opak filmi işlemek ve görünürlüğünü artırmak için filmin altında su buharı bir katman almak için slayt üzerine ağır nefes verin.
- Hemen yaklaşık 30 ° 'lik bir açı ile sürgünün alt dokunarak kristalleştirici su yüzeyi üzerine filmin yüzer. slayt filmin serbest olsun ve kristalleştirici su yüzeyi üzerine soyulabilir. Yavaşça ile filmi çekipcımbız, gerekirse.
- Yavaşça ızgaraları uygun kalınlıkta (yaklaşık 10 nm) ve kırışıklık olmadan vardır bölgelerde su yüzeyinde yüzen film üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- Bunlar kristalleştirici su yüzeyinde yüzecek Joseph kağıt ızgaraları kaplayarak filmi al.
- tek elle Yusuf kağıdı tutarak, filmin bir ucuna Yusuf kağıdın bir ucunu dokunun. Joseph kağıt tamamen ıslak kadar bekleyin. takılıp ızgaraları ile Yusuf kağıdı çıkarın.
- son kurutma ve oda sıcaklığında kullanılmadan önce depolama için kapalı bir Petri tabağına 24 saat ızgaraları yerleştirin.
Donma-ikame Orta 2. Hazırlık
Not: Osmiyum tetroksit (OsO 4) ve uranil asetat tehlikeli kimyasal maddelerdir. Bir laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyerek çeker ocakta bunları işleyin. follkullanım için güvenlik önleminin (OsO 4) ve uranil asetat ow. OSO 4 sızmasını önlemek için O-halkası cryovials kullanın.
- ultrastrüktürel çalışmalar
- Bir cam şişeye cam OsO 4 ampul koyun.
- şişeyi sallayarak ampulü kırın.
- % 4 nihai konsantrasyon elde etmek üzere aseton uygun bir hacim,% 100'e ekleyin.
- Karıştırın ve 1.8 mL cryovials içine 1.5 ml alikotları akıtın.
- Protein ile immün
- bir cam şişeye uranil asetat 0.05 g yerleştirin.
- % 100 aseton, 50 ml ilave edilir.
- Manyetik bir karıştırıcı ile çözelti ilave edin. Çözelti berraklaştığında, bir 0.2 mikron filtre kullanılarak filtre.
- 1.8 mL cryovials içine 1.5 ml alikotları koyun.
Not: dalma dondurma işleminden önce dondurularak ikame ortamı içeren cryovials hazırlayın ve -84 ° C'de derin dondurucuda muhafaza edin. atmak cam şişeyi ters çevirinTehlikeli atık OsO 4 ampul.
Hücrelerin 3. hazırlanması
NOT: Bu adım yönteminin başarısı için kritik öneme sahiptir. tüm hücre türlerinde, hücrelerin belirtilen sayıda elde etmek için hücreleri büyür. Belirtilen zaman ve hızda belirtilen tüp içinde santrifüje.
- aşağıdaki gibi farklı hücre tipleri ile ilgili topakların uygun bir kıvam elde etmek için, hücreleri büyütmek:
- Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe için, en az ya da tam sıvı ortam 5 ml maya inoküle. 28 ° C, döndürme (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültür, 600 nm'de (OD600) 'deki optik yoğunluk ölçülür. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 maya hücrelerinin seyreltin. 1 x 10 9 maya hücreleri 7 elde etmek üzere, döndürme, 28 ° C'de inkübe hücreleri devam edin.
- Leishmania kamçıda için, yaşlılık% 7.5 FCS (inek fetus serumu) ile 5 ml AM ortamında culate parazitleri. 24 ° C'de döner (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 parazit hücreleri seyreltin. 5 x 10 8 parazit hücreleri 12 elde etmek üzere, döndürme, 24 ° C'de hücreler inkübe devam edin.
- Trypanosoma brucei için,% 10 FCS ve 30 | ig / ml higromisin ile SDM-79 ortamı, 5 mL parazitleri inoküle. 27 ° C, döndürme (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 50 ml taze seçici ortam içinde 0.2'lik bir OD600'e parazit hücreleri seyreltin. 5 x 10 8 parazit hücreleri 13 elde etmek üzere, döndürme, 27 ° C'de hücreler inkübe devam edin.
