Abstract
Stikstofoxide (NO) is een van de belangrijkste regulator moleculen in vasculaire homeostase en ook een neurotransmitter. Enzymatisch geproduceerde NO wordt geoxideerd tot nitriet en nitraat door interacties met diverse oxy-heem eiwitten en andere nog niet bekende paden. Het omgekeerde proces, was reductie van nitriet en nitraat in NO ontdekt in zoogdieren in het laatste decennium en wordt steeds meer aandacht als een van de mogelijke wegen ofwel voorkomen of verlichten van een hele reeks cardiovasculaire, metabole en spierziekten waarvan men vermoedt dat worden geassocieerd met een verminderde niveaus van NO. Het is daarom belangrijk om de hoeveelheid NO en zijn metabolieten schatten verschillende lichaamscompartimenten - bloed, lichaamsvloeistoffen en de verschillende weefsels. Bloed, vanwege de goede bereikbaarheid, is de geprefereerde compartiment wordt gebruikt voor de schatting van NO metabolieten. Vanwege de korte levensduur (paar milliseconden) en lage sub-nanomolaire concentratie, directe betrouwbare metingen van het bloed NO <em> In vivo huidige grote technische problemen. Aldus NO beschikbaarheid wordt meestal geschat op basis van de hoeveelheid van de oxidatieproducten, nitriet en nitraat. Deze twee metabolieten worden altijd apart gemeten. Er zijn verschillende goed gevestigde werkwijzen om de concentraties in biologische vloeistoffen en weefsels te bepalen. Hier presenteren we een protocol voor chemoluminescentiemethode (CL), gebaseerd op spectrofotometrische detectie van NO na nitriet of nitraat door tri-jodide of vanadium (III) chloride-oplossing, respectievelijk. De gevoeligheid voor nitriet en nitraat opsporing is in lage nanomolaire bereik, die CL stelt als de meest gevoelige methode die momenteel beschikbaar zijn voor veranderingen in NO metabole routes te bepalen. We in detail uitleggen hoe je monsters van biologische vloeistoffen en weefsels te bereiden met het oog op de originele hoeveelheid nitriet en nitraat aanwezig op het moment van de collectie en hoe ze hun respectieve bedragen in monsters te bepalen behouden. Beperkingen van de CL-techniek zijn ook explained.
Introduction
Nitriet, en in mindere breiden nitraat in bloed tijdens algemene toestand van lichaam NO metabolisme. Nitriet concentraties in het bloed en de meeste organen en weefsels zijn alleen in hoge nanomolaire of lage micromolaire bereik, nitraat gewoonlijk aanwezig in veel hogere hoeveelheden - in het micromolaire bereik. Veranderingen in nitrietniveaus door ziekteprogressie of veranderingen in voedingsgewoonten zijn vrij klein en alleen kan worden gemeten met een zeer gevoelige methode. Vanwege hun verschillende niveaus en metabolische processen, afzonderlijke bepaling van nitriet en nitraat niveau essentieel. Zogenaamde "NOx bepaling" wanneer nitriet en nitraat elkaar gemeten heeft weinig waarde.
Verschillende werkwijzen voor het kwantificeren nitriet in diverse biologische monsters ontwikkeld - de meest voorkomende is de oudste, gebaseerd op het Griess reactie die oorspronkelijk in 1879 had beschreven Zelfs met moderne WIJZIGIns, de gevoeligheid grenswaarde voor nitriet haalbaar door Griess 'methode is in de lage micromolaire bereik. Chemiluminescentie (CL), in combinatie met tri-jodide reducerende oplossing, wordt momenteel beschouwd als de meest gevoelige methode, waardoor kwantificatie in het lage nanomolaire bereik van nitrietconcentraties 1-8,10,11. Dezelfde methode CL combinatie met vanadium (III) chloride reducerende oplossing, kan worden gebruikt voor gevoelige metingen van nitraat, nauwkeurig in het nanomolaire gebied 9.
