Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

كولون-26 سرطان الفأر نموذجا لدراسة سرطان دنف الحاملة للورم

Published: November 30, 2016 doi: 10.3791/54893
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Simon Cancer Center and IUPUI Center for Cachexia Research, Innovation and Therapy, Indiana University School of Medicine

Introduction

هزال العضلات هو من مضاعفات خطيرة من مختلف الحالات السريرية مثل السرطان، وتعفن الدم والكبد وتليف الكبد والقلب والفشل الكلوي، ومرض الانسداد الرئوي المزمن، ومرض الإيدز. على وجه الخصوص، هزال العضلات هو واضح في ما لا يقل عن 50٪ من المرضى الذين يعانون من سرطان 1. فقدان العضلات والهيكل العظمي في نتائج السرطان من زيادة تدهور البروتين بسبب الإفراط في تفعيل الهيكل العظمي عضلة بروتين و / أو من انخفاض تخليق البروتين 6. تحلل الدهون واضح أيضا، مما يؤدي إلى استنزاف الأنسجة الدهنية. ويرتبط سريريا، دنف مع انخفاض الجودة وطول العمر، ويقدر أن يكون سبب الوفاة في 20 - 30٪ من مرضى السرطان 7. ان استخدام النماذج التجريبية التي تشبه الأمراض التي تصيب البشر قدر الإمكان أن يكون مفيدا. يتميز نموذج حيواني الأمثل عن طريق استنساخ عالية، فضلا عن تدخل محدود من العلاجات المختلفة وعوامل لا يمكن التنبؤ بهاالنظام الغذائي والجنس والخلفية الوراثية التي ترتبط عادة مع حالة سريرية 8. حتى الآن، وقد تم دراسة سرطان دنف أساسا في النماذج الحيوانية تتميز زرع الخلايا السرطانية أو حقن المواد المسببة للسرطان، على الرغم من أن الأسلوب الجديد هو استخدام الفئران المعدلة وراثيا عرضة لتطوير مرض السرطان.

الفئران تحمل سرطان C26 (كما يشار إلى القولون-26 وغدية) تمثل نموذجا تتميز جيدا وتستخدم على نطاق واسع من سرطان دنف 2،5. نمو الورم النتائج C26 في الجسم وفقدان الوزن العضلات، وذلك أساسا من خلال تعزيز الدهون والبروتين هدم 9. عموما، يرتبط 10٪ وزن الورم مقابل إجمالي وزن الجسم مع الحد من 20-25٪ في الهيكل العظمي وزن العضلات واستنزاف أكبر من الدهون 3،10. لوحظ تضخم الكبد وتضخم الطحال أيضا مع نمو الورم، جنبا إلى جنب مع تفعيل استجابة المرحلة الحادة وارتفاع المؤيدة للinflaمستويات خلوى mmatory 3،11. ومن بين هؤلاء، فمن المعروف أن IL-6 يلعب دورا محوريا في الوساطة هزال العضلات في نموذج C26، على الرغم من أن هذه خلوى ربما لا يكون محفز الوحيد من دنف 12. مرتفعة IL-6 يسبب ضمور العضلات من خلال تفعيل المسار JAK / STAT3، ويمكن أن تحول دون هذا عامل النسخ منع تلف العضلات 3،4.

خلال هزال العضلات الناجم عن C26، كما هو الحال في كثير من ظروف ضمور العضلات، وفقدان كتلة العضلات إلى حد كبير من خلال تخفيضات في محتوى البروتين في العضلات عبر الألياف العضلية، وليس من خلال موت الخلايا أو فقدان الألياف 13. في C26 دنف، ويلاحظ التحول نحو مناطق أصغر مستعرضة في كل حال السكر والأكسدة الألياف 2. وهذا أيضا يتفق مع انخفاض قوة العضلات 5. وقد اتخذت العديد من الجماعات في جميع أنحاء العالم الاستفادة من نموذج C26 من أجل اكتشاف وسطاء جديدة من تلف العضلات أو الأدوية ذات الصلة سريريا لكاك السرطانhexia. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن العديد من الإجراءات المختلفة لاستخدام هذا النموذج، مما أثار مخاوف بشأن اتساق البيانات التي تم الحصول عليها وتشكل الحواجز التي تحول دون استنساخ في ظروف تجريبية مختلفة. نحن هنا الإبلاغ عن الاستخدام النموذجي لهذا النموذج لدراسة دنف السرطان الذي ينتج بيانات موحدة وقابلة للتكرار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: جميع الدراسات وافقت عليها لجان رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي للجامعة توماس جيفرسون وجامعة إنديانا للطب وصفها.

1. C26 نمو الخلايا وإعداد

  1. الحصول على C26 خلايا سرطان القولون (المركز الطبي لجامعة ولاية أوهايو (OSUMC)) وإعداد متوسط النمو الكامل (Dulbecco أي أعلى مستوى الجلوكوز في التعديل المتوسطة النسر (DMEM) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1 ملم الصوديوم البيروفات، 1٪ الجلوتامين، و 1٪ الستربتومايسين / البنسلين).
    ملاحظة: من أجل السماح أفضل استنساخ بين تجريبي، فمن الأفضل استخدام الخلايا C26 في ممر أدنى مستوى ممكن.
  2. استخدام عداد الخلايا المتاحة تجاريا لوحة 50،000 خلية / سم 2 في قوارير مع متوسط النمو الكامل. احتضان لهم في جو مرطب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى شبه متموجة. تجنب زراعة لهم في كثافة عالية لالسابقالتمايز الأنف والحنجرة والانجراف من الظواهر الخلية.
  3. بعد مرور الأول، لوحة خلايا كافية ليتم زرعها في العدد المقرر من الحيوانات. يوم زرع الخلايا، فصل الخلايا عن طريق trypsinization مع 0.02 مل من 0.25٪ حل التربسين-EDTA لكل سم 2، تحييد التربسين بإضافة ما لا يقل عن 3 مل من متوسطة جديدة لكل مل من التربسين، تحديد تركيز خلية في خلية / مل ، و resuspend عدد الخلايا اللازمة للتجربة (1 × 10 6 خلايا لكل الماوس) في برنامج تلفزيوني العقيمة.
    ملاحظة: الخلايا C26 تصل confluency عندما كثافة حوالي 500000 خلية / سم 2.