- Escherichia coli, 100 ug / ml ampisilin ile DYT ortamı 5 ml bakteri inoküle. (Dönen, 37 ° C'de gece boyunca 180 inküberpm). Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 bakteri hücreleri seyreltin. 5 x 10 10 bakteri hücreleri 14 elde etmek üzere, döndürme, 37 ° C'de inkübe hücreleri devam edin.
Not: bir gece boyunca inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit büyüme fazında olabilir. deney yoluyla belirlenen şekilde çok yavaş büyüyen hücre suşları, bir gece, veya bir hücre, daha fazla sayıda aşılanması daha inkübasyon kat daha gerektirebilir.
- Tüm hücre tipleri için 1.500 x g'de 3 dakika boyunca 50 ml'lik bir polipropilen tüpü ve santrifüj hücreleri ihtiva eden kültür ortamı aktarın.
- Süpernatantı ve ilgili hücre kültürü ortamı, 1 ml tüm hücre tipleri pelletini.
- Santrifüj 3,900 x g, 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpü içinde, tüm hücre tipleri. Tamamen süpernatant kaldırmak.
- hücreleri buz üzerinde tutun.
Not: dikkatle sıvı azot tutun. cryogloves ve googles dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın. Propan potansiyel olarak patlayıcı, yani iyi havalandırılmış bir odada veya davlumbaz altında sıvılaşma gerçekleştirin. Hiçbir açık alevler izin verilir.
- bir polistiren tepsisine sıvı azot, yaklaşık 150 mL koyun. dondurmadan önce sıvı azot içinde bir pirinç fincan (yükseklik 3.6 cm, çap 2 cm, kalınlığı 1.5 mm) yerleştirin. Sıvı azot pirinç fincan nüfuz etmesine izin vermeyin.
- kabarcıklar pirinç kâse soğuk olduğundan emin olmak için geçene kadar bekleyin.
- pirinç kabı duvarı ile temas halinde propan silindire bağlı hortumu koyun.
- Yavaşça propan silindir valfini açmak.
NOT: Bu adımda, propan pirinç fincan sıvılaşır. - propan silindir valfinin kapatılmasına ve, hızla gaz hortumu kaldırarak sıvılaşma durdurun.
- Sıvı ni polistiren kabınıpirinç fincan üstten 5 mm'ye kadar Trogen. Sıvı azot pirinç fincan nüfuz etmesine izin vermeyin.
Örnek 5. Dalma Donma
- polistiren tepsisine sıvı azot, yaklaşık 200 mL koyun. sıvı nitrojen içinde koyarak çok az pirinç bardak (yükseklik 1.5 cm çapında 2.5 cm; 1 mm kalınlık) dondurun. bir süspansiyon hücre örneği için bir fincan koyun. numuneleri karıştırmak için dikkatli olun. Bu amaçla, vb kap 2, içinde, kap 1 'de örnek 2 örnek 1 koydu.
- sıvı nitrojen içinde kendi uç saplayarak cımbız dondurun.
- 3.5 'de elde edilen pelet bir çift kenar kesme iğne dalma.
- cımbız kullanarak, bölüm 1'de hazırlanan formvar ile kaplanmış bir 400 ağ gözü, bakır mikroskopi ızgara alır.
- diseksiyon iğnesi kullanılarak, ızgara üzerinde 3.5 'de elde edilen pelet bir damla yerleştirin. Farklı damla boyutları (örneğin 2, 5 ve 10 mcL) deneyin.
- Çok hızlı bir şekilde sıvı propan genine cımbız tarafından tutulan kılavuz dalmabölümünde 4 puan ve birkaç saniye süre ile dairesel bir hareket ile kılavuz karıştırın.
- Hızla bölüm 5.1'de dondurulmuş küçük pirinç kabına cımbız ile dondurulmuş ızgara aktarın.