CL detecteert vrij gas NO. Daarom nitriet, nitraat, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosoamines (R-NNO) of metaal-verbindingen NO (later in manuscript genoemd "R- (X) -NO"), worden omgezet in vrij NO gas teneinde de oorspronkelijke hoeveelheid gekwantificeerd via CL. Conversie naar NO wordt bereikt met verschillende reducerende oplossingen, afhankelijk van de aard van de NO metaboliet. Na de conversie wordt vrij NO gas verwijderd uit het reactievat door een dragergas (He, N2 of Ar) in de reactiekamer van CL analysator waarin ozon (O 3) wordt gecombineerd met NO om stikstofdioxide (NO 2) in de geactiveerde toestand. Bij terugkeer naar de grondtoestand, NO 2 * uitzendt in infrarode gebied en uitgezonden foton wordt gedetecteerd door fotomultiplicator (PMT) van CL instrument. De intensiteit van het uitgezonden licht is rechtevenredig met NO-concentratie reactiekamer, waarop de berekening van de concentratie van de oorspronkelijke soorten met de juiste calibratie curves maakt.
In ons protocol, we eerst het huidige CL op basis van de bepaling van nitriet en nitraat in de meest gebruikte klinische instellingen - in het bloed en plasma, en dan bespreken we hoe deze ionen in de weefselmonsters te bepalen. Ook nader uiteen hoe de oorspronkelijke fysiologische nitrietconcentratie in nitrietvrije reactieve omgevingen, zoals bloed en de compartimenten, plasma en rode bloedcellen te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen waaronder het gebruik van dieren werden goedgekeurd voor gebruik door NIDDK Animal Care en gebruik Comite en menselijk bloed werd verkregen van NIH Bloedbank van gezonde donoren.
1. Monstervoorbereiding
- Bereiding van nitriet behoud oplossing
- Bereid een oplossing die 890 mM kalium ferricyanide (K3Fe (CN) 6) en 118 mM NEM (N-ethylmaleïmide) in gedestilleerd water. Ontbinden goed totdat duidelijk is geel met geen kristallen aanwezig. Add NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) in een 1: 9 verhouding (v / v NP-40 / oplossing). Meng voorzichtig om schuimen en opslag voor ongeveer een week voorkomen bij 4 ° C).
- Verzameling en voorbereiding van bloedmonsters
- Verzamel bloed gebruikmakend van tenminste een 20 G naald hemolyse met heparine voorkomen coagulatie (5 U / ml) te voorkomen. Voor het hele bloedmonster, meng bloed met nitriet behoud oplossing onmiddellijk in een 1: 4 verhouding (v/ V oplossing / bloed).
- Voor plasma en rode bloedcellen monsters gecentrifugeerd bloed verzameld gedurende 5 minuten bij 4000 xg bij 4 ° C om rode bloedcellen (RBC) en plasma te scheiden. Neem de bovenstaande vloeistof (plasma) en meng dit met behoud nitriet oplossing zoals hierboven beschreven voor de bepaling van nitriet in het plasma.
- Verwijder voorzichtig resterende plasma en buffy coat uit het monster en pipet RBC monster uit de bodem van de buis verontreinigende andere soorten bloedcellen met een cut-off pipetpunt vermijden en deze hoeveelheid in een buisje met nitriet behoud oplossing in dezelfde verhouding als hierboven.
- Meng elk monster (plasma en RBC) met koude methanol in een verhouding 1: 1 of 1: 2 (v / v sample / methanol) en centrifugeer ze bij 13.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten om eiwitten neer te slaan. Neem de bovenstaande vloeistof en gebruiken voor het meten nitriet of bevriezen bereide monsters, indien nodig, op droog ijs en bewaar bij -80 ° C.
