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Biology

Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54887
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, University of Antwerp
* These authors contributed equally

Introduction

Wachstumsanalyse hängt von einer Reihe von Werkzeugen, die von Pflanzenwissenschaftler häufig verwendet werden, Genotyp bestimmt Wachstumsunterschiede und / oder phänotypische Reaktionen auf Umweltfaktoren zu beschreiben. Dazu gehören Größe und Gewichtsmessungen der gesamten Anlage oder ein Organ und Berechnungen der Wachstumsraten, die zugrunde liegenden Mechanismen des Wachstums zu erkunden. Organwachstum wird durch Zellteilung und Expansion auf der zellulären Ebene bestimmt. Daher analysiert die Quantifizierung dieser beiden Prozesse in Wachstum einschließlich ist der Schlüssel zum Verständnis der Unterschiede in Vollorganwachstum 1. Folglich ist es wichtig, eine geeignete Methodik haben zellulären Wachstumsparameter zu bestimmen, der relativ leicht von nicht spezialisierten Labors zu verwenden.

Kinematic Analyse wurde bereits als Ansatz etabliert 2 einen leistungsstarken Rahmen für die Entwicklung von Organwachstumsmodelle bieten. Die Technik wurde für lineare Systeme optimiert,wie Arabidopsis thaliana Wurzeln und monokotyle Blätter, sondern auch für nichtlineare Systeme, wie dikotyle Blätter 3. Heute wird diese Methode immer mehr, wie genetische Studie verwendet wird, hormonelle, entwicklungs und Umweltfaktoren beeinflussen die Zellteilung und die Expansion in verschiedenen Organen (Tabelle 1). Darüber hinaus bietet sie auch einen Rahmen zelluläre Prozesse auf die ihnen zugrunde liegenden biochemischen, molekularen und physiologischen Bestimmungen (Tabelle 2) zu verbinden, obwohl Einschränkungen können durch Organgröße und räumliche Organisation für Techniken , die höhere Mengen an Pflanzenmaterial erfordern auferlegt werden (zB Metaboliten Messungen, Proteomics, etc.).

Monokotylen Blätter, wie beispielsweise Mais (Zea mays) Blatt-, für lineare Systeme , in denen Zellen von der Basis des Blattes gegen die Spitze zu bewegen, der Reihe nach durch die Meristem und Dehnungszone Leiten des reifen zu erreichenZone. Dies macht es zu einem idealen Modellsystem für quantitative Untersuchungen der räumlichen Muster des Wachstums 4. Darüber hinaus haben Maisblätter große Wachstumszonen (Meristem und Dehnungszone über mehrere Zentimeter 5) und in anderen Organisationsebenen Möglichkeiten für Studien. Dies ermöglicht die Untersuchung der (vermeintlichen) Regulationsmechanismen der Zellteilung steuern und Expansion, durch kinematische Analyse durch eine Reihe von molekularen Techniken quantifiziert, physiologische Messungen und Zellbiologie Ansätze (Tabelle 2).

Hier stellen wir ein Protokoll für eine kinematische Analyse in monokotylen Blätter durchführt. Zuerst wird erklärt, wie eine richtige Analyse der sowohl die Zellteilung und Zell Dehnung als Funktion der Position längs der Blattachse zu leiten und wie kinematischen Parameter zu berechnen. Zweitens zeigen wir auch, wie diese als Grundlage für die Stichprobenplan verwendet werden können. Hier diskutieren wir zwei Fälle: hochauflösende Abtastung eind konzentriert Probenahme, verbesserte Dateninterpretation und die Einsparung von Zeit / Geld ermöglicht, respectively.

Tabelle 1 Übersicht der kinematischen Analysen Methoden zur Quantifizierung der Zellteilung und Expansion in verschiedenen Organen.

Organ Referenz
monokotylen Blätter 16, 20, 21, 22
Wurzelspitzen 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
dikotylen Blätter 21, 30, 31
Sprossapikalmeristem 32

Tabelle 1 Übersicht der kinematischen Analysen Methoden zur Quantifizierung der Zellteilung und Expansion in verschiedenen Organen.

Tabelle 2 Zusammenhang zwischen zellulärer Prozesse quantifiziert durch die kinematische Analyse auf ihre Regulation auf molekularer Ebene. Verweise auf verschiedene Studien , die die Quantifizierung von zellulären Prozessen zu den Ergebnissen von biochemischen und molekularen Assays in verschiedenen Spezies und Organen. Xyloglucan endotransglucosylase (XET), Malondialdehyd (MDA), Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

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Protocol

HINWEIS: Das folgende Protokoll für kinematische Analyse gilt nur für Blätter im stationären Zustand Wachstum. Dies impliziert eine stabile Blattdehnungsrate und räumlichen Muster der Zellenlänge und Expansion in einem Blatt während eines Zeitraums von mehreren Tagen 6.

