Summary
Este protocolo presenta un método para la recuperación morfológica de las neuronas parcheado durante registros electrofisiológicos usando llenado biocitina y posterior procesamiento posterior inmunohistoquímico. Se demuestra que las secciones biocitina llenas de gruesos que se tiñeron y se pueden coverslipped restained con un segundo anticuerpo primario días o meses más tarde.
Abstract
Los registros electrofisiológicos de células por medio de la técnica de patch clamp han permitido la identificación de los diferentes tipos neuronales basados en patrones de descarga. La inclusión de biocitina / neurobiotin en el electrodo de registro permite la recuperación post-hoc de los detalles morfológicos, que son necesarios para determinar la arborización dendrítica y las regiones seleccionadas por los axones de las neuronas registradas. Sin embargo, dada la presencia de neuronas morfológicamente similares con las identidades y funciones neuroquímicas distintas, la tinción inmunohistoquímica de las proteínas de células de tipo específico es esencial para identificar definitivamente las neuronas. Para mantener la conectividad de la red, las secciones del cerebro para las grabaciones fisiológicas se preparan con un grosor de 300 micras o mayor. Sin embargo, este espesor a menudo dificulta el posprocesamiento inmunohistoquímico debido a problemas con la penetración de anticuerpos, lo que requiere la resección del tejido. Resección de las rebanadas es un arte difícil, a menudo Resulting en la pérdida de tejido y la morfología de las células de las que se obtuvo datos electrofisiológicos, haciendo que los datos inutilizable. Dado que la recuperación de la morfología limitaría la pérdida de datos y la guía en la selección de marcadores neuronales, hemos adoptado una estrategia de recuperación de la morfología celular primero, seguido de inmunotinción secundaria. Se introduce un enfoque práctico para biocitina llenando durante los registros fisiológicos y inmunotinción siguiente de serie para la recuperación de la morfología, seguido por el restaining de las secciones para determinar la identidad neuroquímico. Nos informan de que las secciones que estaban llenos de biocitina, fijadas con paraformaldehído (PFA), manchadas, y coverslipped se pueden quitar y restained con un segundo anticuerpo primario días posteriores. Este restaining consiste en la eliminación del cubreobjetos, el lavado de las secciones en una solución tampón, y la incubación de los anticuerpos primarios y secundarios para revelar la identidad neuroquímico. El método es ventajoso para la eliminación de datuna pérdida debido a la imposibilidad de recuperar la morfología y de la reducción a los marcadores neuroquímicos a ensayar sobre la base de la morfología.
Introduction
El cerebro es conocida por la diversidad en las características estructurales y funcionales de sus elementos neuronales individuales. La comprensión de las funciones de los distintos tipos neuronales en la función cerebral y la patología requiere la caracterización e identificación inequívoca de las neuronas. Estructuralmente, las características morfológicas definidas por ubicación somato-dendrítica determinan las entradas potenciales que recibe una neurona determinada, mientras que el patrón de arborización axonal identifica posibles dianas postsinápticos. La diversidad estructural de las neuronas ha sido apreciado desde los días de los estudios histológicos seminales de Ramón y Cajal 1. El advenimiento de las técnicas de grabación de una sola célula reveló que las neuronas estructuralmente distintas también muestran diferencias en los patrones de activación y características sinápticas. La diversidad en la estructura y la fisiología es particularmente evidente en las neuronas inhibidoras GABAérgicas 2,3. Además, se ha vuelto cada vez más evidente que structurallY neuronas similares pueden expresar diferentes marcadores neuroquímicos y muestran diferencias funcionales correspondientes 4. Del mismo modo, las neuronas con los mismos marcadores neuroquímicos pueden tener estructuras y funciones 5-10 distintas. Por lo tanto, en la práctica, el análisis de las características funcionales de las neuronas y su papel en la red implica definir tanto las identidades morfológicas y neuroquímicas. Incluso con el advenimiento de reportero líneas de ratón dirigidos marcadores neuroquímicos específicos, a menudo es necesario para determinar la morfología y la identidad de subtipo basada en inmunohistología 11.
El método estándar utilizado para caracterizar las células registradas en rodajas de cerebro agudas es llenarlos con biocitina o neurobiotin durante la grabación, fijar las secciones en paraformaldehído (PFA) siguiendo las grabaciones, y el uso de técnicas de inmunohistoquímica para revelar la morfología y la neuroquímica. Dado que el espesor de las secciones para la fisiología rebanada son típicamente 300 micraso más, y porque la mayoría de los anticuerpos no pueden penetrar todo el camino a través de esa profundidad, las rodajas deben ser re-seccionada a 60 micras o menos para permitir la inmunotinción simultánea para biocitina y marcadores neuroquímicos 12-14. Desafortunadamente, resección es laborioso; corre el riesgo de pérdida de tejido durante el corte; y puede conducir a la diferencia de la contracción del tejido, lo que complica las reconstrucciones morfológicas. Además, el conocimiento previo de la morfología podría ayudar a reducir los marcadores candidatos que pueden ser expresadas por las células. Hemos modificado los protocolos inmunohistología biocitina estándar para permitir el procesamiento en serie de secciones en primer lugar para la recuperación de la morfología y luego para la identificación de posibles marcadores neuroquímicos.