2. الفئران

  1. بطريقة عشوائية الكبار CD2F1 الفئران (لا يقل عن 8 أسابيع من العمر) إلى مجموعات (عادة ما يسيطر وورم من حاملي) مع ن على الأقل = 6 لكل مجموعة.
    ملاحظة: تنمو الأورام C26 في BALB / ج الفئران كذلك. ومع ذلك، بناء على خبرتنا، والفئران CD2F1 تمثل مجموعة أكثر تنوعا والاقتصادي لهذا النموذج ورم معين. علاوة على ذلك،على غرار السريرية والنتائج التي أعلن عنها في نماذج تجريبية أخرى من العضلات المرتبطة بسرطان إضاعة 14-16، الفروق بين الجنسين في الاستجابة إلى C26 دنف يمكن أيضا أن تراعى 17 (انظر أيضا الجدول 1).
  2. تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلورين عن طريق الاستنشاق (3٪ في الأكسجين). الحفاظ على الحيوان تحت التخدير حصرا للمرة الضروري إجراء التلقيح الورم. تأكد من الماوس تقع على وسادة ساخنة من أجل منع فقدان حرارة الجسم. قبل البدء في إجراء حقن الورم، وتأكيد التخدير المناسبة عن طريق معسر بلطف أصابع القدم الخلفية.
    ملاحظة: نظرا لمدة هذا الإجراء (عادة بضع ثوان)، لا يتطلب استخدام مرهم العين البيطري. لنفس السبب، وليس من المتوقع أن يخسر وزن الحيوانات السيطرة تمر عملية صورية.
  3. باستخدام العقيمة حقنة الأنسولين 1 مل مع إبرة عيار 26، بسرعة ضخ 250 ميكرولتر من محلول يحتوي على رumor الخلايا تحت الجلد وintrascapularly في لوحة الدهون من الفأرة.
    ملاحظة: سيتم الحيوانات السيطرة يتلقى 250 ميكرولتر من محلول ملحي معقم intrascapularly في لوحة الدهون.
  4. وضع الظهر الحيوان في قفصه. مراقبة مباشرة الماوس مرة واحدة على الأقل كل 15 دقيقة حتى يمكن الرد على التلاعب لطيف واستعاد منعكس المقوم.
    ملاحظة: لا تترك الماوس غير المراقب، والحفاظ عليه في قفص الانتعاش الحار الذي يحتوي على الركيزة الصلبة. وعلاوة على ذلك، لا عودة الماوس إلى غرفة الحيوان حتى تعافى تماما أنه من التخدير. عموما، لا يحتاج إلى أن يضم كل على حدة ما لم يهدف المحقق لتقييم الاستهلاك الغذائي الفردي الفئران. إذا كان هذا هو الحال، واستخدام أقفاص التمثيل الغذائي الآلي غير موجود، يجب إجراء التسجيل اليدوي من استهلاك المواد الغذائية، ربما يوميا، وفي نفس الوقت كل يوم.
  5. تحقق من الفئران يوميا وتسجيل أوزان أجسامهم.
    ملاحظة: تسجيل النتيجة حالة الجسم ويمكن السلوكيات المنزل قفص تفرق درجة من دنف والمرض السلوك، وهو أمر مفيد للدراسات العلاج 18.

3. القتل الرحيم وجمع الدم

  1. عندما تصل الخسارة وزن الجسم في المضيفين الورم مقابل الضوابط 5٪، 10٪، أو 15٪ (دنف خفيفة، معتدلة، وحادة، على التوالي) مقارنة وزن الجسم الأولية، الموت ببطء الفئران.
    ملاحظة: سيتم تنفيذ تجربة نموذجية خارج حتى تصل مجموعة واحدة 10٪ وفقدان الوزن، وهو الوقت على يصرح باستخدامها جميع الفئات. ويتم تقييم الجسم وفقدان الوزن عن طريق قياس وزن الجسم بما في الورم.
  2. ضع الماوس تحت التخدير العام الأيزوفلورين (3٪ في الأكسجين). سحب الدم عن طريق ثقب في القلب (تقريبا 1 - 1.5 مل).
  3. جمع الدم في ك 2 -EDTA (18 ملغ) أنابيب فارغة ووضعها على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في الدم (2000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية) وجمع البلازما / مصل.
  4. الموت ببطء الماوس عن طريق جخلع ervical. انتقل إلى استئصال الأنسجة وجمع الجهاز.

4. الأنسجة والجهاز الختان

ملاحظة: للحصول على استخدام المناديل الورقية في المقايسات البيولوجيا الحيوية أو الجزيئية، ويخطط لوزن كل جهاز والأنسجة ووضع جزء على الفور إلى cryotubes المسمى مسبقا. التقط تجميد في النيتروجين السائل ومخزن في -80 درجة مئوية.