NOT: Her numune için, en az 3 ızgara oluşturmak. Her zaman bir bakır ızgara yapmadan önce cımbız dondurun.
6. dondur-ikame
Not: Osmiyum tetroksit potansiyel olarak uçucu, yani buhar kartuşları olan bir hava temizleyici solunum cihazı kullanın. Dalma dondurma önce sıvı nitrojen içerisinde fiksatif Donma da bir çözeltidir.
- ince yapısı çalışmaları için, bölüm 2.1'de hazırlanan dondurma-ikame ortamı içeren 1.8 mL dondurarak saklamaya uygun vialler tüpler açın. immüno çalışmaları için, bölüm 2.2'de hazırlanan dondurma-ikame ortamı içeren 1.8 mL dondurarak saklamaya uygun vialler tüpler açın. cryovials kapağını yerleştirin.
- sıvı nitrojen içinde kendi uç saplayarak cımbız dondurun.
- Hızla kapağı çıkarın ve dondurulmuş ızgaraları i aktarmakcımbız kullanarak cryovials nto.
- geri cryovials başlığını takın.
- Her numunenin her grid için tekrar edin.
- Numuneler dondurularak ikame ortamında sağlamak için el bir dairesel hareket ile cryovials tüm kapaklar kapatın ve karıştırın.
- Dondurarak ikame işlemi sırasında -84 ° C dondurucu içinde 3 gün boyunca hava geçirmez bir kutuya cryovials yerleştirin.
7. Örnek Isınma
- İnce çalışmaları
- bir polistiren tepsisine cryovials Taşıma bir -30 ° C dondurucu (ani sıcaklık artışı önlemek için). 1 saat boyunca -30 ° C'de derin dondurucuda yerleştirin.
- 2 saat boyunca -15 ° C dondurucuda cryovials yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile, daha sonra 2 saat boyunca 4 ° C 'de numuneler ve.
- Plastik bir transfer pipet yardımıyla donma ikame orta çıkarın. % 100 aseton yaklaşık 500 mcL ekleyin.
- 1.8 mi dondurarak saklamaya uygun vialler karıştırınhızla dairesel el hareketi ile cam bir şişe içinde ızgaraları (yüksekliği 3 cm, çap 2 cm) ihtiva eden aseton (1.5 mL) dökün.
- tüm ızgaraları aktardıktan emin olmak için,% 100 aseton, 1 ml ile aynı cryovial durulayın. elin dairesel bir hareketi ile cryovial ilave edin ve cam şişe içinde dondurarak saklamaya uygun vialler içeriğini dökün.
- 10 dakika% 100 aseton 3 kez 3 mL her bir cam şişe durulayın.
- Referans 15 de tarif edildiği gibi gömme ve dahil prosedürleri takip edin. aseton (% 25,% 50 ve% 75), epoksi reçinesi artan konsantrasyonları ile örnek emprenye ve jelatin kapsüller içinde% 100 epoksi reçinesi ile örnek yerleştirin.
- çalışmaları immunolabeling
- bir polistiren tepsisine 1.8 mL cryovials Taşıma -30 ° C dondurucu (ani sıcaklık artışı önlemek için).
- Bir -30 ° C dondurucu içinde 2 saat boyunca cryovials yerleştirin.
- -30 ° 'de Cı dondurucu, elin dairesel bir hareketi ile dondurarak saklamaya uygun vialler karıştırın ve hızlı bir polipropilen şişe (yükseklik 5 cm ve çapı 1.5 cm), dondurularak ikame ortamı dökün.
- Taze dondurularak ikame orta 2 ml dondurma ikame ortamı değiştirin.
- Bir -30 ° C dondurucu içinde 2 saat boyunca polipropilen şişe yerleştirin.
- % 100 aseton ve 2 mL% 100 2 mL etanol ile 1 saat boyunca üç kez 1 saat boyunca polipropilen şişe yıkayın.