Opmerking: Nitriet snel reacts met oxyhemoglobin (OxyHb) in bloedvormende nitraat. Aangezien OxyHb is altijd aanwezig in grote overmaat nitriet via deze reactie leidt tot nagenoeg volledige vernietiging van natuurlijk bloed nitriet met een tijdsbestek van ~ 10 min. Om de meeste endogene bloed nitriet te behouden, wordt nitriet behoud oplossing toegevoegd aan de hele bloedmonsters onmiddellijk na de bloedafname. De oplossing wordt snel lyseren van rode bloedcellen en oxideren OxyHb in methemoglobine (MetHb), een inactieve vorm van hemoglobine die niet chemisch reageert met nitriet.
- Bereiding van monsters van andere typen lichaamsvloeistof
- Na de monstername in de juiste container, meng goed met nitriet behoud oplossing, deproteinate en meet onmiddellijk of invriezen en bewaren bij -80 ° C.
- Verzameling en voorbereiding van weefselmonsters
- Verzamel weefsels van dieren geperfundeerd met gehepariniseerde zoutoplossing (10 U heparin / ml). Accijns ongeveer 1 g gewenst weefsel en homogeniseer ofwel middels een handmatige homogeniseerinrichting of een geautomatiseerd homogenisator.
- Voeg bekende hoeveelheid nitriet behoud oplossing nodig om vloeiende homogenaat bereiken.
- Zodra wordt gehomogeniseerd, precipiteren eiwitten met koud methanol (1: 1 of 1: 2 verhouding v / v sample / methanol) zoals hierboven beschreven, centrifugeer monsters bij 13.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Verzamel supernatant en meet nitriet niveaus. Indien nodig, te bevriezen monsters in elk stadium van de voorbereiding op droog ijs en bewaar bij -80 ° C.
2. Bereiding reduceerhulzen Solutions
- Tri-jodide (I 3) vermindering oplossing voor nitriet en R- (X) -NO determinatie 1,3,4
- Bereid een oplossing van 301 mM KI samen met 138 mm I 2-oplossing in water. Meng met ijsazijn in 2: 7 verhouding (v / v oplossing / zuur) op een magnetische roerder gedurende ~ 30 minuten totdat allekristallen worden opgelost. Bij voorkeur te houden in een donkere fles, zoals jodide is lichtgevoelig, en gebruik binnen een week van voorbereiding.
Opmerking: Deze oplossing zal verminderen nitriet in NO, en het zal ook los NO van R-SNO, R-NNO en Fe-NO functionele groepen (R- (X) -NO), maar nitraat zal niet worden aangetast. Het signaal van de hierboven NO gebaseerde functionele groepen kunnen van de ware nitriet signaal gescheiden worden door behandeling van de helft van het monster met aangezuurde sulfanilamide (AS) en het vergelijken van AS-behandelde en onbehandelde signaal. AS irreversibel vormt diazonium kation met nitriet en dit complex kan dan worden verminderd met I 3 oplossing. Voor AS behandeling, voor te bereiden 290 mm oplossing van sulfanilamide in 1 M HCl en voeg deze toe aan een portie van het monster in een verhouding van 1: 9 (v / v AS / monster). Meet de CL signaal AS-behandelde en onbehandelde delen van het monster. Bereken het ware nitriet signaal als verschil AS-behandelde en onbehandelde deel van het monster. Nitriet kan ook worden gemeten met een selectieve nitrite reducerende oplossing van ascorbinezuur / azijnzuur mengsel als beschreven in deel 2.2. Vanwege de gewoonlijk kleine hoeveelheid R- (X) -NO aanwezige soort metingen met AS-onbehandelde monsters in de meeste gevallen een zeer goede benadering van de totale nitriet.
- Bereid een oplossing van 301 mM KI samen met 138 mm I 2-oplossing in water. Meng met ijsazijn in 2: 7 verhouding (v / v oplossing / zuur) op een magnetische roerder gedurende ~ 30 minuten totdat allekristallen worden opgelost. Bij voorkeur te houden in een donkere fles, zoals jodide is lichtgevoelig, en gebruik binnen een week van voorbereiding.