  1. من أجل تجنب تلوث عينات الأنسجة مع الفراء، ورذاذ الايثانول 70٪ على كامل الجسم.
  2. ضع الماوس على سرير التشريح في موقف ضعيف وتمديد أطرافه عموديا عن طريق ربط القدم إلى المشبك سحاحة مرتفعة.
  3. فهم الجلد من الطرف السفلي مع ملقط دومون واستخدام مقص غرامة منحني بلطف لإزالة الجلد واللفافة، وفضح البطون العضلات الكامنة وراء الطرف السفلي.
  4. تحديد عضلة الساق على أقل الخلفي الأطراف التي أصلها في اللقم الجانبية وسطي على عظم الفخذ الخلفية ودخولها فيالعقبي عن طريق العرقوب.
    1. انتقل إلى قطع وتر الساق المفتتة. فهم في نهاية البعيدة للالساق مع ملقط دومون وسحب البطن العضلات نحو مصدره. باستخدام مقص، وقطع العضلات في الأصل أقرب وقت ممكن لعظم الفخذ. وضع العضلات في طبق. يزن على الفور وتجميده في أنبوب في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: تأكد من عدم استئصال العضلة النعلية جنبا إلى جنب مع الساق. وإذا حدث ذلك، إزالة بعناية النعلية عن طريق سحبها بلطف مع ملقط.
  5. الشروع في تحديد واستئصال عضلة ظنبوبية أمامية من أصله على السطح الأمامي الوحشي من الساق ودخولها في المسمارية وسطي عبر وتر لها القاصي.
    1. من أجل الحصول على النفوذ، عقد القدم من خلال استيعاب الأرقام مع السبابة والإبهام. إدراج غيض من ملقط دومون على الفور تحت وتر البعيدة سطحية من الظنبوبي ونقل ملقط بحيث ازجانب الاتحاد الوطني للعمال يمكن استخدامها لفصل البطن الظنبوبي العضلات من النسيج الضام الكامنة.
    2. قطع وتر البعيدة باستخدام مقص منحني غرامة، ثم قطع العضلات في الأصل، في أقرب وقت ممكن في الساق.
  6. فتح تجويف البطن عن طريق إجراء شق سهمي ابتداء من المنطقة تحت المعدة والتحرك متفوق في المنطقة شرسوفي، ووقف شق فقط فوق الحجاب الحاجز.
    ملاحظة: عمق الجرح يجب أن يكون فقط بما فيه الكفاية لاختراق الجدار العضلي في البطن والصفاق البريتوني الكامنة.
  7. إزالة بعناية الكبد عن طريق الامساك بها مع ملقط ذات الرؤوس حادة، واستخدام مقص منحني غرامة لتشريح بعيدا أي الأوعية الدموية أو الأنسجة الضامة التي تلتزم الكبد إلى تجويف. الحرص على عدم ترك أي الفصوص وراء. وزن والمفاجئة تجميد الكبد في أنبوب في النيتروجين السائل.
  8. باستخدام الملقط ذات الرؤوس صريحا، الابتعاد الأمعاء، ومن ثم فضح وبدقة إزالةالطحال. فهم الطحال بلطف مع ملقط ذات الرؤوس كليلة واستخدام الظهر أو الجانب حادة من مقص منحني غرامة لتشريح بعيدا أي نوع من الأنسجة أو الأوعية الدموية الضام الالتزام الطحال إلى تجويف. وزن والمفاجئة تجميده في أنبوب في النيتروجين السائل.
  9. التعرف على منصات الدهون الغدد التناسلية، المتاخمة للالبربخ (في الذكور) أو الرحم (في الإناث). فهم بلطف لوحة بربخي الدهون مع ملقط ذات الرؤوس كليلة وسحب الأنسجة من تجويف. باستخدام مقص منحني غرامة، قطع أي نسيج الغدد التناسلية التي يمكن أن تعلق على لوحة الدهون. وزن لوحة الدهون والمفاجئة تجميده في أنبوب في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: عموما، تعتبر هذه الأنسجة الدهنية ممثل الشاملة كتلة الدهون في الجسم في الفئران وينخفض ​​في الوزن مع دنف. منصات الدهون أخرى يمكن تحديدها على نحو مماثل، تشريح، إزالة، وزنه.
  10. استخدام مقص غرامة المنحنية لفتح الصدر من الحيوان. قطع الأضلاع تعلق على كل من الحدود الجانبية للشارعernum. إزالة القص. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، فهم كل جانب من القفص الصدري وسحب كل جانب أفقيا لفتح التجويف الصدري.
  11. بدقة سحب القلب مع ملقط. بعناية استئصال القلب مع مقص غرامة منحني بقطع الشريان الأورطي في الأذين الأيسر. تأكد من تفريغ الجهاز من أي الدم المتبقي من النشاف ذلك بدقة ضد بعض ورقة ماصة. وزن والمفاجئة تجميده في أنبوب في النيتروجين السائل.

5. تجميد العضلات وتركيب

  1. تزج في النصف السفلي من كوب بلاستيكي صغير (50 مل) تحتوي على نظير البنتان في النيتروجين السائل. ونظير البنتان جاهزة للاستخدام عندما يصبح لزج قليلا ويشكل الصلبة بطانة صفح بيضاء داخل الدورق (درجة الحرارة: -160 درجة مئوية).
    ملاحظة: دائما استخدام nonsparking البرونز أو الألمنيوم الأدوات اليدوية. تجنب استنشاق بخار المنتج. استخدام مع تهوية كافية. إذا تعامل مع تسرب والتهوية مستحيلة أو impracticالقاعدة وارتداء جهاز التنفس الصناعي مناسبة.
  2. تجميد بعض المتوسطة تضمين على تشاك (الفلين) عن طريق غمس لفترة وجيزة (10 ثانية) في نظير البنتان.
  3. التعامل مع العضلات (على سبيل المثال، في الظنبوبي أو الساق) من خلال عقد من قبل الوتر، عموديا بالنسبة إلى الفلين، من أجل الحفاظ على اتجاه الألياف والسماح للالمقاطع العرضية.
  4. وضع بعناية جزء نهاية العضلات جديدة على أعلى من المتوسط ​​التضمين المجمدة.
    ملاحظة: إن العضلات عصا. ومن المهم أن لا تحيط تماما العضلات مع تضمين المتوسطة. ومن المهم أيضا للحفاظ على اتجاه عمودي لقرار لاحق من مساحة المقطع العرضي.
  5. تراجع تشاك مع العضلات المرفقة في حمام نظير البنتان (الوقت المعتاد هو تجميد 7-15 ثانية، اعتمادا على حجم العينة وتكوينها).
    ملاحظة: الغمر في محلول تجميد يجب أن لا تستمر أكثر مما هو مطلوب لتجميد كامل العينة. تجميد طويل جدا إرادة فاركتلح كتلة الأنسجة، في حين وقت قصير جدا سوف يسبب تكوين بلورات الثلج. وهناك عينة المجمدة أيضا أن يكون أبيض طباشيري.
  6. بعد تجميد العينة، وضعه في كيس صغير من البلاستيك أو أنبوب العينة (50 مل)، وعلى الفور تخزينه في الفريزر العميق في -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل.

6. تحليل البيانات الخام

  1. من أجل السيطرة على التغيرات في حجم الفئران، وتطبيع وزن الجسم النهائي (FBW)؛ وزن الجسم خالية من الورم. والذبيحة، الجهاز، ووزن الأنسجة (وأعرب في غرام) وفقا لوزن الجسم الأولي (IBW)، والتعبير عنها ب "وزن / 100 ملغ IBW".
    ملاحظة: بدلا من ذلك، بعض المحققين تطبيع كتلة العضلات لطول الساق.
  2. استخدام البرمجيات لتحليل البيانات. البحث عن المتوسط ​​والتنمية المستدامة للأوزان طبيعية. تحليل احصائى مع تي الاختبارات أونبايريد الطالب بين الضوابط والفئران C26 الحاملة.
    ويمكن عرض نتائج بالنسبة إلى الجسم (IBW ملاحظة: والأوزان FBW) خالية من الورم، والورم، والجهاز، والأنسجة.