La inmunohistoquímica es el estudio de la distribución de antígenos en tejidos o células y se puede visualizar usando una enzima, marcadores fluorescentes, elementos radiactivos, o partículas coloidales de oro 15. El procedimiento involves usando anticuerpos primarios para etiquetar específicamente y amplificar uno o más antígenos específicos, seguido por el uso de anticuerpos secundarios fluorescentes dirigidos al anticuerpo primario para la visualización. Debido a la necesidad de distinguir los espectros de fluorescencia de cada anticuerpo secundario sin solapamiento, sólo un número limitado de antígenos puede ser examinado de forma simultánea. Por lo tanto, el conocimiento previo de la morfología puede ser útil en la selección de los marcadores neuroquímicos candidatos para la clasificación de células. Conceptualmente, la razón de ser de procesamiento en serie de secciones teñidas ya-se basa en la premisa de que immunolabeling para una proteína o péptido no debe interferir con la antigenicidad y la posterior inmunomarcación para un péptido estructuralmente independientes 16. Esta falta de interferencia se debe a la unión de los anticuerpos a un epítopo de proteína específica en un antígeno y por lo tanto permite la tinción simultánea de múltiples antígenos en el mismo tejido. El número de antígenos revealed por inmunotinción está limitada por la necesidad de que los espectros de no acumulación de los anticuerpos secundarios fluorescentes y por la necesidad de dirigirse a antígenos individuales con anticuerpos en diferentes especies a fin de eliminar la reactividad cruzada 17,18. Si bien este es el razonamiento detrás de etiquetado en serie en lugar de simultánea con dos anticuerpos distintos que pueden interactuar, a nuestro conocimiento, la inmunotinción para un segundo antígeno no ha sido reportado después de la finalización de inmunomarcaje para uno o más antígenos en secciones montadas. A continuación, se describe un método para la inmunotinción de serie de secciones previamente teñidos y montados. A pesar de que el detalle de este proceso para un procedimiento immunolabeling serie para la recuperación de la morfología seguido de tinción para los marcadores de proteína / péptido en secciones gruesas, los mismos procedimientos se pueden utilizar en la norma, las secciones histológicas delgadas también. Además, se describe un enfoque práctico para llenar neuronas registradas con biocitina y el proceso para desalojar elelectrodo de la célula tras la finalización de grabaciones para optimizar el llenado de la axonal y cenadores dendríticas de neuronas, tal como se presenta en nuestra reciente 6,8 trabajo.
La ventaja más importante del procedimiento descrito aquí es que la morfología de la célula registrada puede ser totalmente recuperado y fotografiado antes de intentar la resección o immunostain las rebanadas. A pesar de los problemas con la penetración de ciertos anticuerpos pueden hacer necesario rebanadas de resección para inmunotinción secundaria, los procedimientos que se detallan aquí eliminarían la necesidad de reconstruir las neuronas complejas de múltiples secciones y evitarían problemas debido a la pérdida de tejido y contracción diferencial, lo que puede comprometer la reconstrucción tras resecciones. Una ventaja añadida es que el proceso va a reducir costes, tiempo, esfuerzo y anticuerpos costosos mediante la limitación de la inmunotinción y volver a seccionar a rodajas en el que se recuperan las neuronas biocitina llenas. El aspecto más práctico es el anuncioinmunotinción condicional que puede ser realizado en las secciones teñidas meses antes de usar la técnica antes mencionada. En particular, la recuperación de la morfología reduciría considerablemente el potencial de que los datos fisiológicos de las células se descarta debido a la incapacidad para obtener una caracterización morfológica básica del tipo de célula.
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Protocol
1. Provisión Biocitina durante Electrofisiología
NOTA: Los lectores pueden hacer referencia a fuentes alternativas para las técnicas básicas de patch-clamp de grabación y de instrumentación 19 a 22, que no se elaboran a aquí. Los pasos que se detallan aquí suponen que el equipo y los procedimientos de patch-clamp grabaciones ya están establecidas, y la descripción se limitará a los detalles relacionados con biocitina-llenado y la inmunotinción post-hoc. Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron en ratas.
- El uso de un vibratome, preparar secciones de cerebro en vivo de la región deseada en un espesor de 300 a 350 micras 23.
- Preparar una solución interna que contiene 0,2% biocitina mediante la adición de 2 mg de biocitina a 1 ml de solución interna 6. Para obtener los mejores resultados, sonicar la solución interna durante 10 - 15 min hasta que el biocitina se disuelve por completo. A continuación, cargar la solución interna en una jeringa de 1 ml equipado con un 0,2 y# 160; micras de poro punta de filtro de tamaño de polipropileno unido a un microloader. Mantener esta jeringa de carga en una bolsa de hielo para mantener la estabilidad de la Mg-ATP y GTP-Na en la solución interna.
NOTA: Un gluconato de potasio solución interna que contiene (126 mM K-gluconato, KCl 4 mM, HEPES 10 mM, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP, y fosfocreatina 10 mM) es óptimo para la recuperación de ciertos marcadores neuroquímicos, incluyendo parvalbumin, durante inmunomarcaje. En nuestra experiencia, el uso de cesio y soluciones internas a base de cloruro reduce la capacidad de recuperar la inmunotinción para ciertos marcadores neuroquímicos. Neurobiotin o una, fijable, trazador polar de células impermeant la combinación de un fluoróforo Alexa con biocitina se pueden utilizar como una alternativa a la biocitina. - Bajo infrarrojos contraste de interferencia diferencial, visualizar la celda apropiada para la grabación. Para minimizar cualquier interrupción del axón, acercarse al cuerpo de la célula mediante la reducción de la pipeta a lo largo de su eje utilizando el "enfoque" función disponible en la mayoría de micromanipulador. Establecer registros de célula entera bajo diferencial de contraste de interferencia infrarroja usando protocolos fisiología patch-clamp 19-22.
NOTA: Evitar acercarse a la célula a partir de la dirección de la axón putativo, ya que cortar el axón, visualizada como una ampolla en el extremo cortado (flecha verde en la Figura 1). También, evitar la aplicación de alta presión positiva a la pipeta de grabación mientras se aproximaba a la célula para minimizar el derrame de biocitina, lo que resultará en alta tinción de fondo.
Figura 1. Plano sugeridos para acercarse a las células para Biocitina rellenos. La imagen ilustra una de células granulares (GC) llenar con biocitina durante la grabación que ha sido procesado para revelar biocitina (en rojo usando estreptavidina conjugada 594). La GC tiene sus dendritas orientadas en el plano XY. Observe el de células granulares rotoaxón (flecha verde) debido al movimiento de la pipeta a lo largo del plano XY. Tenga en cuenta que es ideal para acercarse a esta neurona a lo largo del plano XZ. Barra de escala: 50 micras.
- En la configuración de fijación de voltaje, determinar la capacitancia de célula entera y la resistencia en serie en respuesta a pequeñas (5 mV), breves (30 ms) Tensión pasos usando el uso de la función de prueba de la membrana en el modo de baño en una adquisición de datos y software de análisis de electrofisiología. Esto asegurará que el establecimiento de condiciones de grabación de célula entera para permitir biocitina-llenado.
- Llevar a cabo las grabaciones fisiológicas o bien al modo current- o de fijación de voltaje, según sea necesario. Un tiempo mínimo de grabación de> 10 min a 34 ° C es ideal.
Se pueden necesitar más tiempo para los tiempos de grabación estudios llevados a cabo a temperatura ambiente: NOTA. - Al término de las grabaciones fisiológicas, re-establecer la configuración de patch-clamp moviendo lentamente la pipeta de grabación en pequeños pasos, alternando hacia arriba (a lo largo del eje Z) yhacia fuera (a lo largo del eje X) en el modo de fijación de voltaje.
- Al mismo tiempo controlar la capacitancia y la resistencia de entrada utilizando la función "Prueba de membrana" para visualizar la pérdida de los transitorios capacitivos y el colapso de las respuestas actuales a una línea recta, lo que indica la re-sellado de la celda y el establecimiento de un fuera-fuera parche a la punta de la pipeta. La celebración de la célula a un potencial despolarizada (-40 mV) facilitará el proceso de re-sellado.
NOTA: Este procedimiento para la eliminación de una célula normalmente asegura la recuperación completa del soma y dendritas. No aplique presión positiva a la pipeta de grabación durante este procedimiento o mientras se separa la célula de la pipeta. La visualización de la soma de la célula registrada en el corte indica la desconexión éxito. La presencia de restos celulares o un parche de membrana en el extremo de la punta individual normalmente indica la dislocación de la soma y no producir la morfología celular completa. - En popaer separar la pipeta de la célula, retener la rebanada en la cámara de grabación durante 3 - 5 min para asegurar el transporte del tinte a dendríticas distal y procesos axonales.
- La transferencia de las rebanadas a una placa de 24 pocillos que contenía 4% PFA para la fijación.
PRECAUCIÓN: PFA es cancerígeno, y equipo de protección personal, incluyendo guantes y una mascarilla, debe utilizarse para evitar la irritación de la piel y la inhalación. PFA es inflamable y debe mantenerse fuera del alcance de los incendios. PFA no se dispone en el desagüe y deben ser recogidos como basura química. fijación PFA debe ser aislado de las áreas utilizadas para la preparación rebanada vivo para evitar la contaminación de la configuración de la fisiología, incluyendo pipetas de transferencia. - 24 - 48 h después de la fijación de PFA, transferir las rebanadas de 0,1 buffer fosfato salino-M (PBS) para el almacenamiento antes de la inmunotinción.
NOTA: Idealmente, biocitina recuperación y la inmunotinción son mejores cuando se lleva a cabo poco después de la fijación, aunque por tinción formado dentro de 7 d de los rendimientos de fijación buenos resultados. Las rebanadas se pueden mantener en PBS con 0,02 - 0,05% de azida de sodio para la tinción realizado hasta más de 90 días después de la fijación. Aunque la fijación durante la noche en PFA funciona bien para la mayoría de los anticuerpos, es posible que algunos anticuerpos funcionan mejor cuando se reduce la duración de la incubación en fijador. Fijación en PFA durante más de 48 h reduce la disponibilidad de antígenos y disminuye las posibilidades de éxito inmunotinción secundaria para los marcadores neuroquímicos.