1. Pflanzenwachstum und die Messungen der Blattdehnungsrate (LER)

  1. Wählen Sie ein Blatt im Steady-State-Wachstum und eine Entwicklungsphase von Interesse.
    HINWEIS: Es gibt einen Unterschied zwischen Steady-State-Wachstum und repetitive Wachstum, das auf aufeinanderfolgenden Blättern auf der gleichen Achse ähnliche räumliche Muster impliziert. Während der frühen Stadien der Sämlingwachstum wachsen sukzessive Blätter typischerweise immer schneller durch die zunehmende Größe der Wachstumszone 7. Obwohl einige höhere Blattpositionen ein ähnliches Wachstumsmuster 8 haben kann, ist dies eine Übergangsphase , die durch Behandlungen zu untersuch beeinträchtigt werden kann. Es ist daher wichtig zu vergleichen Linien und tr eatments streng auf der gleichen Blattposition, auch wenn es zu einer anderen Zeit entwickeln kann. Selbst bei einer konstanten Dehnungsrate, ist die Wachstumsrate Profil nicht notwendigerweise gleich in verschiedenen Entwicklungsstadien. Daher ist es wichtig , Blätter an der gleichen Entwicklungsstufe 8 zu analysieren, in der Regel durch die Anzahl der Tage nach dem Auflaufen definiert.
  2. Um eine vollständige kinematische Analyse des Blattwachstums in Monokotyledonen zuführen, wachsen mindestens 15 Pflanzen für jede Behandlung und Genotyp unter kontrollierten Bedingungen in einem Wachstumsraum.
  3. Zu der Zeit , das Blatt von Interesse erscheint (Austritt aus dem Quirl der umliegenden Blätter), starten Sie die Länge der Blattmess täglich mit einem Lineal , bis das Blatt vollständig erweitert ist (Abbildung 1 i). Blattlänge bedeutet die Länge vom Bodenniveau bis zur Spitze des Blattes. Achten Sie darauf, das Blatt zu brechen oder beschädigt werden, da dies möglicherweise sein Wachstum zu verändern.

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Abb . 1: Schematische Darstellung einer kinematischen Analyse von Maisblättern Das Blatt von Interesse wird mit einem Lineal gemessen an drei aufeinanderfolgenden Tagen das Blatt Dehnungsrate (LER) zu berechnen. Danach wird das Blatt geerntet und drei Zentimeter Segment für die Bestimmung der Meristem-Größe verwendet. Dies wird durch Messen der Länge von der Basis bis zu dem distalsten mitotische Figur nach DAPI-Färbung durchgeführt. (A) Beispiele für proliferative Mitosen und (B) gestaltende Mitosen. Die ersten elf Zentimeter von der Blattunterseite auf der anderen Seite der Mitte Vene verwendet 1001 Zentimeter Segmente für die Zelllängenmessungen zu schneiden. Diese Messungen bilden die Grundlage für die Erstellung der Zellenlänge Profil, das die reife Zelllänge (l mat) und die Länge der Zellen , so dass die Meristem (l div) zu bestimmen dient. Das l Matte verwendet , um die Zellproduktionsrate (P) zu berechnen, während l div und L mer verwendet , um die Anzahl der Zellen im Meristem (N - mer) zu berechnen. Wiederum P und N mer verwendet , um die durchschnittliche Zellenteilungsrate (D) zu berechnen, die die Umkehrung der Zellzyklusdauer (T c). Pfeile in der gleichen Farbe zeigen Parameter, die die Parameter folgende auf diese Pfeile werden verwendet, um zu berechnen. Maßstabsbalken = 40 um. Römische Zahlen werden verwendet , um bestimmte experimentelle Verfahren in der beschriebenen Protokoll zu beziehen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Ernte