- Referans 15 de tarif edildiği gibi gömme ve dahil prosedürleri takip edin. Akrilik reçinenin artan konsantrasyonlarının (% 25,% 50, ve aseton içinde% 75) ile örnek emprenye ve jelatin kapsüller içinde% 100 akrilik reçine ile örnek yerleştirin.
Numunelerin 8. Görselleştirme
- gömme sonra, bir ultramikrotom ile numune 80 mil ultra-ince bölümler yapmak. 1 dakika için oda sıcaklığında% 2 kurşun sitrat ile bölümleri Kontrasteşek = "xref"> 15.
- Bölümler 15 gözlemlemek için 80 kV veya 120 kV elektron mikroskobu kullanarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede, ultrastrüktürel (Şekil 1 ve Şekil 2) ve immunolabeling (Şekil 3) çalışmaları için, kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir dalma dondurma yöntemi sunulmuştur. Biz dondurularak değişikliği işlemleri için ve ısınma prosedürü yerine özel bir sistem kullanarak 24 saat 6'dan az saat sürer o özel ekipmanlara sahip olmak gerekli olmadığını göstermektedir.
PF / dondurularak ikame yöntemi Saccharomyces cerevisiae (Şekil 1 A ve 1 D-H), Schizosaccharomyces pombe (Şekil 1B ve hücre içi yapılarda geliştirilmiş korunması ile sonuçlanmıştır C), Leishmania kamçı (Şekil 2 A ve B), Trypanosoma brucei (Şekil 2C ve D) ve Escherichia coli (Şekil 2E). yapıları küçülmüş değildir ve sitoplazma yoğun görünür. Ayrıca, membran da, iyi koruma kanıtı olan, düzgündür. Örneğin çekirdek (Şekil 1A, B, D ve Şekil 2A-D), mitokondri (Şekil 1A -C, E ve H), ve vakuol (Şekil 1A, C, F ve H) olarak organellerin tümü, mükemmel tespit edilebilir . Çekirdekte nükleer zarf, çekirdek gözenek, iğ cisimciği kutup gövdesi ve nükleer zarfın dış zar üzerinde ribozomlar ekli oluşturan bir çift membran (Şekil 1 açıkça görebilirD ve Şekil 2B , 2D ). Mitokondriyumda, cristae adı verilen iç zar invaginasyonları ( Şekil 1E ) açıkça görülür. Vakuoller kritik organellerdir, çünkü büyük buz kristalleri onları kolayca geliştirebilir. Şekil l' de gösterildiği gibi, vakuoller buz kristali hasarı olmaksızın mükemmel şekilde korunmuştur ( Şekil 1A , C , F ve H ). Son olarak, ultrastrüktüm iyi korunurken, otofaji ( Şekil 1C , F ve H ), mitokondriyal morfoloji ( Şekil 1E ), sekresyonlu veziküller ( Şekil 1G ) ve nükleer bölünme ( Şekil 1A ) gibi farklı biyolojik olaylar gözlemlenebilir ve analiz edilebilir , Şekil 2B , aNd 2C ).
Proteinlerin spesifik antikorlarla yerinde lokalizasyonu, hücre biyolojisinde en güçlü ve popüler tekniklerden biridir. PF, protein immüno-yerelleştirmesini gerçekleştirmek için bir yöntem olarak da kullanılabilir. Bu prosedür protein antijenliğini ve yukarıda belirtildiği gibi organel kimliğini korur. Anti-ATP sintaz 7 , 15 ( Şekil 3A , 3C ve 3D ), anti-GFP ( Şekil 3B ), anti-porin 16 ( Şekil 3E) ve anti-fox2 17 ( Şekil 3B ) gibi farklı maya proteinlerini hedefleyen farklı antikorlar 3F ), daha önce test edilmiştir. Bu deneylerin Leishmania 12 gibi farklı organizmalar üzerinde yapılması da mümkündür.