PRECAUCIÓN: La azida sódica es extremadamente peligroso e irritante al contacto con la piel o los ojos o con la ingestión o inhalación. Una severa sobre exposición puede causar la muerte. La carcinogenicidad y mutagenicidad del compuesto no se conocen. Utilice equipo de protección personal apropiado incluyendo guantes, gafas protectoras contra salpicaduras, una bata de laboratorio, y un respirador para polvo. azida de sodio no se dispone en el desagüe y deben ser recogidos como basura química.
(Día 1)
NOTA: El siguiente procedimiento es para la inmunotinción libre flotación secciones y requiere agitación continua a una velocidad baja (2 revoluciones / minuto, rpm) en un agitador durante todas las etapas de incubación.
- Lavar el tejido 3x durante 10 min cada uno en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
NOTA: 0,1 M de PBS se puede adquirir en el comercio o en el laboratorio de la siguiente manera (hace 1 L): 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, y 0,24 g de KH 2 PO 4 en 1 l de dH 2 0.
NOTA: Si se conoce el marcador neuroquímico se desea, la tinción de una proteína / péptido puede realizarse simultáneamente con la tinción de biocitina (pasos 2.2 hasta 2.4). Si la tinción de biocitina solamente, continúe en el paso 2.5. - OPCIONAL: Bloque con 10% suero de bloqueo (BS; suero normal de cabra (NGS) diluido en 0,3% de Triton X-100 en PBS durante 1 h a TA).
NOTA: Cada pocillo deberecibir el mismo volumen de la solución; el volumen recomendado es de entre 250 a 500 l / pocillo. La selección del suero de bloqueo se basa en las especies en las que se crían los anticuerpos secundarios (por ejemplo, NGS se utiliza para anti-cabra conjugado de tinte (especie de anticuerpo primario respectivos)). Si surge la necesidad de utilizar anticuerpos secundarios levantados en diferentes especies a inmunotinción secciones, incluir 10% de cada suero normal en el bloqueo de la etapa (2) y 3% de cada suero normal para los pasos de incubación de anticuerpo primario y secundario. - (OPCIONAL) Se incuban las secciones en anticuerpo primario, CB 1 R (policlonal, conejillo de indias) con 0,3% Triton X-100, y 3% BS en 0,1 M PBS a temperatura ambiente O / N. CB 1 R se utiliza para identificar cannabinoide tipo de receptor 1 de expresión.
NOTA: Este paso es opcional y no es necesaria para revelar el relleno biocitina. La Figura 2 ilustra una sección etiquetada para biocitina y CB 1 R durante el primer proceso de tinción. O / N incubación a temperatura ambiente es suficiente para la mayoría de los anticuerpos primarios; sin embargo, ciertos anticuerpos primarios, incluyendo CB 1 R, requieren 3-5 días de incubación. Si la incubación tiene que ser más largo que 1 d, se recomienda incubar a 4 ° C porque Triton X-100 puede permeabilizar rebanadas y puede conducir a la desintegración del tejido durante la incubación prolongada a temperatura ambiente. Incluir un control negativo que carece de anticuerpo primario en al menos una sección para cada serie de experimentos como un control para la especificidad del anticuerpo secundario. Para los controles negativos, se omite el anticuerpo primario, sino que se añaden el 0,3% de Triton X-100 en PBS 0,1 M y BS.
Figura 2. El éxito de CCK tinción 1 semana después de la recuperación de Biocitina tinción y C annabinoid receptor tipo 1 (CB1 R) - <strong> etiquetado. (A - C) Las imágenes confocales en 60X que muestran la neurona biocitina lleno (A) y CB 1 R inmunorreactividad (B), indicado por la punta de flecha. En la misma sección se procesó para inmunotinción CCK después de 1 semana (C). La superposición de imágenes se muestra en D. CCK inmunoreactividad se reveló usando el rojo lejano y era de color seudo-en cian. (E) la reconstrucción morfológica de la célula biocitina lleno en A. Obsérvese que la biocitina y CB 1 R tinción son evidentes incluso después de la segunda inmunotinción CCK. También tenga en cuenta la distribución esperada de CB 1 R y patrones de inmunotinción CCK. (F - H) imagen ampliada del axón de la célula, como en A, espectáculo de cierre co-localización de biocitina y CB 1 R en los axones (puntas de flecha). Barra de escala: 50 m (A - D), 100 micras (E), y 10 micras (
(Dia 2)
- Lavar el cerebro secciones 3 veces durante 10 minutos cada uno en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Incubar las secciones de estreptavidina conjugada colorante rojo (concentración: 1: 1000; de excitación: 594 nm con la emisión en el espectro rojo visible) con 0,3% Triton X-100 y 3% BS en 0,1 M PBS a 4 ° CO / N en el oscuro (envuelto en papel de aluminio) para revelar la biocitina. OPCIONAL: Incluir un anticuerpo secundario, de cabra anti-cobaya (concentración: 1: 500; de excitación: 488 nm y emisión en verde), con la incubación anterior, si después de la incubación primaria opcional en el paso 2.3.
Se necesitará Anticuerpo secundario sólo si se lleva a cabo la tinción con el anticuerpo primario opcional (paso 2.3): NOTA. Para visualizar biocitina, un streSe recomienda conjugado ptavidin-fluoróforo con un espectro de emisión en rojo, ya que ayuda a visualizar los axones finos en detalle y con un mejor contraste (Figuras 1 - 3). Durante la inmunotinción doble o triple, a fin de evitar la reactividad cruzada de anticuerpos secundarios entre sí, añadir anticuerpos secundarios, uno tras otro de una manera en serie (2 intervalo h entre las adiciones de serie de los anticuerpos es suficiente). La Figura 3A ilustra una célula biocitina lleno de procesado sin la tinción de anticuerpo primario opcional y la imagen antes de la resección.
Figura 3. En segundo lugar inmunotinción con éxito después de la recuperación de Biocitina Morfología y resección. (A1) Confocal imagen de una sección 300 micras que muestra la recuperación de la morfología dendrítica de una célula biocitina-llenado. (<strong> A2) rastros voltaje de la membrana de la neurona en respuesta a +500 y -100 pA inyecciones actuales. (B) La recuperación del soma biocitina lleno en una sección de 50 micras obtenida después de la resección de la sección 300 micras (en A1) después del montaje y de imagen. (B2) inmunotinción posterior de la sección delgada reveló colocalización de la soma biocitina lleno (panel derecho) con CCK (panel medio). La imagen resultante de la fusión se ilustra en el panel derecho. Barra de escala: 50 micras. Grupo A2 se reproduce con permiso de Yu et al. , En prensa 25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(Día 3)
- secciones de cerebro Lavar 3 veces durante 10 minutos cada uno en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Para proteger la fluorescencia y para facilitar la re-tinción en el futuro, montar el secciones en un medio de montaje de base acuosa y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
NOTA: Es mejor restain secciones tan pronto como sea posible para evitar dificultades en la eliminación del esmalte de uñas de la diapositiva, la infestación de moho, y la deshidratación del tejido debido a la fuga de la solución de montaje del portaobjetos de vidrio. La contaminación microbiana se puede prevenir mediante el uso de azida de sodio 0,02% en PBS.
PRECAUCIÓN: La azida de sodio es altamente tóxico e inflamable cuando se encuentra en contacto con el agua. Por favor refiérase a los procedimientos operativos estándar para la manipulación y eliminación de productos químicos peligrosos.
(Días 4 - 7) - Realizar imagen confocal con excitación a 594 y 488 nm y con un aumento de 20X o 40X para revelar las neuronas biocitina lleno en los marcadores rojos y neuroquímicos (CB 1 R) en verde. Evaluar colabeling (Figura 2).
- Ajuste la exposición de la cámara a menos de 100 ms para evitar photobleaching y obtaen pilas de imágenes confocal de las glorietas axonales y dendríticas de toda la neurona. Use pilas de imágenes confocal y rastreo de paquetes de software de neuronas para reconstruir la morfología neuronal.
3. La tinción de la Segunda anticuerpo primario
NOTA: Mientras que la segunda etapa se puede realizar la inmunotinción 90 d después de la primera tinción, se consigue tinción óptima si la segunda tinción con anticuerpo primario se realiza plazo de 7 - 10 d.
(Después del 7 - 90 días)
- Aplicar acetona para un hisopo de algodón y pelar el esmalte de uñas fuera de la lámina de vidrio.
- Quitar el cubreobjetos con cuidado con unas pinzas de punta fina y poner unas gotas de PBS 0,1 M en las secciones.
- Retirar con cuidado las secciones de la lámina usando un pincel fino y lavar en PBS 0,1 M durante 24 - 48 h en un agitador cubierto de papel de aluminio en condiciones de poca luz a 4 ° C.
NOTA: Es fundamental para cubrir las secciones con unapapel de aluminio para evitar luminum photobleaching. - Para asegurar la eliminación completa del medio de montaje, lavar las secciones 1 - 2x en el día siguiente en 0,1 M PBS durante 10 min cada uno.
- Proceder con la incubación en el segundo anticuerpo primario (por ejemplo, la colecistoquinina, un neuropéptido que se encuentra en ciertos interneuronas GABAérgicas (CCK; concentración: 1: 1000; anticuerpo monoclonal de ratón)) para 1 d (Figura 2).
NOTA: Este procedimiento es similar a la etapa 2.3, pero utiliza un anticuerpo diferente. Además, la etapa de bloqueo se omite durante la re-tinción. - Se lavan las secciones del cerebro tres veces durante 10 min cada uno en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- La mancha con el anticuerpo secundario de cabra anti-ratón fluoróforo conjugado (concentración: 1: 500; de excitación de longitud de onda: 647 nm), asegurándose de que el espectro de emisión de excitación del anticuerpo secundario no se solapan con estreptavidina (concentración: 1: 1000; longitud de onda de excitación: 594 nm) e inmunofluorescencia antesmanchas.
- Montar las secciones en medio de montaje acuoso y sellar los bordes de la hoja de la cubierta con esmalte de uñas transparente.
NOTA: Guarde las secciones a 4 ° C en una caja de almacenamiento opaca para proteger la fluorescencia.
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Representative Results
Al completar con éxito, las secciones retienen el relleno biocitina y la immunolabeling realizan en el paso 2 y se pueden obtener imágenes utilizando confocal o microscopía de epifluorescencia. Además, las secciones procesadas también mostrarán inmunotinción para el antígeno marcado durante el procesamiento posterior en el paso 3. En la sección ilustrada en la Figura 2, la morfología de una neurona biocitina lleno en una sección gruesa (300 micras) se reveló usando estreptavidina visualizada en rojo y la primera primaria (CB 1 R) visualizado en verde. La primera inmunotinción se realizó dentro de los 7 días de la fijación de PFA. La rebanada se montó en un medio de montaje acuoso, imágenes utilizando un microscopio confocal, y se almacena por un período de dos meses antes de volver a la tinción para el anticuerpo CCK. Tenga en cuenta la morfología de la neurona registrada, incluyendo cenadores axonal (Figura 2E), fue reconstruido a partir de las imágenes confocal obtained después del primer procedimiento de tinción. Colocalización del axón con CB 1 R inmunoreactividad (Figura 2 F - H) se esperaba en base a estudios fisiológicos. La segunda tinción para CCK se realizó en secciones de dos meses después del primer procedimiento de tinción. CCK fue fotografiada en el rojo lejano y era de color seudo-en cian para la visualización. Del mismo modo, la Figura 3 ilustra un ejemplo de una célula en la que biocitina-etiquetado fue revelado y la imagen en una sección de espesor (Figura 3A1). La fisiología intrínseca de la neurona se ilustra en la Figura 3A2. La rebanada fue re-seccionaron a 50 micras y, aunque se perdieron algunas secciones que contienen procesos dendríticos, la sección que contiene el soma recuperado (Figura 3B1). La posterior inmunotinción CCK de la sección fina mostró una expresión de CCK en verde en el soma biocitina marcado. Montaje de la rebanada de espesor en un medio acuoso impide ela contracción del tejido xcessive. En promedio, las secciones 300-micras montados usando el medio acuoso contraiga en alrededor de 25,67 ± 3,14% (n = 5 rebanadas) cuando se mide una semana después de montaje. Por lo tanto, las secciones gruesas montadas utilizando el medio acuoso son ~ 225 micras, lo que permite la resección. En varios estudios de control, se confirmó que el proceso de inmunomarcaje para el segundo tiempo no condujo a etiquetado no específica por el anticuerpo. Por ejemplo, se sabe que la parvalbúmina (PV) y la inmunorreactividad de CCK se excluyen mutuamente en las neuronas del hipocampo. Controles en el que el primer paso immunolabeling (2) para biocitina (rojo) y CCK (verde) fue seguida por la segunda de etiquetado para parvalbúmina (con excitación a 405 nm y la emisión en azul) mostraron patrones de expresión no superpuestas (Figura 4). Además, los patrones distintivos de tinción laminar axonal de las neuronas que expresan marcadores neuroquímicos específicos (PV, CCK, CB 1 R) no fueron alterados por la serial procedimientos de re-tinción (Figuras 2 - 4). Por otra parte, la tinción secundaria reveló consistentemente co-etiquetado de las neuronas biocitina llena con los marcadores neuroquímicos esperados sobre la base de las grabaciones fisiológicas. Por lo tanto, estamos seguros de que el procedimiento restaining no conduce a la pérdida de especificidad en el etiquetado.
Figura 4. La falta de coincidencia entre los marcadores mutuamente excluyentes en la Segunda Inmunoticción Siguiendo Inmunoticción Prior y montaje de las secciones. (A - C) Las imágenes confocales a 10x que muestra una neurona biocitina lleno (A) en rojo, indicado por una punta de flecha, y la inmunorreactividad de CCK en verde (B), indicada por la flecha. Tenga en cuenta la falta de solapamiento. En la misma sección se procesó para parvalbumina (PV) inmunotinción en azul después de más de 2 meses (C). el overlay de imágenes se muestra en D. Tenga en cuenta que los axones PV se distribuyen en la capa de células granulares, con CCK en la capa molecular en el patrón nonoverlapping esperado. También tenga en cuenta la falta de colocalización de los dos marcadores en los cuerpos celulares neuronales. Las imágenes ampliadas a la derecha ilustran que la neurona biocitina marcado expresa PV (punta de flecha) y no CCK (flecha). Barra de escala: 100 mm (A - D), 20 micras (paneles a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una razón común para biocitina subóptima llena es la ruptura accidental de los procesos neuronales con la pipeta de grabación mientras se aproximaba a la célula. Un apéndice de perdida de la célula aparece como una ampolla de biocitina al final de un axón, como se ilustra en la figura 1 (flecha verde). Axonal ampollas de unavolver a menudo visualizada cuando actualice las células superficiales, cuyos axones puedan separarse durante los procedimientos de corte en rodajas. Sin embargo, la optimización del plano de corte en lonchas y el conocimiento del patrón de distribución axonal de la clase célula diana puede ayudar a evitar que se acerca el soma de la dirección del axón putativo, que también puede cortar el axón, lo que resulta en la aparición de una ampolla axonal . En la mayoría de tipos de células, es preferible para acercarse al cuerpo de la célula a lo largo del eje Z (flecha blanca con marca). Un segundo problema se refiere a la aplicación de presión positiva excesiva a la pipeta mientras se aproximaba a la célula. Esto no sólo puede dañar la célula y sus conexiones, sino también hace que la solución interna que contiene biocitina derramar alrededor de la célula, lo que lleva a la alta fluorescencia de fondo. La tinción de fondo también aumenta cuando el tiempo necesario para aproximarse a la célula es prolongada o cuando la calidad de la rebanada no es óptima, lo que puede comprometer la capacidad de definir la morfología celular (Figura 5A). Es posible tirar de la soma hacia fuera mientras que se desprenda de la pipeta. Esto dará lugar a una falta de morfología somática (Figura 5B). Para evitar el retiro de la celda, mover la pipeta hacia arriba y afuera en pequeños pasos utilizando la configuración de movimiento "finos" del manipulador. Si parece estar unido a la pipeta a través de una membrana de extensión larga, toque / flick el manipulador de la célula suavemente para desalojar la pipeta de la célula. Evitar el uso de la configuración del manipulador gruesas hasta que la célula ha desalojado por completo.
La Figura 5. Imágenes ilustran sin éxito rellenos biocitina. (A) Imagen que muestra la alta fluorescencia de fondo debido a la excesiva presión positiva en la pipeta de grabación, con visibilidad pobre celular. estructuras más finas de los procesos neuronales, incluyendo los axones, se visualizan más allá de la región de THe derrame. Además, observe que el soma se ha retirado. (B) Una neurona con el soma sacó durante el desprendimiento de la pipeta. Las flechas muestran rellenos exitosos del axón y dendritas, mientras que el soma y apéndices proximal a las flechas no han sido recuperados. (C) una célula parcheado en una capa superficial de la rodaja (<50 micras de la superficie) resulta en celdas llenas que exhiben axón y dendritas corte (puntas de flecha). Observe la cuenta tubular (flechas) de células granulosas, lo que indica una mala salud celular (C). Barra de escala: 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Por último, con el fin de recuperar la morfología celular completa sin axones o dendritas cortadas, lo mejor es apuntar a las células> 50 micras de profundidad de la superficie de loncha. Las células superficiales pueden tener procesos que tienensido cortado y pueden carecer de la complemento normal de entradas sinápticas.
Las trampas más comunes en los procedimientos de restaining se asocian con la eliminación del cubreobjetos y la recuperación de la sección sin dañar el tejido. Un segundo problema se refiere a la penetración de anticuerpos en el tejido de espesor, sobre todo cuando se incubaron durante la noche. En varios casos, una mejor penetración se ha logrado mediante la incubación en el anticuerpo primario durante hasta 72 horas a 4 ° C en un agitador orbital colocado en una habitación fría. Aunque volver a seccionar el tejido es el procedimiento más eficaz para asegurar la penetración de anticuerpos, la prolongación de la duración de la incubación en anticuerpo primario o el aumento de la concentración de detergente de 0,5 a 1% de Triton-X100 también puede ayudar a la penetración de anticuerpos 24. Como la mayoría de neuronas registradas se encuentran dentro de 50 - 100 micras de la superficie de la sección, nos encontramos con que la tinción de secciones de espesor es adecuado para etiquetar biocitinasomas -filled o procesos a este nivel. Sin embargo, se recomienda que el grado de etiquetado anticuerpo se comprueba en cada sección antes de interpretar los resultados negativos co-localización.
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Discussion
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Llenar la celda parcheado con biocitina es el paso más importante para garantizar la recuperación completa de la morfología. Para la recuperación total de la célula, es esencial para seleccionar una orientación óptima rebanada para minimizar la ruptura de los procesos durante el rebanado. Esta orientación puede variar en función del tipo de circuito y de la célula bajo examen. A continuación, es esencial para permitir un tiempo adecuado para la biocitina se difunda a las dendritas y axones. Algunos colorantes, tales como neurobiotin, pueden penetrar también en las neuronas acopladas a la célula registrada a través de uniones. El tamaño de la punta de pipeta también necesita ser optimizado, ya que el soma tiende a ser retirado cuando la abertura es grande y la carga de biocitina se ve comprometida cuando la punta de pipeta es demasiado pequeño. Además, los procedimientos adecuados, mientras que desacoplamiento desde el modo de células enteras son esenciales para recuperar el soma. Después de grabar durante 24 h, la posterior incubaciónde las rodajas en 4% PFA seguido de PBS se asegura de que la reticulación de los tejidos se reduce, lo cual es crítico para inmunohistoquímica. Almacenamiento de las rodajas a 4 ° C también es crucial para mantener la integridad de la rebanada. Sin embargo, el almacenamiento prolongado en PFA reduce eventual éxito con los procedimientos de etiquetado de anticuerpos. Optimización de la concentración y duración de la incubación del anticuerpo primario es importante, ya que estos serán diferentes para los anticuerpos individuales, y algunos anticuerpos pueden requerir 3-5 días de incubación para la penetración óptima en el tejido de espesor. Para asegurarse de que las rebanadas no están dañados antes de la tinción de anticuerpos primaria, secundaria, es necesario tener cuidado durante la retirada de la hoja de la cubierta.
Modificaciones y solución de problemas
Hemos observado que no existe una duración establecida entre la primera y la segunda mancha. Las secciones han sido re-manchado meses más tarde en el mismo tejido y con más de una mancha. Ennuestros trabajos recientes, se compararon las secciones procesadas por el método de re-tinción con los que utilizan protocolos de inmunotinción estándar y no encuentran ninguna diferencia obvia en los patrones de tinción o la robustez de biocitina llena 6,9,25,26.
Aunque sigue siendo a ensayar, es posible que re-tinción puede llevarse a cabo más de una vez, con la integridad del tejido es un factor limitante para la manipulación repetida. La disponibilidad de fluoróforos discretos también plantea un límite para el número de antígenos que puede ser visualizado. Por lo tanto, se recomienda una cuidadosa manipulación del tejido. Un proceso adicional que permanece a ensayar se restaining usando protocolos de recuperación de antígeno (por receptores de la superficie). Dado que la integridad del tejido se mantiene después de la eliminación de la hoja de la cubierta, esperamos que el procedimiento también debe trabajar en la tinción de protocolos que recomiendan antígeno recuperación. En este sentido, las grabaciones fisiológicas a menudo producen las células sin marcadores neuroquímicos conocidos
Limitaciones de la Técnica
Una limitación asociada con la realización de la tinción inmunohistoquímica en secciones gruesas es la penetración insuficiente del anticuerpo a través del espesor completo de la sección, especialmente con incubación durante la noche estándar en el anticuerpo primario. Por otra parte, diferentes anticuerpos y estreptavidina, que se utiliza para revelar biocitina, pueden tener penetración en el tejido diferencial. Por lo tanto, se recomienda que ejecuciones de prueba se realizan para evaluar la profundidad de penetración de anticuerpos y para modificar los tiempos de incubación, temperaturas, y el anticuerpo y Triton & #160; X-100 concentraciones con el fin de lograr la penetración rodaja óptimo y tinción para cada anticuerpo. También hay que señalar que el etiquetado éxito con un anticuerpo o con estreptavidina-biocitina no implica que un segundo anticuerpo penetrará hasta la misma profundidad de la sección. Por lo tanto, se debe tener cuidado para verificar la penetración de cada anticuerpo para el nivel en el que se examinan los procesos celulares biocitina marcado para la co-localización con el marcador neuroquímico. Si la penetración es insuficiente, la rebanada puede ser re-seccionó a <60 micras para la inmunotinción. Nótese, sin embargo, que, dado que las rodajas ya se procesaron para biocitina, la morfología de la célula puede ser capturado por formación de imágenes confocal para eliminar la posible pérdida de datos anatómicos durante la re-seccionar y para facilitar la reconstrucción neuronal. Si bien es posible que la especie de edad y animales pueden alterar el grado de penetración de anticuerpos, se ha utilizado con éxito estos procedimientos en el tejido de rata de 30día- y más de las ratas 60 días de edad y en ratones.
Una segunda limitación es que biocitina no es intrínsecamente fluorescente y no se puede usar para formación de imágenes en vivo y caracterización morfológica en tiempo real durante la grabación. Fluoróforos conjugados alternativos y amarillo Lucifer se han utilizado para obtener imágenes en vivo de las células 27. Ellos no son permanentes y pierden fluorescencia tras la fijación, por lo que es poco práctico para la identificación neuroquímico post-hoc de la neurona registrada. Recientemente, fluoróforos con biocitina se han introducido para superar esta limitación y se puede utilizar para formación de imágenes en vivo, así como para el procesamiento post-hoc en el etiquetado de triple doble o, como se detalla aquí. Curiosamente, hasta la fecha, rellenos biocitina han dado lugar a mejores propiedades eléctricas y de tinción para estudios electrofisiológicos y anatómicas combinados en comparación con Lucifer amarillo 28.
Importancia de la Técnica en Materia de Existente /Metodos alternativos
Las principales ventajas de utilizar el protocolo detallado aquí son que, a diferencia de resección, la estructura y procesos de células biocitina lleno permanecen intactos y no conducen a la pérdida permanente de tejido, ni a la necesidad de reconstrucciones laboriosas de múltiples secciones. Por lo tanto, un relleno de una sola célula seguido por inmunocitoquímica puede ayudar en la reconstrucción morfológica e identificación de marcadores neuroquímicos específicos.
Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica
En total, se presenta un novedoso enfoque práctico para la recuperación de la morfología y la post-hoc de doble y triple inmunomarcación de las neuronas siguientes registros electrofisiológicos. El proceso es particularmente ventajoso para la búsqueda de nuevos marcadores como el conocimiento evoluciona, re-evaluación de las neuronas que anteriormente estaban llenos, visualizados, y la imagen. Es particularmente ventajoso porque tque la inmunohistoquímica se puede realizar semanas o incluso meses más tarde, el ahorro de tejido y anticuerpos. El método no requiere químicos especiales y con seguridad se puede realizar en cualquier laboratorio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo de los NIH / NINDS R01 NS069861 y NJCBIR CBIR14IRG024 a VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
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