  1. In der Entwicklungsphase von Interesse (zB, am dritten Tag nach dem Schlüpfen), wählen Sie mindestens fünf Vertreter pMittelführerinnen aus dem Ansatz, auf dem die kinematische Analyse durchzuführen. Wodurch der Rest der Pflanzen messen, wie in Schritt 1.3 erläutert die endgültige Blattlänge zu bestimmen.
  2. Schneiden Sie das oberirdische Teil der Pflanze. Damit die meristematic Teil intakt, schneiden Sie so nah wie möglich an die Wurzeln (Abbildung 1II).
  3. Ausgehend von den äußeren Blättern, entfernen Sie alle Blätter auf dem Blatt von Interesse, indem sie sanft eins nach dem anderen Abrollen. Entfernen Sie ggf. ein paar zusätzliche Millimeter von der Basis, um die Blätter zu lösen. Entfernen Sie auch die Spitze und kleine Blätter durch die Blatt von Interesse (Abbildung 1III) eingeschlossen.
  4. Schneiden Sie ein 3 cm-Segment, von der Basis auf einer Seite der mittleren Ader beginnen, und bewahren Sie sie in einem 1,5 ml-Röhrchen mit 3 gefüllt: 1 (v: v) absolutem Ethanol: Essigsäure-Lösung (ACHTUNG: Handschuhe tragen) bei 4 ° C für 24 Stunden bis zu mehreren Monaten (Abb 1IV). Dieses Segment wird später verwendet werden, um die Länge des Meristem zu bestimmen.
  5. Von demandere Seite der Vene, ein 11 cm - Segment von der Basis (1 v) geschnitten und in einem 15 ml Röhrchen mit absolutem Ethanol bei 4 ° C für mindestens 6 h gefüllten Pigmente (1 vi) zu entfernen.
    HINWEIS: Später, wenn Sie nur die ersten 10 cm der Zellenlänge Profil (siehe Diskussion) zu bestimmen.
  6. Erneuern Sie die absolute Ethanol für eine weitere Runde von mindestens 24 Stunden bei 4 ° C Reinigung (Abbildung 1vi).
  7. Schließlich ersetzen die absolute Ethanol mit reinem Milchsäure (ACHTUNG: Handschuhe tragen) für die Reinigung und Lagerung bei 4 ° C für 24 Stunden oder bis zur weiteren Verwendung (Abbildung 1vi).

3. Meristem Längenmessungen

  1. Bereiten Sie eine Spülung Puffer, der 50 mM Natriumchlorid (NaCl), 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; ACHTUNG: Handschuhe tragen) und 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan-Salzsäure (TRIS-HCl, pH 7).
  2. Nehmen Sie die 3 cm Segment aus dem Abschnitt 2.4 und soak es in dem Puffer für 20 min (Abbildung 1vii).
  3. Während des Wartens, verwenden Sie den Spülpuffer ein 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Färbelösung von 1 ug / ml herzustellen, es auf Eis und im Dunkeln zu halten.
  4. Stain die Kerne durch das meristem Segment für 2-5 min in der DAPI-Färbelösung platzieren. Die Arbeiten auf dem Eis und in der Dunkelheit (Abbildung 1vii).
  5. Prüfen Sie, ob Fluoreszenzsignal durch schnell das Segment auf einem Mikroskopie Glasmontage und Abdecken mit einem Deckglas. Die epidermalen Zellen sollten Fluoreszenz zeigen, während die zugrunde liegenden Zellschichten sollten nicht.
  6. Wenn die Färbung nicht ausreichend ist, legte das Segment wieder in den DAPI-Färbung Lösung für einige zusätzliche Minuten.
  7. Um die Färbung zu stoppen, montieren Sie die Segmente in einem Tropfen Pufferspülung auf einer Mikroskopie Objektträger und Deck mit einem Deckglas.
  8. Verwenden Sie ein Mikroskop mit UV-Fluoreszenz bei einer 20-facher Vergrößerung ausgestattet, so dass für die Visualisierung von rund 1.000 epidermal-Zellen auf einmal. Blättern Sie im gesamten Segment und sucht proliferative Mitosefiguren (Metaphase, Anaphase, Telophase und Zytokinese), aber vermeiden prägenden Zellteilung der Entwicklung Stomata (Abbildung 1viii) 9. Definieren Sie, wo die am weitesten distal gelegene Mitose befindet.
  9. Bestimmen die Länge des Meristem durch den Abstand zwischen der Basis des Blattes gemessen wird und die distalste epidermal mitotische Figur. Verwenden Sie eine Bildanalyse - Software (zB ImageJ) über die volle Länge des Bildrahmens zu messen.
    1. Zählen Sie die Anzahl der Bilder , die die volle meristem Länge (von der Blattbasis zu dem am weitesten entfernten Mitose) und multiplizieren Sie diese Zahl durch die Länge eines Rahmens decken die gesamte meristem Länge (Abbildung 1ix) zu erhalten.