Şekil 1: mayalar Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe ultrastrüktürel çalışmalar TEM görüntüleri. S. cerevisiae, (A) genel bakış. S. pombe (B) genel bakış. S. Pombe sitoplazma (C), Bölüm. (D), bir çekirdeğin yüksek büyütme. Açıkça görülebilir kristalı bir mitokondri (E) detay. Otofajinin boyunca (F) vakuoler morfolojisi. Iç salgı vezikülleri (G) ile maya tomurcuk. otofajinin işlemi sırasında vakuol ve mitokondri arasındaki yakın kontakların (H) Örnek. N, çekirdek; V, vakuol; m, mitokondri; SV, salgı Vesidöngüler; r, ribozomlar. Ölçek çubukları 200 nm =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: Leishmania amazonesis Trypanosoma brucei ve E. coli ultrastrüktürel çalışmalar TEM görüntüleri. Leishmania (A), genel bir bakış. Nükleer gözenek ve endoplazmik retikulum ile Layişmanya sitoplazma; (b). T. brucei (C) genel bakış. (D), T. brucei çekirdeğin yüksek büyütme. E.coli hücresinde (E) genel bakış. N: çekirdeği; V, vakuol; m, mitochondrion; NP, nükleer gözenek; F, kamçı; AP, kamçılı cep; K, Kinetoplast; r, ribozomlar. Ölçek çubukları 200 nm =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: monoklonal ve poliklonal antikor kullanılarak protein etiketleme örnekler. S. cerevisiae, (A) genel bakış. Anti-GFP antikorları ile amiloid-P (B) ile immün. (CD), anti-ATP sintaz antikorları ile mitokondri etiketleme örneği. Bir mitokondri dış membran (E) Porin lokalizasyonu. (F) Fox2 proteini ile immün ile mitokondride tespit edilir. Ld Flabarin (G) lokalizasyonuLayişmanya amazonesis bir flagellum'un uzunlamasına kesit. Tüm antikorların 10 nm altın poliklonal antikorlar kullanılarak tespit edilir. N, çekirdek; V, vakuol; m, mitokondri. Ölçek çubukları 200 nm =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TEM organeller, hücreler ve dokuların ultrastrüktürel gözlem için güçlü bir yöntemdir. Cryofixation / dondurularak ikame anda hem ince yapısı ve protein antijenisite korunması için en iyi yöntemdir. Kimyasal fiksatifler nüfuz ve ultrastrüktürün 2 tam istikrarlı önce yapısal yeniden düzenlemeleri sağlayan çok yavaş bir şekilde hareket ederler. Tersine, cryofixation / dondurularak ikamesi anında hücresel yapılar 4 dengeler. Bununla birlikte, cryofixation / dondurma-ikame teknikleri ve böylece bunların uygulama aralığı engellerden ve zorluklar bir dizi içerir. Bu örnek, donma eserler, teknik, maliyet ve ekipman gerçekleşmesini ilgilidir. Yüksek basınçlı dondurma / dondurularak ikame teknik, hücresel ayrıntıları 6 korunması, 7 yüksek derecede sağlamıştır. Buna karşılık, PF zaten atıl için kullanılırAmorf buz filmlerinde asılı küçük nesneler 9 . Burada, ultrastrüktürel ve immünolojik işaretleme çalışmaları için PF / dondurma değiştirme yöntemi, yüksek basınçlı dondurucu görüntülerle karşılaştırılabilen mayalar, parazitler ve bakteri ultrastrüktürünün yüksek kaliteli görüntülerini sağlar.