- Ascorbinezuur / azijnzuur (4A) oplossing voor selectieve bepaling van nitriet 2
- Bereid 500 mM ascorbinezuur in water. Meng deze oplossing met ijsazijn in een verhouding 1: 7 (v / v, ascorbinezuur / azijnzuur) om het reactiemengsel te bereiden.
Opmerking: Deze oplossing is specifiek voor nitriet, niet NO vrijgeven van een R- (X) -NO species of nitraat. Echter, moet de oplossing van ascorbinezuur en azijnzuur vers bereid elke dag vóór de meting, ascorbinezuur gemakkelijk oxideert in oplossing.
Voltooiing van nitriet reductie hangt af van de concentratie ascorbinezuur; en ten minste 50 mM ascorbinezuur wordt aanbevolen voor volledige rafvoer van plasma nitriet. Het is echter aanbeveling om enkele proef experimenten met verschillende concentraties ascorbinezuur en nitriet normen op het verwachte nitriet concentratiebereik vóór eindmonster metingen. Houd in gedachten dat ascorbinezuur enigszins put tijdens de metingen, zijn zo frequente wijzigingen van het reactiemengsel in het glas reactiekamer aanbevolen.
- Bereid 500 mM ascorbinezuur in water. Meng deze oplossing met ijsazijn in een verhouding 1: 7 (v / v, ascorbinezuur / azijnzuur) om het reactiemengsel te bereiden.
- Vanadium (III) chloride verminderen oplossing voor nitraat bepaling 9
- Bereid 51 mM oplossing van VCL 3 in 1 M HCl. Filter oplossing door 200 um filter en op te slaan in een donkere fles, te gebruiken binnen twee weken.
Opmerking: Deze oplossing zal nitraat, nitriet en alle R- (X) -NO soorten te verminderen, dus als vergelijkbare hoeveelheden van nitriet of andere R- (X) -NO aanwezige soorten samen met nitraat zijn, de uiteindelijke nitraatgehalte moet worden berekend als het verschil tussen de signalen CL verkrijgbaar VCL 3 en I3 reducerende oplossingen.
- Bereid 51 mM oplossing van VCL 3 in 1 M HCl. Filter oplossing door 200 um filter en op te slaan in een donkere fles, te gebruiken binnen twee weken.
3. chemiluminescentie (CL) Analyzer Setup en Metingen
- Standaard oplossing
- Bereid 1 pM oplossing van natriumnitriet (NaNO 2). Dezelfde oplossing kan gebruikt worden voor nitriet en nitraat bepalingen.
- Het gebruik van NO-analysator
Let op: er zijn er twee in de handel verkrijgbare NO analyzers die gevoelig genoeg is voor biologisch onderzoek doeleinden - Sievers NOA en Ecophysics CLD 88Y. Beiden werken volgens hetzelfde principe; Het belangrijkste verschil is dat CLD 88Y gebruikt zuurstof uit de kamerlucht ozon maken (O 3), terwijl NOA is een externe zuurstoftank hiervoor. De onderstaande procedure beschrijft de set-up voor de Sievers NOA.- instrument setup
- Voer de eerste opzet van de NO-analysator volgens de aanbevelingen van de fabrikantzoals te zien in Figuur 1.
- Open O 2 tank is aangesloten op het instrument. Kies "analyse" en "enter" in het hoofdmenu op het voorpaneel. Op het volgende scherm kies "start" en druk op "enter". Sluit het zuur trap (bevattende 1 M NaOH) aan het instrument zoals getoond in figuur 1.
- Wacht tot fotomultiplicator afgekoeld om de temperatuur beneden -12 ° C en de reactiekamer wordt geëvacueerd tot 6 Torr. Het duurt ongeveer 30 minuten om een stabiele vlakke basislijn te bereiken. De basislijn moet stabiliseren zoals 1-2 mV, de nominale waarde minder belangrijk is dan de stabiliteit.
Opmerking: Als nitraat gemeten, zet het koelwaterbad (ingesteld op 4 ° C, welke als koelval dient voor zuur en waterdamp) en verwarming waterbad (de belangrijkste reactiekamer, 95 ° C). De snelheid van de reductie van nitraat in NO in VCL 3 oplossing temperatuurafhankelijk is, en het is heel traag bij kamertemperatuur tempetuur, zodat aanzienlijke toename van de temperatuur nodig om de reactie te observeren. - Open Hij tank en sluit de glazen reactiekamer zuur val zoals te zien op Figuur 1. Vul de reactiekamer met de juiste oplossing te verminderen, vermindering van de borrelende om minimum en sluit reactiekamer om het zuur te houden. Met behulp van trial and error, stel de hij borrelen tarief voor het instrument aanzuigsnelheid (meestal ~ 200 ml / min voor Siever's NOA) overeenkomen.
- Schakel de computer die het instrument en start Labview gebaseerde Liquid software. Voor het inschakelen van de communicatie tussen het instrument en de acquisitie software, druk op "enter" als in "menu data" tot het scherm leest "output enabled" en druk op "duidelijk" om terug te keren naar data-scherm.
- Wacht tot een stabiele basislijn spoor op het scherm en start het injecteren van monsters en standaarden in nitriet verminderen oplossing door het septum. Altijd wachten om een stabiele basislijn aft te bereikenre van de piek. Dit kan tot 2 min. De Liquid software heeft een optie om "teken" tijden van de injectie en annoteren de injectie en het zal deze opmerkingen exporteren naar een apart bestand (filename.info) als een nuttige aanvulling op het gegevensbestand (filename.data).
- Zodra monsters en standaarden worden gemeten, kiest u "stop" optie in het Liquid software menu - zullen deze gegevens van een tijdelijk bestand te schrijven in een permanente file bekend als "filename.data". Door op "afbreken" optie zal de meting te beëindigen zonder het schrijven van verkregen gegevens in een permanente file.
- Om experiment beëindigen, verwijdert u de machine uit het reactievat door het uitschakelen van de kraan op de top van reactievat en koppel de slang tussen zuur val en reactievat (zie figuur 1). Nu stoppen met NOA analyzer - druk op "duidelijk", ga naar "analyseren", zet de machine op "standby" en "bevestigen" stand-by. Bij regelmatig, de gebruikteinstrument kan worden achtergelaten in de standby-modus voor enkele weken. Schakel de toevoer van zuurstof. Spoel vervolgens de reducerende oplossing uit de reactiekamer, ontkoppel en sluit Hij tank uit de glazen reactievat en klaar bent met het reinigen van reactievat.
- Normen en sample-injecties
- Injecteer 50 pi 1 uM nitriet oplossing in reactiemengsel onder toepassing van een goed gewassen Hamilton spuit. Wacht minstens 1-2 min tussen de injecties tot goede scheiding van pieken te bereiken. Herhaal de injectie van 50 ul duplicaten aan elk data punt te krijgen. Was de spuit met gedemineraliseerd water na elke injectie.
- Om de volledige set van gegevens voor standaard curve te verwerven, verder met dubbele injecties van 100, 150 pi (extra 200 ul kan nodig zijn als hoge concentraties nitriet en nitraat wordt verwacht) van 1 uM nitriet oplossing. In elk geval, zorg om te wachten totdat het signaal weer zakt naar de basislijn en vervolgens verwerven 1-2 min van baseline tot goede scheiding van pieken te bereiken.
Noot: Nitriet normen kan worden gemeten op elk moment tijdens experimenten. Echter de voorkeur om de standaardkromme voor meetgegevens te verkrijgen, omdat het ook dient als een onafhankelijke controle instrument functionaliteit.
Wanneer de gegevens worden verzameld, hoeveelheid monster geïnjecteerd moet leiden tot een goed uitgesproken pieken. Toch moet er rekening mee worden gehouden dat de fotomultiplicator is lineair slechts tot ~ 800 mV, zodat geen van de piek moet hoger zijn dan ~ 700 mV zijn. Dit kan worden bereikt door het verminderen van de hoeveelheid geïnjecteerde monster of verdunnen van het monster met gedeïoniseerd water. Elk punt moet worden gemeten ten minste in tweevoud.
- instrument setup
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont representatieve resultaten vanuit normen en vijf verschillende monsters. Zoals getoond in deze figuur fotomultiplicator voltage onmiddellijk optreedt na nitriet-houdende oplossing (standaards of monsters) wordt geïnjecteerd in reducerende oplossing (injecties geraadpleegd worden door rode pijlen onder de curve) en keert terug naar de basislijn waarde als alle nitriet in het geïnjecteerde oplossing werd verminderd. Het is ook duidelijk uit deze figuur die nauwkeurige volume metingen die nodig zijn om zeer reproduceerbare gegevens te verkrijgen zijn. We raden het gebruik van precisie-Hamilton spuiten injectie volumes te meten. Het verlies van het verminderen van de capaciteit van I 3 (of ascorbinezuur of VCL 3) oplossing is een andere veel voorkomende bron van fouten. Als algemene regel bij basislijn breedte van pieken gaat aanzienlijk uitbreiden, waardoor oplossing reactiekamer moet worden veranderd. De breedte van de piek is afhankelijk van de gasstroom in de NOEen reactiekamer (gemarkeerd als RC in Figuur 1), en iets verschilt van experimentele klaar om een ander. Wij beschouwen de normale breedte tot ongeveer 1 min nitriet metingen en tot 2 minuten op nitraat metingen.
Om het signaal van de fotomultiplicator met hoeveelheid NO gedetecteerde betreffen, is een standaardkromme geconstrueerd als een grafiek van het oppervlak van de piek en de hoeveelheid nitriet (in pmol) geïnjecteerd zoals gezien in figuur 3A. Om het oppervlak van de piek te meten elke geschikte software kan worden gebruikt, zoals Origin, Excel of willen. De helling van de curve, K (rood gemarkeerd in figuur 3B), geeft de hoeveelheid pmol van NO veroorzaakt toename van 1 mV of fotomultiplicator (PM) signaal. Het voordeel van de helling van de curve, plaats oppervlak onder de piek die verband houdt met vaste hoeveelheid NO, wordt grotere precisie. De standaardcurve is opgebouwd uit ten minste 3 verschillendepunten, elk van hen wordt gemeten in tweevoud en als er enkele resterende nitriet of nitraat in het water gebruikt om de standaardoplossing voor te bereiden, met behulp van K elimineert de noodzaak van correcties op deze resterende bedragen. Ook na onze eerste tests van NOA instrument voor haar PM-lineariteit, hebben we vastgesteld dat lineaire respons optreedt tot 700-800 mV. Daarom onze standaard kromme is geldig voor alle signalen van de monsters, met dit PM bereik. De lineariteit bereik is afhankelijk van PM en kunnen veranderen met de tijd. Het moet worden vastgesteld vóór het instrument voor het eerst wordt gebruikt en getest als PM leeftijden om de paar jaar.
De gegevens van de monsters worden verwerkt op dezelfde wijze als de gegevens verzameld voor standaardkromme: Ten eerste, het oppervlak van de piek wordt bepaald. Dan is dit gebied gedeeld door de helling K van de standaardcurve, waardoor het aantal pmol NO afkomstig uit de hoeveelheid ingespoten monster.
figuur 3B. De gegevens worden vervolgens uitgezet vergelijkbaar met het voorbeeld in figuur 3B. In de in figuur 3B voorbeeld geplot wij gevonden uit 5 getoond in paneel A. afzonderlijke monsters Hier plotten we gemiddelden van 2 injecties en geven de SD om de reproduceerbaarheid van de afzonderlijke puntmetingen tonen.
Voor monsters in de figuur 3, S1, S2 en S4 zijn rattenbloed en S3 en S5 rattenlever. Figuur 3C toont de eindresultaten plot met SD uitgedrukt in nM (bloed, n = 3) of pmol / mg weefsel (voor lever, n = 2).
Figuur 1: Setup van Sievers NOA chemiluminescentie Instrument. Reactievat wordt gevuld met I 3 (ascorbinezuur / azijnzuur of VCL 3) oplossing Hij draaggas zachtjes borrelen door. Monster wordt geïnjecteerd met behulp van Hamilton spuit door septum in I 3 oplossing waarbij NO-gerelateerde componenten worden gereduceerd tot NO gas en droeg in NO-analysator. Koude val, NaOH gevulde val, en het filter beschermen analyzer tegen vocht en zure dampen. In reactiekamer (RC) NO gas gecombineerd met O 3 (gegenereerd in O generator 3) uit zuurstof uit O 2 tank. Chemiluminescentie signaal van NO * 2 wordt gedetecteerd door fotomultiplicatorbuis (PMT) en verder versterkt en verwerkt. Data-acquisitie en analyse worden uitgevoerd op de pc uitgevoerd. Vacuum pompaangemaakt lage druk in de reactiekamer (RC) en evacueert giftige NO 2 gas na chemiluminescentie meting door middel van koolfilter (CF). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve plot van NO pieken Generated door CL. Deze grafiek toont het signaal fotomultiplicator (PMT) als functie van de tijd. Pieken gevolg van injecties met verschillende hoeveelheden 1 uM nitriet oplossing (normen) en 100 pl monsters (S1 - S5) geïnjecteerd in duplo en triplo (50 pl standaardoplossing nitriet). Rode pijlen onder de kromme geven tijden van injecties. Klik hier om een la te bekijkenrger versie van deze figuur.
Figuur 3: Standard Curve (A) en representatieve resultaten van Rat Blood and Liver (B), Final Results Plot (C). Standaardcurve (paneel A) werd verkregen door injectie van 50, 100 en 150 gl 1 uM nitriet-oplossing in water, de oppervlaktemeetinstrument onder pieken. De helling, K (rood getal) geeft nmol NO vereist een 1mV toename fotomultiplicator spanning. Originele pieken voor standaardkromme zijn in figuur 2 en worden aangeduid als 50, 100 en 150 pi. Figuur 2 toont ook de originele injecties voor onze monsters - S1, S2 en S4 (donkergrijs) van de rat bloed, S3 en S5 van de rat leverweefsel, alle geïnjecteerd in tweevoud. Gebied onder deze pieken werd gemeten en tenslotte correcties voor verdunningen werden gemaakt zoals beschreven in onderdeel 3.2.1., ResULT getoond in paneel B voor afzonderlijke monsters werden berekend als hoeveelheid nitriet in pmol / g lever of in nM bloed. Om de reproduceerbaarheid van de chemoluminescentiemethode waarderen, we uitgezet de gemiddelden en standaarddeviaties voor elk individueel monster. Paneel C toont de eindproducten nitriet en nitraat in rattenbloed en lever uitgezet als gemiddelde van drie afzonderlijke monsters van bloed en twee voor lever met standaardafwijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Monsters van alle oplossingen (inclusief het water) wordt gebruikt voor te bereiden, te verdunnen of op andere wijze te behandelen originele monsters moeten worden opgeslagen en gecontroleerd op mogelijke nitriet of (vaker) de verontreiniging door nitraten. We vonden dat de meeste vervuiling afkomstig is van water en vele chemicaliën die worden gebruikt bij de behandeling van het monster (ferricyanide in het bijzonder) aanzienlijk deel van de verontreiniging door nitraten bevatten ook in een aantal kavels die interfereert met de endogene nitraat vastberadenheid. Wij controleren daarom al onze chemicaliën voor nitriet en nitraat verontreinigingen voordat we ze gebruiken in de reguliere experiment.
Sinds monsters meerdere keren tijdens de behandelingen kunnen worden blootgesteld aan sterke verdunningen moeten alle monster manipulaties te worden gedocumenteerd voor de uiteindelijke concentratie berekeningen. De meeste fouten worden gemaakt in dit deel van het protocol.
Bij het hanteren van monsters voor nitriet metingen, snelle overdracht innitriet behoud oplossing cruciaal is, vooral wanneer heem-bevattende eiwitten, zoals hemoglobine, die reageert met nitriet en nitraat oxideert het in aanwezig zijn. Eenmaal gestabiliseerd, monsters kunnen worden ingevroren voor langdurige opslag voor assays.
Hoeveelheden verscheidene NO metabolieten in biologische monsters (in het bijzonder RX-NO) zeer laag, soms niveaus gegenereerde NO zijn op achtergrondruisniveau van de NOA analysator. Het is natuurlijk altijd monsters bereiden met zo weinig verdunning mogelijk indien dergelijke verbindingen te meten.
Beperkingen van de Techniek
Met een zorgvuldige monstervoorbereiding en injecties, de lage limiet van de gevoeligheid ligt dicht bij 20 nM van NO adduct aanwezig is in het volledig voorbereid monster. De gebruikelijke biologische concentraties van nitriet en nitraat wel meer dan deze concentraties echter de R- (X) -NO bedragen kan dichtbij dit bereik vallen.
hoge sen CLligheid vraagt om een zorgvuldige monster voorbereiding en precieze volume metingen.
Betekenis van CL met betrekking tot alternatieve methoden van NO metabolieten Metingen
Chemiluminescentie (CL) is een zeer gevoelige methode om NO, nitriet, nitraat en RX-NO te detecteren. Momenteel CL wordt beschouwd als de gouden standaard voor de bepaling van NO en zijn metabolieten.
Andere veel voorkomende alternatief voor nitriet te bepalen is Griess reactie (GR). GR is een handige en goedkope colorimetrische methode gebaseerd op diazoteringsreactie door Peter Griess beschreven in 1879. Analyse van nitraat is voorafgaande chemische of enzymatische reductie van nitraat in nitriet. Beste huidige commercieel verkrijgbare kits hebben gevoeligheid ongeveer 100 nM voor nitriet, de gevoeligheid van de meeste kits mogelijk maakt om nitraat en nitraat te bepalen is in lage uM bereik. Bij gebruik GR nitriet en nitraat in het monster te bepalen, zijn twee stappen nodig; Eerst, bepalen de nitriet amount in de eerste portie van het monster, gebruik dan de tweede portie in nitraat te verminderen in nitriet en meet de totale nitriet en nitraat (soms aangeduid als NOx) gehalte in het monster. Nitraat werkelijke waarde is het verschil van metingen. Beter alternatief voor deze twee stappen protocol voorafgaande scheiding van nitriet en nitraat door chromatografie. Echter aanzienlijk vermindert de gevoeligheid en vergroot de analysetijd.
toekomstige toepassingen
Met steeds meer aanwijzingen over de betekenis van NO route in biologische systeem, voorzien we het vaker gebruik van nitriet of nitraat of andere NO metabolieten als biomarkers van cardiovasculaire gezondheid. Verhoogde bewijs suggereert ook dat deze moleculen belangrijk uitoefening geneesmiddel kan zijn en hun niveau kan worden veranderd bij mensen met diabetes, obesitas en metabool syndroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Alan Schechter wordt vermeld als een co-uitvinder verschillende octrooien de National Institutes of Health voor het gebruik van nitriet zouten voor de behandeling van cardiovasculaire ziekten. Hij ontvangt royalties gebaseerd op NIH verlening van deze octrooien voor de klinische ontwikkeling, maar geen andere compensatie.
Acknowledgments
Auteurs willen kritische bijdragen van Dr A. Dejam en MM Pelletier erkennen in de ontwikkeling van het gebruik van nitriet behoud oplossing voor de nitriet metingen in het bloed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
- Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).
- Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
- Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
- Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
- Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
- Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).
- Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
- Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