7. العضلات باجتزاء

  1. ضبط درجة حرارة الغرفة الداخلية ناظم البرد إلى حوالي -23 درجة مئوية.
  2. السماح للعينة (المخزنة مسبقا في -80 درجة مئوية) للتأقلم على درجة حرارة (يجب أن يكون بضع ساعات كافية).
  3. قطع متعددة 8 ميكرون أبواب سميكة من العينة (ويفضل الأمامية الظنبوبي أو عضلات الساق) وجمعها على الشرائح الزجاجية.
    ملاحظة: قص مقطع في المنطقة منتصف البطن من العضلات. أيضا، من أجل دقة، وقطع الأجزاء عموديا على محور التركيب.
  4. الحفاظ على الشرائح الزجاجية داخل الغرفة ناظم البرد. لا تدع لهم ذوبان الجليد إذا كان الهدف هو القيام IF / دراسات IHC أو تلطيخ الأنزيمية.
  5. تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.

8. تقييم ليف عضلي الحجم التي كتبها Laminin المناعي (البديل 1)

الصورة = "jove_content"> ملاحظة: للحصول على تقييم التشكل العضلات ومساحة المقطع العرضي (CSA)، الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) - نظم فضلا المناعي (IF) يتم قبول أساليب تلطيخ المستندة لتحديد حجم الألياف 19. على الرغم من أن تلطيخ H & E من أقسام العضلات يمثل طريقة قيمة ومريحة لتحليل التشكل، واستخدام نهج IF 14 هو أسرع بكثير وبتواضع أكثر دقة من طريقة المستندة E H &. وصفت وسائل H & E أدناه.

  1. إزالة أجزاء من أنسجة إما ناظم البرد أو -80 ° C تخزين والسماح لهم لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 5-10 دقائق).
    ملاحظة: من أجل تجنب التفاعلات غير محددة ترتبط الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الفئران، فإنه من المستحسن إما الأجسام المضادة استخدام أثيرت في أنواع أخرى أو الاستفادة من مجموعات المتاحة تجاريا "الماوس على الفأر" مناعي.
  2. تزج الأقسام في مرحلة ما قبل باردإد الميثانول (-20 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة.
  3. غسل المقاطع في درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني واستخدام القلم لتطبيقات المناعى لمحاصرة أقسام على الشريحة. لا تدع المقاطع تجف تماما في أي لحظة.
  5. تطبيق عازلة مناسبة الحجب (5-8٪ FBS في برنامج تلفزيوني أو 5٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني) على أقسام لمدة 1 ساعة على RT.
  6. إزالة عازلة تمنع.
  7. تطبيق إما أرنب مكافحة laminin (01:30) أو الماوس لمكافحة الدستروفين (01:30) الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة للأقسام لمدة 2 ساعة على RT (أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية) في غرفة رطبة.
  8. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
  9. إزالة العازلة يغسل ويغسل المقاطع مرة أخرى في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
  10. إزالة غسل العازلة وتطبيق الضد الثانوية الفلورسنت المناسب (1: 1000 في عرقلة العازلة) للأقسام في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة على RT.
  11. إزالة الأجسام المضادة الثانوية، ويغسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5دقيقة.
  12. إزالة غسل العازلة وتكرار غسل مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق. إزالة غسل العازلة وتغطية الأجزاء مع غطاء زجاجي باستخدام وسيلة أساس مائي.
  13. التعرف على ميزات المورفولوجية للالعضلات باستخدام الصور الرقمية القسم الملون. من أجل القيام بذلك، استخدم المجهر ضوء الفلورسنت المقلوب لأنه إذا أقسام (هدف التكبير 10X أو 20X هو المناسب)، جنبا إلى جنب مع الكاميرا والتقاط الصور البرمجيات الرقمية. وضع شريط النطاق في كل صورة رقمية (20 - 30 ينصح الحقول العشوائية لكل قسم العضلات) لتسهيل الكمي من وكالة الفضاء الكندية. يجب حفظ الصور في شكل. TIF لتكون متوافقة مع برنامج تحليل الصور باستخدام برنامج يماغيج.
  14. استخدام ماكرو يماغيج لتمييز الأنسجة الضامة من الأنسجة مقلص (حجم ليف عضلي) من خلال وجود الأجسام المضادة الثانوية فلوري في غمد الليف العضلي (20).
    ملاحظة: لا الماكرو والتعليمات المتاحة من المصادقةأملاح الإماهة الفموية، ريتشارد ليبر وشانون بريمنر.
  15. فتح برنامج يماغيج عن طريق النقر المزدوج على أيقونة على سطح المكتب.
  16. تحميل الماكرو وكالة الفضاء الكندية من خلال النقر مرة واحدة على علامة التبويب "الإضافات". حرك المؤشر لأسفل لتحديد خيار "تثبيت" عن طريق النقر مرة واحدة.
  17. تحميل الماكرو مستعرضة عن طريق اختيار من المجلد تم حفظه في، ثم انقر فوق "فتح".
  18. مرة واحدة تم فتح الماكرو، فتح الصورة النسيجية التي تحتوي على شريط مقياس بالنقر على "ملف" ثم "فتح" من شريط الأدوات يماغيج.
  19. مرة واحدة يتم فتح الصورة، حدد "أداة خط مستقيم" في برنامج يماغيج من خلال النقر على رمز مع خط مستقيم.
  20. مرة واحدة يتم تحديد "أداة خط مستقيم"، انقر مرة واحدة على نهاية الأيسر أكثر من شريط نطاق وثم انقر مرة واحدة على أقصى اليمين نهاية الشريط على نطاق و. عندما يتم بشكل صحيح، يجب أن يكون هناك خط أصفر مضافين على شريط الحجم.
  21. التأكد من أن الاصفرلا يزال مضافين خط ث على شريط الحجم، حدد "تحليل" علامة التبويب من شريط الأدوات يماغيج من خلال النقر مرة واحدة.
  22. في علامة التبويب "تحليل"، حرك المؤشر لأسفل وحدد "على نطاق ضبط" عن طريق النقر مرة واحدة.
  23. في الإطار "تعيين نطاق"، لا تغيير القيمة في "المسافة بالبكسل" مربع. أدخل مسافة معروفة من شريط النطاق في مربع "المسافة المعروفة". تغيير وحدات في صندوق "وحدة طول" لتتوافق مع وحدات شريط النطاق (أي ميكرومتر = ميكرون). وأخيرا، حدد "العالمية" من خلال النقر على مربع على يسار "جلوبل" مرة واحدة.
  24. إغلاق الإطار "تعيين النطاق".
  25. فتح الصورة الأولى التي سيتم قياسها عن طريق الضغط على زر "O" على لوحة المفاتيح. مراقبة نافذة منبثقة التي تسمح للمستخدم لإيجاد واختيار الصورة المراد قياسها من المجلد تم حفظه فيه. حدد الصورة عن طريق النقر عليه مرة واحدة ثم النقر على "فتح".
    26. <لى> فتحت مرة واحدة، يجب أن تظهر نافذة لاختيار نطاق مقبول للمقاييس وكالة الفضاء الكندية ودائرية.
    ملاحظة: عادة ما يتم ترك هذه الإعدادات إلى قيمها الافتراضية. ومع ذلك، إذا كان أحد يرغب في تغيير هذه الإعدادات، تأكد للحفاظ على قيم واحدة لكل صورة متتالية إلى أن تقاس في التجربة.
  26. بعد تحديد نطاق كالة الفضاء الكندية ودائرية، ومراقبة الصورة التي يغطيها بكسل الحمراء مع نافذة "عتبة". ضبط عتبة الصورة باستخدام القضبان في إطار "عتبة" حتى تمتلئ ألياف العضلات بدقة في مع بكسل الحمراء.
    ملاحظة: محاولة للحصول على أكبر عدد من الألياف التي لا يتم لمس بعضهم البعض. إذا الألياف هي مؤثرة، فإنها سوف يقاس كما الألياف واحد كبير، والتي سوف تحتاج إلى أن تعدل المصب.
  27. بعد تحديد العتبة، اضغط على زر "1" على لوحة المفاتيح لقياس الألياف العضلية.
  28. دائرة ألياف العضلات الفردية مع خط أصفر.التحرك من خلال الصورة وإزالة القطع الأثرية أو الألياف المزدوجة التي تم اختيارها من قبل البرنامج. للقيام بذلك، حدد الهياكل التي ليست الألياف عن طريق النقر عليها مرة واحدة، ثم اضغط على زر "D" على لوحة المفاتيح. هذا وسوف حذفها من القياسات.
  29. تحديد ونسخ القياسات من "نافذة قيمة القياس،" ولصقها في جدول بيانات لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن القيم التي تم الحصول عليها يمكن استخدامها لتقييم تحليل توزيع الألياف، والتي تمثل عموما معلمة مفيدة لتحديد ما إذا كان نمو الورم يعزز التحول نحو ألياف العضلات الصغيرة.
  30. إغلاق كافة النوافذ المفتوحة في ImageJ بالضغط على "X" في الزاوية العلوية اليسرى من النوافذ.
  31. فتح صورة جديدة للقياس عن طريق الضغط على "O" وبتكرار الخطوات 8،24-8،29.