Fiksasyon kalitesi soğutma hızlarına bağlıdır 18 . Yüksek soğutma hızlarında su vitröz haldedir ve elektron mikroskopisi seviyesinde görünür kristal yapı göstermez. Vitrifikasyon sadece çok ince bir yüzeysel katman (genel olarak 200 μm) içinde gerçekleşir ve bu nedenle iyi bir kalınlık dondurma, numunenin yüzeyinden iç katmanlara 4 kademeli olarak azalacaktır. Bitki hücrelerinde, mumlu kaplama veya gazla doldurulmuş alanlar soğutma hızlarını yavaşlatabilir. PF ile, şaşırtıcı bir şekilde donma performansında hiçbir azalma gözlemlenmemiştir. Deneylerin tümünde iyi dondurulmuş hücrelerin yüzdesi g 50% 'den reater. Bu yüzde daha çok% 90 ile% 50 arasında değişir ve değişik parametrelere (kültür ortamı, hücrelerin fizyolojik durumu, dış sıcaklık ve nem seviyesi) bağlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, buz kristallerinin oluşumu, hücre yapısını bozar ve buz kristallerinin, vakuol, özellikle görebilir. PF / dondurma ikame işleminde, özel bir dikkat donma sıcaklığına dikkat edilmelidir. dondurularak ikame aşaması -82 ° C'nin üzerinde gerçekleştirilemez, aksi takdirde, vitröz suyu kristalin su içine transforme edilir. Buz kristali hasar oluşumunu önlemek için, dondurarak saklama koruyucusu anda kullanılır, ancak bu hücrelerin 19 ultra yapısında değişikliklere yol açar. Maya, bakteri, parazit ve kültür ortamları Kriyokoruyucu madde, bir bileşen içerebilir. Bu bağlamda, gerçek hücresel duruma mümkün olduğunca yakın olabilmek için ek sirokoruyucu kullanmamaya karar verildi.
ve_content "> PF / dondurma ikame başarısı yöntem geliştirilmesi aşamasında çok kritik adım bağlıdır. İlk olarak, kritik bir noktaya peletler, uygun kıvam elde etmektir. uygulanan santrifüj işlemi sonrasında elde edilen topak kadar kompakt haddelenecek olmalıdır pelet çok kompakt ise, dondurularak ikame çözüm damla nüfuz edemez ve pelet yeterince kompakt değilse ince yapı, Tersine. iyi korunmuş olmayacaktır elektron mikroskobu ızgara üzerinde., artık kültür ortamı gelişebilir buz kristalleri ve hücre ultra yapısını bozar. farklı hücre tiplerinden topakların uygun bir kıvam elde etmek için, tüm (yukarıya bakınız) protokolde belirtilen hücrelerin ve santrifüj parametre belirtilen sayıda elde etmek için kültür koşullarını da uyulması gerekmektedir hücre tipi. Bununla birlikte, bir bakır ızgara üzerine koymak malzeme miktarı kritik öneme sahip değildir. Farklı damlacık boyutları test edilebilir. İkinci olarak, ızgara tipi thabir destek önemlidir t kullanılır. Farklı örgü aralığına sahip çeşitli altın, nikel ve bakır ızgaralar test edilmiştir. En iyi sonuçlar, ince çubuklarla 400 mesh bakır ızgara ile elde edilmiştir. Üçüncü olarak, soğutma aşamasında getirmedi, pirinç kap propan sıvılaştırılması için tercih edilir. Bakır bir kap içinde sıvı propan, bu nedenle, deneme zorlaştırmaktadır, dondurma eğilimi ve. Son olarak, manipülatör yanlışlıkla örnek ısınma önlemek için hızlı ve soğuk koşullarda çalışmalıdır. Eğer olursa numune atılmalıdır. Örneğin, örnek ısınmayı önlemek için, cımbız kullanmadan önce önceden soğutulmuş olması ve dondurularak ikame orta de öncesinde işlem öncesi hazırlanmalıdır. Soğutulmuş cımbız da dalma donma becauseif dalma dondurma işlemi sırasında kullanılmalıdır cımbız donmadan gerçekleştirilmektedir, cımbız (nedeniyle sıcak / soğuk değişimi) propan daldırılıp gibi duman formlarının bir çok. Bu kaçınılmaz soğutma oranları üzerinde bir etkisi vardır. sampl ile Testleridonmamış cımbız ile dondurulmuş es düzgün dondurulacak olmadığı görülmektedir.Ayrıca, bu tür dondurularak ikame ortamında O S, O 4 ve