4. Zell Länge Profil

  1. Nehmen Sie das Segment, das in Milchsäure (Schritt 2.5) und vorsichtig auf der Bank gespeichert. Schneiden Sie die Segmente Witzha Skalpell in 10 Segmente von 1 cm jeweils (Abbildung 1x).
  2. Montieren der aufeinanderfolgenden Blattsegmente auf einem Mikroskopie Schieber in einem kleinen Tropfen Milchsäure. Stellen Sie sicher, konsequent auf einen Blick auf die adaxial oder abaxial Seite nach oben. Im Prinzip gibt es keine Präferenz für eine bestimmte Seite.
  3. Verwenden Sie ein Mikroskop mit differentiellen Interferenzkontrast (DIC) Optik ausgestattet, um die Segmente zu analysieren, von der Blattbasis beginnen. Messung mit einer Bildanalysesoftware, die Länge von mindestens 20 replicate Epidermiszellen in Dateien unmittelbar neben der Stomata Dateien, um konsequent die gleichen Zelltyp auszuwählen.
    1. Tun Sie dies in gleich beabstandeten Positionen entlang jedes der Segmente (4 Positionen pro Segment ausreichend), und stellen Sie sicher , die entsprechende Position für jede Messung im gesamten Blatt (Abbildung 1 xi) zu notieren.
  4. Bestimmen Sie die mittlere Zellenlänge an jedem mm entlang der Blattachse durch eine lokale Polynom Glättung p mitERFAHREN, implementiert in einem R-Skript (Abbildung 1xii; Ergänzende Datei 1).
    HINWEIS: Die R-Skript stellt eine Reihe von Daten mit Glättung erhöht. Die erforderliche Menge der Glättung ist etwas willkürlich und sollte idealerweise nur das lokale Rauschen zu entfernen, aber nicht die gesamte Kurve beeinflussen. Sicherstellen, dass die gleiche Menge an Glättung für alle Proben in einem Experiment zu verwenden.
  5. Der Mittelwert der Zellenlänge an jeder Position zwischen den Pflanzen und berechnen Sie die Standardfehler eine Zellenlänge Profil entlang der Blattachse zu schaffen.

5. Die Berechnung der kinematischen Parameter (siehe Zusatz Datei 2)

  1. Berechne die LER , indem die Änderung in der Blattlänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nehmen (beispielsweise 24 Stunden, wie in Schritt 1.3) , und es durch das Zeitintervall dividiert wird .
  2. Berechnen der Länge der Wachstumszone (L gz) entsprechend der Position distal von der Basis , wo Zellen 95% ihrer reifen ce erreichenll Länge auf der Zelllängenprofil geglättet.
    1. Nehmen Sie für jede Position auf der geglättete Zellenlänge Profil 95% des Durchschnitts aller Zellenlängen nach dieser Position (Abbildung 2).
    2. Vergleichen Sie die geglättete Zellenlängen (Schritt 4.4) mit der berechneten 95% Zelllänge in jeder Position. Ausgehend von der Basis des Blattes endet die Wachstumszone an der Position , wo die tatsächliche Zellenlänge entspricht 95% der folgenden Zelllängen (2; siehe Zusatz Data 2).

Figur 2
Abbildung 2:. Die Bestimmung des Endes der Wachstumszone Meristem: An der Stelle , mit einem roten Stern angegeben, ist die tatsächliche Zellengröße von weniger als 95% (rot gestrichelte Linie) der durchschnittlichen Zellgröße aller in dieser Position folgende Zellen (rot solide Linie). Das Ende der Wachstumszone (L gz, angegeben mit ablue Sterne) liegt dort, wo 95% (gestrichelte blaue Linie) der durchschnittliche Zellgröße aller Zellen im Anschluss an diese Position (durchgezogene blaue Linie) ist gleich der tatsächlichen Zellgröße. Abteilung Zone (D), Dehnungszone (E) und reifen Zone (M). Eine gestrichelte Pfeile , um die Konvergenz zwischen der lokalen Größe und 95% der mittleren Größe über den distalen Teil des Blattes zeigen , wenn sie von den basalen Positionen an der Spitze des Blattes bewegt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Berechnen der Länge der Dehnungszone (L EL) als die Differenz zwischen der Länge der Wachstumszone (L gz) und Meristem Größe (L mer; bestimmt in Schritt 3).
  2. Berechnen Sie die reifen Zelllänge (l mat) als auch die durchschnittliche Zellenlänge in der reifen Zone.
  3. Teilen Sie die LER von l Matte zu erhalten , dieZellproduktionsrate (P).
  4. Berechnen der Anzahl von Zellen in der Dehnungszone (N el) als die Differenz zwischen N und N gz mer. Die Anzahl der Zellen in dem Meristem (N mer) gleich der Gesamtzahl der in den Intervallen zu Meristem entsprechenden befindlichen Zellen. Die Anzahl der Zellen in der Wachstumszone (N gz) gleich der Gesamtzahl der in den Intervallen zu der Wachstumszone entsprechenden befindlichen Zellen.
  5. Berechnen Sie die durchschnittliche Zellteilungsrate (D) als P / N mer. Die Zellzyklusdauer (T c) ist gleich ln (2) / D.
  6. Berechnen Sie die Zeit in der Dehnungszone (T el) durch Teilen N el durch P. Die Zeit , in der Teilungszone gleich log 2 (N - mer) * T c. Die Länge der Zellen Verlassen des meristem (l div)gleich der Zelle aus dem geglätteten Zellenlänge Profil am Ende der Meristem Länge.
  7. Berechnen Sie die durchschnittliche Zellexpansionsrate (R el) unter Verwendung folgender Formel: ln (l Matte) -ln (l div)] / T el.

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Representative Results

Hier zeigen wir einen Vergleich zwischen gut bewässerten Pflanzen (Kontrolle, 54% Wassergehalt des Bodens, (SWC)) und Pflanzen ausgesetzt Dürre Stressbedingungen (Dürre, 34% SWC) in Bezug auf ihre Blattwachstum. Alle Pflanzen wurden in einer Wachstumskammer unter kontrollierten Bedingungen (16 Stunden Tag / 8 h Nacht, 25 ° C / 18 ° C Tag / Nacht, 300-400 & mgr; Em gewachsen -2 s -1 photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die Trockenheit bis die richtige SWC und dann weiter gepflegt wurde erreicht wurden durch Einbehaltung Wasser hergestellt. In einer vorläufigen Studie wurde festgelegt, dass das fünfte Blatt das erste ist unter diesem Spannungszustand entstehen und sich entwickeln. Daher ist es wie das Blatt gewählt wurde von Interesse. das letzte Blatt Länge (LL) der Trockenheit gestressten Pflanzen betrug 40% niedriger als der eines der gut bewässerten Pflanzen, die aufgrund einer geringeren LER (Tabelle 3) war. die zelluläre Basis der lea um zu verstehen ,f Wachstumsreaktion, führten wir eine kinematische Analyse. Insgesamt Blattdehnungsrate ist eine Funktion der Zellproduktion im Meristem und reifen Zellgröße in der Dehnungszone bestimmt (Abbildung 3). Daher muss die Verkürzung des Blattes auf die Auswirkungen auf eine oder beide dieser Parameter liegen. Unsere Ergebnisse zeigen , dass , während die reifen Zelllänge (l Matte) nicht betroffen war, die Zellproduktionsrate (P) um 71% reduziert wurde (Tabelle 3). L Matte hängt von der Länge der Zellen die meristem verlassen (l div) die Zeit , sich diese Zellen in der Dehnungszone (T el) und die relative Zellexpansionsrate (R el) verbringen. Es wurde keine Wirkung für l div beobachtet, während R el um 67% in den Dürrebedingungen reduziert wurde. Dieser Effekt wurde durch die fast eine Verdreifachung von T el kompensiert, die in der gleichen l Matte geführt </ Sub>, wie in den Kontrollbedingungen. Die Abnahme der Rate der Zellproduktion war, wiederum verursacht durch sowohl eine niedrigere durchschnittliche Zellteilungsrate (D) und einer kleineren Anzahl von Zellen in der Meristem (N - mer). Länge der Meristem (L mer) wurde im Gegensatz zu der Länge der Wachstumszone (L gz) reduziert, was nicht signifikant beeinflusst wurde. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass in diesem Fall die Zellzahl, im Gegensatz zu der Zellgröße, eine wichtige Rolle hatte Blattgröße zu bestimmen.

Kinematic Parameter C D % Veränderung CD p-Wert
LL 727 ± 15 436 ± 23 -40 0.000
LER (mm / h) 2,8 ± 0,1 0,8 ± 0,0 -73 0.000
l Matte (um) 140 ± 3 130 ± 6 -7 NS
P (Zellen / h) 20 ± 1 6 ± 0 -71 0.000
D (Zellen · Zelle -1 · h -1) 0,028 ± 0,003 0,010 ± 0,001 -63 0.000
T c (hr) 26 ± 3 71 ± 7 +173 0.000
T div (hr) 249 ± 27 656 ± 71 +164 0.000
L mer (mm) 15 ± 1 11 ± 1 -25 0,010
N mer 740 ± 31 590 + 20 -20 0.000
R el (& mgr; m · & mgr; m -1) 0,043 ± 0,002 0,014 ± 0,001 -67 0.000
l div (um) 24 ± 2 23 ± 2 -4 NS
T el (hr) 42 ± 2 125 ± 11 +199 0.000
N el 844 ± 54 735 ± 65 -13 NS
L g z (mm) 68 ± 1 61 ± 5 -11 NS
N g z 1584 ± 33 1326 ± 66 -16 0,010

Tabelle 3. kinematische Analyse auf die Zellteilung und Zellexpansion während des steady-state Wachstum des fünften Blatt. gut bewässerten Pflanzen und Trockenstress ausgesetzt Pflanzen Daten sind Mittelwerte ± SE (n = 5, für LL: n = 10). Student-t-Test wurde als statistische Analyse verwendet. Parameter: Blattlänge (LL), Blattdehnungsrate (LER), reifen Zelllänge (l Matte), Zellproduktionsrate (P), Zellteilungsrate (D), Zellzyklusdauer (T c), die Zeit in der Division Zone ( T div), Länge des Meristems (L mer), die Anzahl der Zellen in der Meristem (N - mer), relative Zelldehnungsrate (R el), Länge der Zellen Meristem (l div), die Zeit in der Dehnungszone verlassen (T el), die Anzahl der Zellen in der Dehnungszone (N el), Länge der Wachstumszone (L gz), die Anzahl der Zellen in der Wachstumszone (N gz), gut bewässerten Bedingungen (C), Trockenstress ( D), einem d nicht signifikant (NS).