9. تقييم ليف عضلي الحجم من H & E الملون أقسام (البديل 2)

  1. وضع الزجاجالشرائح في الجرار Coplin تحتوي على تصفية هاريس الهيماتوكسيلين لمدة 8 دقائق.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، ماير الهيماتوكسيلين يمكن أن تستخدم إذا كان المطلوب هو وصمة عار أقل كثافة.
  2. شطف الشرائح في الماء منزوع الأيونات.
  3. تراجع الشرائح في ماء الصنبور لمدة تصل إلى 5 دقائق.
  4. شطف بسرعة في الماء منزوع الأيونات، ثم احتضان لهم في تصفية حل يوزين 1٪ لأقل من 2 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كان المطلوب هو وصمة عار أكثر كثافة، إضافة 1-2 قطرات من حامض الخليك (0.01٪ أو أقل) في حل يوزين.
  5. بدء الخطوات الجفاف. شطف الشرائح في الايثانول 70٪ لأقل من 1 دقيقة.
  6. تراجع الشرائح في 90٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
  7. تراجع الشرائح في الايثانول 95٪ لمدة 1 دقيقة.
  8. تراجع الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة.
  9. تراجع الشرائح في الزيلين لمدة 2 دقيقة. نقل الشرائح إلى جرة كوبلي آخر يحتوي على زيلين جديدة لمدة 2 دقيقة أكثر.
    ملاحظة: الحفاظ على الشرائح في الزيلين (لا تزيد عن 1 ساعة) حتى يتم coverslipped فيها.
  10. وضع coversliملاحظة على أقسام العضلات باستخدام Permount أو المتوسطة المستندة إلى تصاعد الزيلين من الاختيار.
  11. مراقبة الشرائح الزجاجية H & E الملون تحت المجهر مع التكبير 20X، والحصول على صور للمنطقة الباب العضلات بأكملها. الحصول على الصور باستخدام المجهر مشرق ضوء، والكاميرا الرقمية، وبرامج التقاط الصور.
    ملاحظة: وجود شريط النطاق أو صورة ميكرومتر التي اتخذت في نفس التكبير سوف تكون هناك حاجة لتحديد وكالة الفضاء الكندية. وكما ذكر أعلاه، سجل لا يقل عن 20 - 30 حقول عشوائية لكل قسم العضلات.
  12. تقييم حجم ليف عضلي باستخدام برنامج ImageJ. فتح كل صورة رقمية. تعيين المقياس على النحو الوارد أعلاه. قياس 1،500-2،000 على الأقل الألياف العضلية في العضلات باستخدام أداة التحديد اليدوي، تتبع محيط من الألياف مع الماوس أو لسرعة الإدخال، مع جهاز لوحي المدخلات والقلم.