uranil asetat gibi zararlı kimyasalların kullanımı çözeltilerinin hazırlanması esnasında gerektirir ve dondurularak ikame işlemi, yeterli PPE ile davlumbaz altında çalışmak. Buharların Oso 4 sızmasını ve inhalasyon önlemek için, cryovials borular dondurularak ikame işlemi sırasında sızdırmaz kalmasını sağlamak için sabit bir O-ring olmalıdır. Dondurularak ikame ortamının hazırlanması sırasında osmiyum buharı gereksiz maruz kalınmasını önlemek için, OsO 4 ampul, bir cam şişe içinde kırılabilir. dahil sonra reçine bloğun cam kırıkları varlığı asetonlar Durulama sayısı ve gömme aşamaları sırasında ucu ince transferi pipetler kullanılarak önlenebilir. binoküler döngü altında dahil aşamasını ve yarı ince kesitler gerçekleşmesini gerçekleştirilmesi de bir cam parçaları vardır doğrulamak için izin verir.Deneyler (özellikle donma ikame işleminin birinci aşamasında) bir duman başlığı altına yapılan edilemediğinde, buhar kartuşları ile bir hava temizleyici solunum cihazı kullanın. Sıvı azot ya da dondurma adımları sırasında soğuk koşullarda çalışırken manipülatör da dikkatli olmak gerekir. eldiven ve gözlük kullanılması tavsiye edilir. Sıvılaşma iyi havalandırılan bir odada ya da bir davlumbaz altında gerçekleştirilmelidir ve bir açık alev izin Bundan başka, propan, potansiyel olarak patlayıcıdır.
Çeşitli makaleler, örneğin, beyin dokusu, sarmaşık yaprakları, ya da A. thaliana ve N. benthamiana kök ucu olarak numunelerin çok çeşitli, ultrastrüktürü korunması kimyasal sabitleme 20, 21 oranla HPF tekniği ile geliştirilir, gösterdi. PF ile deneyler süspansiyon hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Bu nedenle, la üzerindeki bu tekniğin başarısının hiçbir belirti yokturrger dokular gibi numune. Diğer deneyler bu noktayı ele yapılmıştır gerekir. Bununla birlikte, bu yöntem başarılı bir şekilde izole edilen hücreler değil, misel şeklinde 22 ait değildir ipliksi mantar Podospora anserina ile test edilmiştir.
Bu makalede sunulan yöntem kimyasal sabitleme veya HPF mevcut yöntemlere kıyasla önemli bir gelişmeyi temsil eder. Örneğin, PF HPF 23 aksine pahalı cihazlar veya sarf gerektirmez. HPF tekniği, sıvı nitrojenin büyük bir miktar (deney başına yaklaşık 80 L) kullandığı için bakımı da dikkate alınmalıdır. Önerilen teknik ile bir büyük avantajı hiç önemli ekipman 23 gerekli olduğudur. Böylece, bir deneyin maliyeti çok daha düşük (yaklaşık yüz kat daha ucuz) 'dir. Diğer bir avantajı tekniği kullanımı kolaydır, çünkü belirli uzmanlık gerekli olmasıdır. Ayrıca, örnek işleme of PF / dondurularak ikame nedeniyle 24 saat 24 yerine daha az 6 saat sürer ısınma işlemine HPF / dondurularak ikame çok daha kısadır. Bu geleneksel kimyasal sabitleme daha tüketen değil daha zamanıdır. avantaj hücresel ultrastrüktürü mükemmel asgari eserler ile korunmuş ve hücrelerin orijinal haline çok daha yakın olduğunu olmasıdır. Bu teknolojinin uygulanması kesinlikle böyle hyphe'nin 22 gibi farklı hızlı biyolojik olayları incelemek için ya süspansiyon yetiştirilen hücreler için ve birkaç mikrometre kalınlığında, numuneleri için yüksek çözünürlükte proteinleri yerelleştirilmesine yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Biz el yazması üzerine yardım ve yorumlar için M. Bouchecareilh E. Tétaud S. Duvezin-CAUBET, ve A. Devin şükranlarımızı sunuyoruz. Biz görüntüleri alındı Bordo Görüntüleme Merkezi'nin elektronik görüntüleme kutbuna müteşekkiriz. Bu çalışma Centre National de la Recherche Scientifique tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8.5 mL | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