Figur 3
Abbildung 3:. Beziehung zwischen den kinematischen Parameter Die endgültige Blattlänge (LL) ist abhängig von der Blattdehnungsrate (LER), die wiederum abhängig von der Zellproduktion (P) und reifen Zelllänge (l Matte). Die Anzahl der Zellen in dem Meristem (N - mer) und der Zellteilungsrate (D) zusammen P bestimmen, mit einem Zellzyklusdauer (T c) als das Inverse von D. Die Zeit in der Dehnungszone (T el), die Länge der Zellen , die die meristem (l div) zu verlassen, und die relative Zellexpansionsrate (R el) bestimmen die reifen Zelllänge (l Matte). Die Anzahl der Zellen in der Dehnungszone (N el)..jove.com / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Neben der Anwendung als eine detaillierte Analyse der Organwachstum stellt kinematische Analyse Karte von Blattwachstumszone Lokalisierung und ermöglicht Probenahme mit einer subzonal Auflösung für die molekulare und biochemische Analysen 4,10,11. Als Beispiel zeigt 4A Malondialdehyd (MDA) Quantifizierung entlang der Wachstumszone des Maisblatt in Pflanzen , wie oben unter den gleichen Bedingungen unterzogen. MDA ist ein sekundärer Metaboliten während Lipidperoxidation durch ROS gebildet und spiegelt das Niveau der oxidativen Schädigung 12. MDA wurde in jeden Zentimeter des Blattes gemessen wird , von seiner Basis ausgehend, die 11 entlang der Wachstumsgefälle Analyse von Konzentrationsänderungen erlaubt. Da die Trockenbehandlung verursachte 40% Blatt Verkürzung der Länge der Entwicklungszonen (meriStamm, Dehnungszone und reifen Zone) in den Kontrollpflanzen hat die Länge der gleichen Zonen nicht überein in der Trockenheit gestressten Pflanzen (4B). Wie in 4B zu sehen ist , war die Meristem in den Kontrollpflanzen etwa 1,5 cm lang, und der Dehnungszone von 1,5 bis 6,8 cm von der Blattbasis überspannt. In den gestressten Pflanzen wurde die meristem 0-1,1 cm lokalisiert und die Dehnungszone von 1,1 bis 6,1 cm. MDA-Pegel und die gesamte Wachstumszone wurden in der Dürre-gestressten Pflanzen erhöhte sich im Vergleich zu der Kontrollbehandlung. Mit Hilfe der kinematischen Analyse konnten wir schließen, dass MDA-Gehalt insbesondere im reifen Zone für beide Regel und Trockenheit Behandlungen erhöht. Ohne die Größen der Entwicklungszonen zu wissen, würden wir schließen, dass, unter Trockenstress, die MDA-Gehalt steigt in einem früheren Entwicklungsstadium als in den Kontrollpflanzen, die falsch wäre, da es nicht in Betracht zieht, die Verschiebung der Zonen durch bis ter Blatt Verkürzung. Daher sollten Sie vor kinematische Analyse der Durchführung der biochemischen Messungen war von entscheidender Bedeutung, um die Daten korrekt zu interpretieren.

Abbildung 4
Abbildung 4: Beispiel für hochauflösenden biochemischen Messungen und Probenahme für fokussierte Analyse (A) Malonaldehyd (MDA) Konzentrationen entlang der Maisblatt Wachstumszone gemessen (unterteilt in zehn Segmente) von Pflanzen angebaut in gut bewässerten Zustand und Pflanzen gegen Trockenheit ausgesetzt. Behandlung 10. Daten sind Mittelwerte ± SE (n = 5). Zwei-Wege-ANOVA wurde als eine statistische Analyse verwendet, und p-Werte werden neben der Diagrammanzeigefeld dargestellt (Faktoren: Trockenheit (d) und das Segment (n)); FW: Frischgewicht. (B) Visualisierung der verschiedenen Wachstumszonen bei der Kontrolle und der Dürre gestressten Pflanzen. Teilungsbereich (D), Dehnungszone (E) undreifen Zone (M). Die Zellen werden 125-fach vergrößert. (C) Cell-Längenprofil der Kontrolle und Dürre behandelten Pflanzen. Daten sind Mittelwerte ± SE (n = 5). (D) Unterschiede in fokussierten Probenahme bei den Kontroll- und Dürre behandelten Pflanzen. Die blauen Kästchen zeigen Entnahmeposition die gleiche Entwicklungsstufe in beiden Behandlungen zu vergleichen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Neben der Möglichkeit zur Bereitstellung der gleichen Entwicklungszonen in hochauflösenden Studien zu vergleichen, kann die kinematische Analyse auch als Grundlage für die gezieltere Analysen verwendet werden, in denen nur Proben von bestimmten Zonen Zellen an der gleichen Entwicklungsstadium enthält, getroffen werden. Wir verglichen die Zellenlänge Profile, durch die Glättung der mikroskopischen Zelllängenmessungen bereitgestellt, in den ersten zehn centimeters von der Blattbasis der Kontrolle und Trockenheit gestressten Pflanzen. 4C zeigt , dass die Zellenlänge Profil verwenden, wir die Länge der Entwicklungszonen bestimmen könnte und auch die Wachstumsrate Dynamik sowohl in der Kontrolle und Trockenheit gestressten Pflanzen folgen konnte. Dies ermöglichte spezifische Probenahme von Zellen im Meristem (vor dem steilen Anstieg), expandierende Zellen in der Dehnungszone (in der Mitte des steilen Anstieg) und junge reifen Zellen in dem reifen Bereich (Beginn des Plateaus) proliferieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass aufgrund der Blatt Verkürzung in Reaktion auf die Trockenheit, diese Zonen in der Kontrolle und in den gestressten Pflanzen nicht entsprach. Um wuchernden zu probieren, den Ausbau und die jungen reifen Zellen in Kontrollpflanzen, mussten wir die ersten, fünften und neunten Zentimeter von der Blattbasis sind. Jedoch in den gestressten Pflanzen entsprechen diese Segmente mit dem ersten, vierten und achten Zentimeter, respectively. Diese Art von fokussierterProbenahme hat sich als nützlich in dem Fall von mehr mühsam, teuer und zeitraubend Studien wie RNA-Sequenzierung, Proteomik, metabolomics erwiesen usw.

Ergänzende Datei . 1: R-Skript für Polynom Glättungsverfahren Bitte rechts klicken Sie auf diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei . 2: Die Berechnung der kinematischen Parameter Bitte rechts klicken Sie auf diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Eine vollständige kinematische Analyse auf Maisblättern ermöglicht die Bestimmung der zellulären Basis des Blattwachstums und ermöglicht die Gestaltung effizienter Probenahmestrategien. Obwohl das Protokoll relativ einfach ist, ist eine gewisse Vorsicht in den folgenden kritischen Schritte empfohlen: (1) Es ist wichtig, die jüngeren, geschlossenen Blätter zu lösen (2.3 Schritt), ohne die meristem zu beschädigen, da meristem Längenbestimmung (Schritt 3) erfordert die vollständige meristem vorhanden sein. Einige der Praxis vorher erforderlich sein könnten. (2) Meristematische Längenbestimmung wird über die Auslegung der mitotischen Zahlen basieren. Aus diesem Grund raten wir, dass innerhalb eines Experiments, die gleiche Person, die diese Messungen Varianz zum Testamentsvollstrecker aufgrund reduzieren leitet. (3) Auch wenn nur zehn Zentimeter für die tatsächliche Zellenlängenmessungen verwendet wird, ist es wichtig, elf Zentimeter zu enthalten, wenn das Segment für die Zelllängenmessungen Ernte (Schritt 2.5), weil der Rand des Segments nicht tutt unterzutauchen immer vollständig in Ethanol und / oder Milchsäure. Daher gewährleistet diese zusätzliche Zentimeter Lichtung der ersten zehn Zentimeter von der Wachstumszone. (4) Am Ende ist es nützlich, die Ergebnisse aller kinematischen Parameter zu überprüfen, um zu bestätigen, dass sie richtig sind. In Tabelle 3 sind beispielsweise die Zellproduktionsrate (P) der Trockenheit gestressten Pflanzen um 71% verringert wurde, oder, mit anderen Worten, P Dürre 0,29 von P - Regelung. Und die Anzahl der Zellen in Meristem, da die Zellproduktion im Durchschnitt Zellteilungsrate (-63% D) hängt (N mer; -20%; 3), kann die folgende verwendet werden , um die Ausgabe zu validieren: P (0,29) ≈ N mer (0,8) x D (0,37). Das gleiche gilt für LER = P x I Matte aufgebracht werden.

Abhängig von den verfügbaren Einrichtungen kann das Protokoll in einigen Schritten verändert werden. (1) Ein mehr eindvanced Alternative für den täglichen manuellen Blattlängenmessungen (Schritt 1.3) basiert auf Lineargeschwindigkeit Wegaufnehmer (LVDT) 13. Sein Vorteil ist, dass es Messungen bei einer viel höheren Zeitauflösung im Bereich von Minuten bis Sekunden ermöglicht. (2) Es ist entscheidend, um die vollständige Wachstumszone während der Probenahme aufzunehmen. Allerdings, Umgebungsbedingungen, Genotyp, Arten und die Entwicklungsstadium geprüft könnte die Länge der Wachstumszone ändern. Daher ist es sinnvoll, eine erste Schätzung der Länge der Wachstumszone in Reaktion auf Ihr Experiment Behandlung zu machen. Dieses Protokoll basiert auf der Inzuchtlinie B73 bei 25 ° C / 18 ° C (Tag / Nacht) bei 300-400 & mgr; Em -2 s -1 gewachsen (Photosynthetic Active Radiation - PAR). (3) Um die Mitosen (Schritt 3.8) ohne Verwendung von Fluoreszenz sichtbar zu machen, eine Fuelgen Fleck 14 angewendet werden kann. (4) Die Glättung der Daten kann auch unter Verwendung eines Fünf-Punkte-qua in MS Excel statt R erfolgendratic passend mit dem "RGP" -Funktion 15.

Eine wichtige Einschränkung dieser Technik ist, dass die gesamte Wachstumszone im stationären Zustand das Wachstum geerntet werden muss. Um Steady-State - Wachstum zu gewährleisten müssen die Pflanzen optimal unter kontrollierten Wachstumsbedingungen gezüchtet werden, weil Schwankungen in der Lichtintensität, Temperatur oder Feuchtigkeit die Blattdehnungsrate 16 beeinflussen. Aus diesem Grund ist die kinematische Analyse weniger geeignet für Pflanzen unter Feldbedingungen angebaut. Ein weiterer Nachteil ist, dass Blätter werden entstanden müssen, was es unmöglich macht, Blätter zu untersuchen, die von älteren Blätter noch eingeschlossen sind. Schließlich wird das Protokoll für monokotyle Spezies mit großen Wachstumszonen umfassend mindestens einigen Zentimetern geeignet. Eine kinematische Analyse auf kleineren Monokotyledonen (beispielsweise Poa, Reis), ist jedoch machbar , sondern braucht einige Modifikationen bei der Probenvorbereitung 17,18.

Eine andere häufig verwendeted Ansatz zur Differential Wachstum Phänotypen zu analysieren ist die klassische Wachstumsanalyse. Diese Analyse quantifiziert ganze Pflanze relativen Wachstumsraten und bestimmt die zugrunde liegende Verteilung der photo abgeleitet Kohlenstoff in eine neue photoBereich und in andere Teile der Anlage 19. Die kinematische Analyse, erlaubt jedoch für ein detaillierteres Verständnis der zugrunde liegenden zellulären Prozesse, die zu Wachstum Phänotypen gekoppelt sind basierend auf der Quantifizierung der Zellteilung und Expansion. Darüber hinaus ist die Möglichkeit, die Länge der einzelnen Wachstumszone ermöglicht die Korrelation der molekularen Messungen entlang der Blattachse auf die spezifischen Entwicklungsstufe zu bestimmen, die durch die Behandlung zu untersuch betroffen ist. Dies ist entscheidend für die Interpretation der Daten. Wenn in der Zeit oder Budget oder wenn interessiert in bestimmten Entwicklungsstadien beschränkt, erlaubt das Ergebnis dieser Analyse für gezielte Probenahme, die Anzahl der erforderlichen Proben für die Analyse zu reduzieren. Abschließend kinematische Analyse ermöglichenStressreaktionen und genetische Variation in Blattwachstum s die Bestimmung von zellulärer Parameter zugrunde liegen und kann sie regulatorische Prozesse zu vor- verknüpfen (Tabelle 2).

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium an der Universität von Antwerpen nach VA unterstützt; ein Promotionsstipendium der flämischen Science Foundation (FWO, 11ZI916N) zu KS; Projektzuschüsse von der FWO (G0D0514N); eine konzertierte Forschungstätigkeit (GOA) Forschungsstipendium: "Ein systembiologischer Ansatz der Blatt Morphogenese" von der Forschungsgemeinschaft der Universität Antwerpen; und das Interuniversitäre Anziehungsschwerpunkte (IUAP VII / 29, MARS), "Mais und Arabidopsis Wurzel und Sprosswachstum" von der Föderale Wissenschaftspolitik (BELSPO) zu GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani und Hamada Abdelgawad alle zum Video beigetragen .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pots Any Any We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate Any Any We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler Any Any An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds Any NA Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel Any Any The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
15 mL falcon tubes Any Any The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes Any Any The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves Any Any Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol Any Any CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98% Any Any CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl) Any Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Any Any CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Any Any This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Any Any Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice Any NA The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide Any Any
Cover glass Any Any
Tweezers Any Any Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. 
Image-analysis software Axiovision (Release 4.8) from Zeiss NA The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software R Foundation for Statistical Computing NA Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script NA NA We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.

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Sprangers, K., Avramova, V., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves. J. Vis. Exp. (118), e54887, doi:10.3791/54887 (2016).

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