10. جمع وتحليل البيانات

  1. من أجل إقامة حجم الألياف العضلية، وتقييم متوسط ​​الألياف المنطقة "."حساب الوسائل والتنمية المستدامة للقياسات التي تم الحصول عليها لكل العضلات، بما في ذلك المنطقة وقطرها فيريه و. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل تقييم ما إذا كان يرتبط الإعداد التجريبية مع التحول نحو الألياف إما أصغر أو أكبر العضلات، وتحليل" توزيع الألياف ".
  2. تقييم أهمية النتيجة عن طريق إجراء أونبايريد T-اختبار للمجموعتين. تحديد نسب بين القيم التي تم الحصول عليها عن مجموعة الفئران C26 ولمجموعة المراقبة. رسم القيم على الرسم البياني الإبلاغ عن SD الوسائل وتيرة توزيع / الرسم البياني تستهدف مما يدل على تحول في أحجام الألياف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تظهر C26 حركية نمو الورم في مرحلة متخلفة لأول 7-8 د بعد الحقن، يليه نمو الخلايا الأسي (4-5 د). كتلة الورم تصل في نهاية المطاف ~ 10٪ من وزن الجسم (حوالي 2 غرام؛ الشكل 1A-B). خلال المرحلة الأولى، الورم يمكن أن يكون موجودا من قبل ملامسة فقط، ويظهر على شكل نتوء صغير من الجلد. في المرحلة الثانية، ويلاحظ الورم ككتلة تحت الجلد. نادرا، الورم يصبح متقرحة، مما أدى إلى جرح مفتوح. في هذه الحالة، يتم استبعاد الماوس من المجموعة التجريبية والموت الرحيم إنسانية.

وزن الجسم لم يتغير في المرحلة الأولى، ولكن يتم تقليل بشكل ملحوظ في المرحلة الثانية، عندما يصل إلى 10-15٪ من وزن الجسم الأولي (30٪ في حالة الوزن خالية من الورم، الشكل 1A). الفئران الورم الحاملة يبدو يضيع وأظهر الفراء أشعث في نهاية الفترة التجريبية، مع حالة الجسم (قبل الميلاد) يسجل تساوي 1 18 (الشكل 1C). يمثل BC1 الماوس الهزال الشديد، حيث الهياكل العظمية واضحة وفقرات ومجزأة واضح. يتم احتساب الجسم وفقدان الوزن بشكل رئيسي لمن قبل كل من الهيكل العظمي تلف العضلات والدهون الأنسجة (الشكل 1B). فقدان وزن الجسم تتفق مع خفض حوالي 20 - 30٪ في الهيكل العظمي وزن العضلات، ولا سيما في الساق، الظنبوبي الأمامي، وعضلات الفخذ (الشكل 2). كما خفضت عضلة القلب بشكل ملحوظ في الوزن، وإن كان بدرجة أقل بالمقارنة مع عضلات الهيكل العظمي الأخرى (الشكل 2). تم الكشف المثير للاهتمام، تضخم الكبد (+ 16٪، ف <0.01)، وتضخم الطحال (+ 110٪، ف <0.01) عموما في المضيفين الورم، في حين أن كتلة الدهون، على غرار الهيكل العظمي والعضلات، واستنزفت (-70٪، ف <0.001 ؛ الشكل 3).

جنرال الكتريك = "1"> الهيكل العظمي فقدان الوزن العضلات هو أيضا بما يتفق مع وبما يتناسب مع انخفاض في حجم الألياف العضلية، كما لوحظ بعد تقييم المورفولوجية للألياف العضلات وكالة الفضاء الكندية عن طريق وسيلة IF (الشكل 4A-B). على وجه الخصوص، أظهر تحليل التوزيع التكراري التحول نحو الألياف الصغيرة الحجم في C26 الحاملة الفئران، مما يشير إلى أن العضلات كلها تخضع ضمور في وجود ورم C26 (الشكل 4C). نتائج مماثلة يمكن ملاحظتها من خلال الاستفادة من منهجية التقليدية القائمة E-H & لتقدير حجم الألياف، على الرغم من أن حجم التغيير في وكالة الفضاء الكندية العضلات المرتبطة مع نمو السرطان يختلف قليلا (38٪ مقابل السيطرة، P <0.01 لIF طريقة المستندة؛ -18٪ مقابل السيطرة، ف <0.01 لأسلوب المستندة إلى E & H، الشكل 5).

شكل 1
الشكل 1: أوزان الجسم في السيطرة والفئران C26 الحاملة. أ) منحنى وزن الجسم في السيطرة والمضيفين C26 خلال الفترة التجريبية بأكملها (14 يوما بعد حقن الورم). ب) الأولي من وزن الجسم (IBW)، النهائي خالية من الورم وزن الجسم (FBW)، ووزن الورم في السيطرة وC26- الحيوانات تحمل. C) الصور التمثيلية للضوابط وC26 حاملي وقت التضحية (اليوم 14 بعد التلقيح ورم). يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ​​SD. ن = 6. أهمية الاختلافات: * P <0.05، ** ف <0.01 ***، ف <0.001 مقابل المجموعة الضابطة باستخدام اختبار (ت) الطالب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الأوزان العضلات في مراقبة وCالفئران الحاملة لل26. ويقال إن الظنبوبي، الساق، الفخذ، والأوزان القلب في السيطرة وC26 ورم حاملي حيث الوزن / 100 ملغ IBW. يتم التعبير عن البيانات كما يعني SD. ن = 6. أهمية الاختلافات: ** ف <0.01 و*** ع <0.001 مقابل المجموعة الضابطة باستخدام اختبار (ت) الطالب.

الشكل (3)
الرقم 3: الأوزان الجهاز في الرقابة وC26 محامل الفئران الكبد، يتم الإبلاغ عن الطحال، وبربخي الأوزان منصة الدهون في السيطرة وC26 ورم حاملي حيث الوزن / 100 ملغ IBW. يتم التعبير عن البيانات كما يعني SD. ن = 6. أهمية الاختلافات: ** ف <0.01 مقابل السيطرة على المجموعة.

الشكل (4)
الشكل (4): قياس الأشكال عن ليف عضلي الحجم التي كتبها المناعي. أ) رد الفعل المناعى نيون أقسام الظنبوبي استخدام أجسام مضادة لمكافحة الدستروفين (ناقلات مختبرات) من السيطرة والمضيفين C26. التكبير: 10X. شريط الحجم: 100 ميكرون B) الكمي من وكالة الفضاء الكندية في العضلات الظنبوبي قياس مع توزيع الترددات يماغيج ماكرو C) من وكالة الفضاء الكندية في العضلات الظنبوبي السيطرة والفئران C26 الحاملة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ​​± SD. ن = 6 لكل مجموعة. أهمية الاختلافات: ** ف <0.01 مقابل السيطرة على المجموعة باستخدام اختبار (ت) الطالب.

الرقم 5
الرقم 5: قياس الأشكال عن ليف عضلي الحجم التي كتبها H & E. أ) الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ أقسام الظنبوبي من السيطرة والمضيفين C26. التكبير: 20X. شريط الحجم: 100 ميكرون B) الكمي وتيرة توزيعوكالة الفضاء الكندية في العضلات الظنبوبي. يتم التعبير عن البيانات كما يعني SD. ن = 6. أهمية الاختلافات: *** ع <0.001 مقابل المجموعة الضابطة باستخدام اختبار (ت) الطالب.

الكتاب سلالة الماوس بين الجنسين الماوس رقم الخلوي الأصل مزروع كما الأورام الصلبة؟ موقع الحقن أيام
عازر وآخرون، 1999 CD2F1 M 5 × 10 5 NCI لا المنطقة الظهرية 17
المجيد ومكارثي، 2001 CD2F1 F 2.5 × 10 6 OSUMC لا المنطقة الظهرية 17
صامويل وآخرون، 2001 BALB / ج M 0.5 غرام / مل من تعليق ورم NS نعم فعلا المنطقة الظهرية ما يصل الى 11
Acharyya وآخرون، 2004 CD2F1 M 1 × 10 7 OSUMC لا الجهة اليمنى ما يصل الى 24
Aulino وآخرون، 2010 BALB / ج NS 0.5 ملم 3 NCI نعم فعلا المنطقة الظهرية 21
بيني-KLIMEK وآخرون، 2010 CD2F1 F 1 × 10 6 OSUMC لا المنطقة الظهرية 14
Bonetto وآخرون، 2011؛ 2012 CD2F1 F 1 × 10 6 OSUMC لا المنطقة الظهرية
كوسبر وLeinwand 2010 CD2F1 M + F 5 × 10 5 NS لا الجهة اليمنى ما يصل الى 27
مورفي وآخرون، 2012 CD2F1 NS 5 × 10 5 NCI / OSUMC لا المنطقة الظهرية 14
كورنويل وآخرون، 2014 CD2F1 M 5 × 10 5 NCI لا الحق والجناح الأيسر ما يصل الى 26
عاصي وآخرون، 2016 BALB / ج NS 1 × 10 6 خدمة الخط الخلوي لا المنطقة الظهرية ما يصل الى 22

الجدول 1: مقارنة بين البروتوكولات المختلفة المستخدمة لC26 زرع مختلفاوتقدم بروتوكولات ر لC26 زرع، مع إشارة خاصة إلى سلالة الماوس المستخدمة، وعدد الخلايا ونوع الورم تلقيح، وأصل الخلية، موقع الحقن، وطول الفترة التجريبية. OSUMC: المركز الطبي لجامعة ولاية أوهايو. NCI: المعهد الوطني للسرطان. التجاري خدمة خط الخلية NS: غير محدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خصوصا في آخر مراحله، ويرتبط سرطان القولون والمستقيم مع تطور دنف، وهي المسؤولة عن النتائج وتخفيضات في نوعية حياة المريض الفقيرة. وقد ركزت العديد من الدراسات على علاج الحالات الثانوية للسرطان. ومع ذلك، على الرغم من جهود عديدة في هذا الاتجاه، لا يوجد حتى الآن علاج المعتمد لسرطان دنف 21. وبالتالي، فمن الضروري أن نماذج حيوانية تشبه علم الأمراض البشرية إلى أقصى حد ممكن من أجل تحقيق أقصى قدر من ترجمة نتائج.

C26 الفئران الحاملة للورم هي نموذج تجريبي شيوعا من سرطان دنف 22-24. هذا نموذج يشبه الأمراض التي تصيب البشر، والتي تبين تخفيضات في الجسم والعضلات، وكتلة الدهون، وكذلك العضلات الألياف ضمور وزيادة التعبير عن الجينات الالتهابية وligases اليوبيكويتين متسقة مع البروتين ملحوظ فرط التقويض 2،5. على الرغم من ذلك، عدد قليل من التفاوت مع البيانات التي تم الحصول عليها في patie السرطانتم الإبلاغ عن اليلة 25،26. في الواقع، بعض ملامح هذا النموذج، بما في ذلك البيئة نمو غير الفسيولوجية (على سبيل المثال، وهو ورم خارج الرحم نمت تحت الجلد بدلا من orthotopically زرعها في الجهاز الهضمي)، وفترة تجريبية قصيرة نسبيا مقارنة مع نماذج أخرى (على سبيل المثال، حقن الجيني أو مثلي من أورام)، والاعتماد على IL-6 العمل، واستخدام الضروري من CD2F1 أو BALB / ج الفئران قد تمثل قيود صارمة، ويمكن أن تحد من تفسير النتائج.

وقد ثبت أن البروتوكول الحالي لتكون قابلة للتكرار للغاية في العديد من التجارب التي أجريت في المختبر لدينا، والحفاظ على نفس الخصائص والسماح المقارنات بين النتائج التي تم الحصول عليها في أوقات مختلفة، في مواقع جغرافية مختلفة، ومختلف الباحثين 3،10. ومع ذلك، من أجل تعزيز استنساخ البيانات، فمن المهم وضع مبادئ توجيهية واضحة ومشتركة.

كما gathereد من الأدب، وعدة محاذير قد تمنع إعادة إنتاج نفس البيانات في معملين مختلفين. وللأسباب ذاتها، واستخدام بروتوكولات مختلفة قد تؤدي الظواهر المختلفة والنتائج، وكذلك يؤدي إلى نتائج متضاربة ومشكوك فيها. في الواقع، تم الإبلاغ عن الاختلافات في أداء هذا النموذج الحيواني، مما أدى أساسا من سلالة (BALB / ج أو CD2F1) 2،5،27-29 أو جنس الفئران المستخدمة 17، ونوع الورم الذي تم زرعها (تعليق خلية 3 29 بدلا من الأورام الصلبة في الكسب غير المشروع 2،30)، ومصدر الورم (NCI، ATCC، أو OSUMC)، وعدد الخلايا C26 التي تم حقنها، وموقع الحقن أو غرس (الجناحين 6،17، 31 أو المنطقة الظهرية 3،10،32). وقد سبق إجراء أي مقارنة مباشرة للآثار المرتبطة زرع خطوط الخلايا C26 تم الحصول عليها من مصادر مختلفة (أساسا OSUMC مقابل NCI)، مما يمنعنا من رسم أي conclusi نهائيالإضافات. ومع ذلك، فمن المرجح أن اختيار مصدر للخلايا ويمكن أيضا أن تؤثر بشكل كبير على النتائج المتوقعة. عند النظر في اختيار الذكور مقابل الإناث، ينبغي تذكير المحققين من اختلافات كبيرة في النتائج. في الواقع، كما ذكرت من قبل كوسبر وLeinwand 17، الذكور الفئران الحاملة للورم، وذلك بسبب عدم وجود هرمون الاستروجين، قد تظهر النمط الظاهري أكثر شدة من الإناث، بما في ذلك زيادة فقدان كتلة القلب والوفيات، واستجابة أكثر قوة الموالية للالتهابات للورم ، وزيادة الالتهام الذاتي القلب.

خصوصا بالنسبة لأولئك المحققين التي لم تكن مألوفة مع هذا النموذج وقد تواجه في البداية مشاكل، على أساس كل من تحليل القوة وخبرتنا السابقة، واستخدام لا يقل عن 6 الحيوانات في حالة تجريبية (ن = 6) يستحسن من أجل الكشف عن إحصائيا فروق ذات دلالة إحصائية. ومن الأهمية بمكان أيضا أن التوزيع العشوائي يتم تنفيذ بعناية، بحيث وزن الجسم الأولية في حيوانات التجاربلم تختلف كثيرا بين المجموعات. وبالمثل، فإنه ينصح أن، من أجل تجنب تقلب بين المشغل، نفس محقق أداء جمع الأنسجة والأعضاء على كل الحيوانات. وعلاوة على ذلك، لا بد من أن الأنسجة (خاصة العضلات) يتم تجميد بأسرع وقت ممكن من أجل الحفاظ على الرنا وهيكل الأنزيمية والنشاط، وخاصة إذا كان الهدف من هذه الدراسة هو تقييم التعبير الجيني أو لتقييم الأنشطة الإنزيمية. وعلاوة على ذلك، في محاولة لتحديد CSA العضلات، وأظهرنا أن الإبلاغ المنطقة الألياف مقبولة وممثل من حجم الألياف العضلية بشكل عام. هنا، نقدم طريقتين متميزة لتقييم وكالة الفضاء الكندية العضلات. كما هو مبين في الشكلين 4-5، وكانت كلتا الطريقتين قادرة على الكشف عن انخفاض كبير في حجم ليف عضلي بين الضوابط والمضيفين الورم، على الرغم من أن درجة إضاعة ظهرت مختلفة.

قد يؤدي هذا التناقض من حقيقة أنه، على الرغم من أن كلتا الطريقتين هي طرق مقبولة لتقويمعضلة حجم الألياف، وتحديد خصائص العضلات من الشرائح H & E الملون ولا تزال عملية يدوية أو نصف آلية، في معظم الأحيان كثيفة العمالة، تستغرق وقتا طويلا، وتتأثر دقة محدودة. استنادا إلى تجربتنا، نحن نعتقد أن الطريقة القائمة على IF-هو أسلوب أكثر دقة لتقرير وكالة الفضاء الكندية العضلات. في الواقع، فإن عدد الألياف التي يمكن قياسها تلقائيا من خلال الاستفادة من هذه التقنية هو أكبر بكثير، مما يزيد من دقة القياس. وتجدر الإشارة، على كل من التقنيات، طريقة بديلة من حجم العضلات التقارير بتقييم قطر في فيريه و. ومن المثير للاهتمام، وهذا يعتبر أداة موثوقة جدا يرجع ذلك إلى حقيقة أن هذه المعلمة هي مستقلة إلى حد كبير من زاوية باجتزاء. غيرها من المعالم، مثل "القطر الداخلي الحد الأدنى" و "القطر الخارجي الحد الأدنى" هي أيضا حساسة لطائرة من باجتزاء ويمكن استخدامها بدلا من قطرها فيريه باعتبارها مؤشرات بديلة لأكذوبةحجم إيه.

في الختام، على الرغم من أن المجتمع دنف يحتاج بوضوح إلى إنشاء نماذج أكثر الفسيولوجية لدراسة المصاحبة للورم تلف العضلات، ونحن نعتقد أن الفئران التي تحمل سرطان القولون C26 تمثل نموذجا جيدا موحدة وسهلة الاستخدام لتحقيق التعديلات الجزيئية و مشاكل وظيفية الكشف عن عادة بعد حدوث الورم. وسوف تشمل التطبيقات المستقبلية التحقيق في ما إذا كان زرع مثلي الخلايا C26 في القولون قد تمثل نموذجا السليم وأكثر الفسيولوجي للدنف سرطان القولون والمستقيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Flasks Falcon - Becton Dickinson 35-5001
DMEM Cellgro 10-017-CV
FBS Gibco 26140
Streptomycin-Penicillin  Cellgro 30-002-CI
CD2F1 mice Harlan 060
Anesthesia apparatus EZ-Anesthesia EZ-7000
2-Methyl Butane Sigma-Aldrich M32631
OCT Tissue-Tek 4583
Cryostat Leica CM1850
Cork disks Electron Microscopy Sciences 63305
Superfrost plus glass slides VWR 48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody Vector Laboratories VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG Life Technologies A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG Life Technologies A21211
Hematoxylin Sigma-Aldrich GHS216
Eosin Sigma-Aldrich HT110332
Xylene Acros Organics 422680025
Cytoseal-XYL Thermo 8312-4
Microscope Zeiss Observer.Z1 
Bamboo Tablet Wacom CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011 Microsoft Corp.
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer BD 365873

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
  2. Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
  3. Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
  4. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
  5. Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
  6. Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
  7. Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
  8. Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
  9. Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
  10. Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
  11. Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
  12. Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
  13. Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
  14. Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
  15. Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
  16. Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
  17. Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
  18. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
  19. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
  20. Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
  21. Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
  22. Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
  23. Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
  24. Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
  25. Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
  26. Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
  27. Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
  28. al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
  29. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
  30. Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
  31. Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
  32. Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 117، السرطان، الهزال، دنف، sarcopenia، القولون-26، الهيكل العظمي وضمور العضلات، وهدم العضلات، والسيتوكينات، قياس الأشكال، myofibers، تشريح، النماذج الحيوانية
كولون-26 سرطان الفأر نموذجا لدراسة سرطان دنف الحاملة للورم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bonetto, A., Rupert, J. E., Barreto, … More

Bonetto, A., Rupert, J. E., Barreto, R., Zimmers, T. A. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (117), e54893, doi:10.3791/54893 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter