Introduction
Muskelsvind er en alvorlig komplikation af forskellige kliniske tilstande, såsom cancer, sepsis, lever, skrumpelever, hjerte og nyresvigt, kronisk obstruktiv lungesygdom, og AIDS. Især muskelsvind er tydeligt i mindst 50% af patienter med cancer 1. Tab af skeletmuskulatur i kræft resultater fra øget proteinnedbrydning på grund af over-aktivering af skelet muskler proteolytiske systemer og / eller fra nedsat proteinsyntese 6. Lipolyse er også tydeligt, hvilket fører til nedbrydning af fedtvæv. Klinisk kakeksi er forbundet med nedsat kvalitet og længden af livet og skønnes at være årsag til dødsfald i 20 - 30% af kræftpatienter 7. Anvendelse af eksperimentelle modeller, der ligner den humane sygdom så tæt som muligt ville være gavnligt. En optimal dyremodel er kendetegnet ved høj reproducerbarhed, samt ved begrænset interferens fra forskellige terapier og uforudsigelige faktorerkost, køn, og genetisk baggrund, der normalt er forbundet med den kliniske tilstand 8. Hidtil har cancer kakeksi undersøgt hovedsagelig i dyremodeller karakteriseret ved transplantation af cancerceller eller injektion af kræftfremkaldende stoffer, selv om en ny metode er at bruge genetisk modificerede mus er modtagelige for udvikling af kræft.
Mus med C26 carcinom (også omtalt som kolon-26 og adenocarcinom) repræsenterer en velkarakteriseret og ekstensivt anvendte model af cancer kakeksi 2,5. Væksten af C26 tumor resultater i krop og muskler vægttab, primært gennem øget fedt og protein katabolisme 9. Generelt er en 10% tumor vægt versus samlede kropsvægt forbundet med en reduktion på 20-25% i skeletmuskulatur vægt og en større udtømning af fedt 3,10. Hepatomegali og splenomegali også observeret med tumorvækst, sammen med aktiveringen af den akutte fase respons og højden af pro-inflationsmåletmmatory cytokinniveauer 3,11. Blandt disse er det velkendt, at IL-6 spiller en central rolle i mediering muskelsvind i C26-modellen, selv om dette cytokin er sandsynligvis ikke den eneste inducer af kakeksi 12. Forhøjet IL-6 forårsager muskelatrofi gennem aktivering af JAK / STAT3-vejen, og inhibering denne transskriptionsfaktor kan forhindre muskelsvind 3,4.
Under C26-induceret muskelsvind, som i mange betingelser for muskelatrofi, er muskelmasse tabt hovedsagelig gennem reduktioner i muskel protein indhold på tværs muskelfibre, ikke gennem celledød eller tab af fibre 13. I C26 kakeksi, er et skift i retning af mindre tværsnitsareal observeret i både glycolytiske og oxidative fibre 2. Dette er også i overensstemmelse med reduceret muskelstyrke 5. Mange grupper verden over har draget fordel af C26 model for at opdage nye mediatorer af muskelsvind eller klinisk relevante lægemidler til kræft cacHexia. Imidlertid er der rapporteret mange forskellige procedurer for brugen af denne model, at hæve bekymringer om konsistensen af de opnåede data og udgør hindringer for reproducerbarhed i forskellige eksperimentelle betingelser. Her rapporterer vi en typisk brug af denne model for studiet af kræft kakeksi, der giver standardiserede og reproducerbare data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Alle undersøgelser, der er beskrevet blev godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg i Thomas Jefferson University og Indiana University School of Medicine.
1. C26 cellevækst og Forberedelse
- Opnå C26 colorektale cancerceller (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) og forberede komplet vækstmedium (dvs. høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 1% glutamin og 1% streptomycin / penicillin).
BEMÆRK: For at muliggøre bedre inter-eksperimentelle reproducerbarhed, foretrækkes det at anvende C26-celler ved en passage så lav som mulig. - Brug et kommercielt tilgængeligt celletæller til pladen 50.000 celler / cm2 i kolber med komplet vækstmedium. Inkuber dem i en fugtig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO2, indtil sub-sammenflydende. Undgå dyrkning dem ved høj tæthed til Tidligereent differentiering og drivende af celle fænotyper.
- Efter den første passage, til plade nok celler implanteres i det planlagte antal dyr. På dagen for celleimplantation, dissociere cellerne ved trypsinisering med 0,02 ml 0,25% trypsin-EDTA-opløsning pr cm2, neutralisere trypsin ved tilsætning af mindst 3 ml frisk medium pr ml trypsin, bestemme cellekoncentration i celler / ml og resuspender antallet af celler, der er nødvendige til forsøget (1 x 10 6 celler per mus) i sterilt PBS.
BEMÆRK: C26 cellerne når sammenflydning, når densiteten er ca. 500.000 celler / cm2.
2. Mus
- Tilfældig voksne CD2F1 mus (mindst 8 uger gamle) i grupper (sædvanligvis styrer og tumor-bærere) med mindst n = 6 pr gruppe.
BEMÆRK: C26 tumorer vokser i Balb / c mus samt. Men baseret på vores erfaringer, CD2F1 mus repræsenterer en mere alsidig og økonomisk vært for denne særlige tumor model. Endvideresvarer til de kliniske omgivelser og til resultater, der rapporteres i andre forsøgsmodeller af cancerassocieret muskelsvind 14-16, kan kønsforskelle i respons på C26 cachexia også observeres 17 (se også tabel 1). - Bedøver musen ved hjælp isofluran ved indånding (3% i ilt). Opretholde dyret under anæstesi udelukkende til den nødvendige tid til at udføre tumoren podning. Kontroller, at musen ligger på en opvarmet pude for at forhindre tab af kropsvarme. Før du starter injektionsproceduren tumor, bekræfter korrekt bedøvelse ved forsigtigt at klemme de bageste tæer.
BEMÆRK: På grund af varigheden af denne procedure (generelt et par sekunder), er anvendelsen af veterinære øjensalve ikke påkrævet. Af samme grund er kontroldyr undergår proformaoperationsgruppen forventes ikke at tabe. - Ved hjælp af en steril 1 ml insulinsprøjte med en 26-gauge nål, hurtigt injiceres 250 pi af opløsningen indeholdende tumor celler subkutant og intrascapularly i fedt pad af musen.
BEMÆRK: kontroldyr modtager 250 pi steril saltvandsopløsning intrascapularly i fedt pad. - Sende dyret tilbage i buret. Direkte observere musen mindst en gang hver 15 min, indtil den kan reagere på blid manipulation og har genvundet en oprettende refleks.
BEMÆRK: Lad ikke musen uden opsyn, og holde det i en varm opsving bur, der indeholder et fast underlag. Desuden skal du ikke returnere musen til dyret rummet, indtil den er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi. Generelt har mus ikke behøver at være individuelt opstaldet medmindre investigator har til formål at vurdere individuelle fødeindtagelse. Hvis dette er tilfældet, og anvendelse af automatiserede metaboliske bure er ikke tilgængelig, skal udføres manuel registrering af fødeindtagelse, eventuelt dagligt og på samme tidspunkt hver dag. - Kontroller musene dagligt og registrere deres kropsvægt.
BEMÆRK: Optagelse af huld ogbur adfærd kan differentiere grader af kakeksi og sygdom adfærd, som er nyttig til behandlingsstudierne 18.
3. Eutanasi og Blood Collection
- Når kroppen vægttab i tumoren værter forhold til kontroller når 5%, 10% eller 15% (mild, moderat og svær kakeksi,) sammenlignet med deres oprindelige kropsvægt, aflive musene.
BEMÆRK: En typisk eksperiment vil blive foretaget indtil en gruppe når 10% vægttab, hvorpå tid alle grupper aflives. Vægttab vurderes ved måling af kropsvægten inklusive tumoren. - Placer musen under isofluran generel anæstesi (3% i oxygen). Trække blod ved hjælp af en hjertepunktur (ca. 1 - 1,5 ml).
- Opsaml blod i K 2 EDTA (18 mg) tomme rør og placere dem på is. Centrifuger blodet (2.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C) og indsamle plasma / serum.
- Aflive musen ved hjælp af cervical dislokation. Fortsæt til væv excision og orgel kollektion.
4. væv og organer Excision
BEMÆRK: Anvendelse af væv i biokemiske eller molekylærbiologiske analyser, har planer om at afveje de enkelte organer og væv og placere et fragment straks ind i pre-mærket kryorør. Snap fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
- For at undgå kontaminering af vævsprøver med pels, spray 70% ethanol over hele kroppen.
- Placer musen på en dissektion seng i en liggende stilling og udvide en lemmer lodret ved at fastgøre foden til en forhøjet burette klemme.
- Tag fat i huden på benet med Dumont pincet og bruge de buede fine sakse til forsigtigt fjerne huden og fascia, udsætter de underliggende muskel maver af benet.
- Identificer gastrocnemius musklen på den bageste nedre lemmer ved sin oprindelse i det laterale og mediale condyler på bageste femur og dets indsættelse påcalcaneus via hasesenen.
- Fortsæt til skære gastrocnemius hasesenen. Forstå den distale ende af gastrocnemius med Dumont pincet og træk muskelbugen mod dens oprindelse. Med en saks, klippe musklen ved oprindelsen så tæt som muligt til lårbenet. Placer musklen i en skål. Veje det samme og fryse det i et rør i flydende nitrogen.
BEMÆRK: Sørg for ikke at udskære soleus musklen sammen med gastrocnemius. Hvis det sker, forsigtigt fjerne soleus ved forsigtigt at trække det ud med pincet.
- Fortsæt til skære gastrocnemius hasesenen. Forstå den distale ende af gastrocnemius med Dumont pincet og træk muskelbugen mod dens oprindelse. Med en saks, klippe musklen ved oprindelsen så tæt som muligt til lårbenet. Placer musklen i en skål. Veje det samme og fryse det i et rør i flydende nitrogen.
- Fortsæt til identificere og udskære tibialis anterior muskel fra dens oprindelse på den anterolaterale overflade af skinnebenet og dets indsættelse på den mediale kileskrift via sin distale senen.
- For at få indflydelse, holde foden ved at tage fat cifrene med pegefingeren og tommelfingeren. Sæt spidsen af Dumont pincet umiddelbart under det overfladiske distale senen af tibialis og flytte pincet, således at blUNT side kan anvendes til at frigøre tibialismuskel maven fra det underliggende bindevæv.
- Skær den distale senen ved hjælp af de fine krum saks, og derefter skære musklen på oprindelsen, så tæt som muligt på skinnebenet.
- Åbne bughulen ved at udføre et sagittalt indsnit startende i hypogastric regionen og bevæger opadtil til epigastriske region, stopper snittet lige over membranen.
BEMÆRK: Dybden af snittet bør kun være nok til at bryde den abdominale muskler væg og den underliggende peritoneal fascia. - Fjern forsigtigt leveren ved at tage fat det med stumpe spids pincet, og bruge de fine buede saks til at dissekere væk eventuelle blodkar eller bindevæv, der overholder leveren til hulrummet. Pas på ikke at efterlade nogen lapper bag. Afvej og snap fryse leveren i et rør i flydende nitrogen.
- Brug af stumpe spids pincet, bevæge sig væk tarmen, og derefter udsætte og fint fjernemilten. Tag fat i milten forsigtigt med stumpe spids pincet og bruge bagsiden eller stumpe side af de fine buede saks til at dissekere væk eventuelle bindevæv og blodkar klæber milten til hulrummet. Afvej og snap fryse den i et rør i flydende nitrogen.
- Identificer de gonadale fedtpuder, der støder op til epididymis (hos mænd) eller livmoder (hos kvinder). fatte forsigtigt epididymal fedtpuden med stumpe spids pincet og trække vævet ud af hulrummet. Brug af de fine krum saks, skæres væk enhver gonadale væv, der kan fastgøres til fedtpuden. Afvej fedtpuden og snap fryse den i et rør i flydende nitrogen.
BEMÆRK: Generelt er denne fedtvæv betragtes som repræsentative for den samlede kropsfedt masse i mus og falder i vægt med kakeksi. Andre fedtpuder kan tilsvarende identificeres, dissekeret, fjernet og vejet. - Brug de buede fine sakse til at åbne brystet af dyret. Skær væk ribbenene knyttet til både laterale grænser sternum. Fjern brystbenet. Brug to par tænger, fat hver side af brystkassen og træk hver side lateralt at åbne brysthulen.
- Fint trække hjerte med pincetten. udskære forsigtigt hjerte med de buede fine sakse ved overskæring aorta i venstre atrium. Sørg for at tømme orglet af eventuel resterende blod ved forsigtigt at duppe det mod nogle absorberende papir. Afvej og snap fryse den i et rør i flydende nitrogen.
5. Muskel Frysning og Montage
- Fordybe den nederste halvdel af en lille plastbæger (50 ml) indeholdende isopentan i flydende nitrogen. Den isopentan er klar til brug, når det bliver lettere viskøs og danner en fast hvid laminat foring indersiden af bægeret (temperatur: -160 ° C).
BEMÆRK: Brug altid gnistfrit bronze eller aluminium håndværktøj. Undgå indånding produkt damp. Benyttes med tilstrækkelig ventilation. Hvis håndtere et udslip og ventilation er umuligt eller impractical, bære en egnet åndedrætsværn. - Frys nogle omsluttende medium på en patron (kork) ved at dyppe den kort (10 sek) i isopentan.
- Håndtag musklen (f.eks., Tibialis eller gastrocnemius) ved at holde det ved senen, lodret i forhold til proppen, for at opretholde orienteringen af fibrene og muliggøre tværsnit.
- Anbring forsigtigt endedelen af den friske muskel oven på den frosne indlejring medium.
BEMÆRK: Musklen vil holde. Det er vigtigt ikke at fuldstændigt omgive musklen med omsluttende medium. Det er også vigtigt at opretholde den vertikale orientering til efterfølgende bestemmelse af tværsnitsarealet. - Dyp borepatron med vedlagte muskel i isopentan bad (den sædvanlige frysning er 7 - 15 sek, afhængigt af modellen størrelse og sammensætning).
BEMÆRK: Immersion i indefrysning opløsning bør ikke vare mere end der er behov for helt at fryse prøven. Frysning for længe vil fracTUR vævsblokken, mens for kort tid vil forårsage iskrystaldannelse. Et godt frosne enheder vil blive kalkholdig hvid. - Efter frysning prøven, læg det i en lille plasticpose eller prøve rør (50 ml) og straks gemme det i en dybfryser ved -80 ° C eller i flydende nitrogen.
6. Analyse af Raw data
- For at styre for variationer i størrelsen af musene, normalisere den endelige legemsvægt (FBW); tumor-fri kropsvægt; og slagtekrop, organ- og vævsvægt (udtrykt i gram) ifølge den indledende kropsvægt (IBW), og udtrykke dem som "vægt / 100 mg IBW".
BEMÆRK: Alternativt nogle forskere normalisere muskelmasse til tibia længde. - Brug en software til dataanalyse. Find middelværdi og SD af de normaliserede vægte. Statistisk analyse med uparret Students t-test mellem kontrol og C26-bærende mus.
BEMÆRK: Resultaterne kan præsenteres i forhold til kroppen (IBWog tumor-fri FBW), tumor, organ- og væv vægte.
7. Muskel Sektionsinddeling
- Indstil arbejdstemperatur for kryostaten indre kammer til omkring -23 ° C.
- Tillad prøven (tidligere opbevaret ved -80 ° C) for at akklimatisere ved arbejdstemperaturen (et par timer burde være nok).
- Cut multiple 8-um tykke sektioner af prøven (helst tibialis anterior eller gastrocnemius muskler) og samle dem på objektglas.
BEMÆRK: Skær sektion i midten mave region af musklen. Også af hensyn til nøjagtigheden, klippe afsnittene vinkelret på montering akse. - Holde objektglas inde i kryostatkammeret. Lad dem ikke tø, hvis målet er at udføre IF / IHC undersøgelser eller enzymatisk farvning.
- Opbevar dias ved -80 ° C i yderligere analyser.
8. Evaluering af Myofiber Størrelse af laminin Immunofluorescens (Alternativ 1)
19. Selvom H & E-farvning af muskel sektioner udgør en værdifuld og bekvem metode til analyse af morfologi, anvendelsen af en IF tilgang 14 er betydeligt hurtigere og beskedent mere præcis end H & E-baserede metode. H & E, beskrives nedenfor.
- Fjern vævssnit fra enten kryostaten eller -80 ° C opbevaring og give dem mulighed for at ækvilibrere til stuetemperatur (ca. 5 - 10 min).
BEMÆRK: For at undgå ikke-specifikke interaktioner forbundet med primære antistoffer i mus, er det tilrådeligt at enten bruge antistoffer rejst i en anden art, eller at gøre brug af kommercielt tilgængelige "mus-on-mus" immunodetektions kits. - Fordyb afsnittene i pre-cooled methanol (-20 ° C) i 10 minutter.
- Vask de afsnit på stuetemperatur 1x PBS i 5 min.
- Fjern PBS og bruge en pen til immunhistokemiske applikationer til at omringe de sektioner på dias. IKKE lade sektioner helt tørre på noget tidspunkt.
- Anvende en egnet blokerende buffer (5 - 8% FBS i PBS eller 5% gedeserum i PBS) på afsnittene i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern blokeringsbufferen.
- Anvende enten et kanin-anti-laminin (01:30) eller en muse-anti-dystrofin (01:30) primært antistof i blokerende buffer til afsnittene i 2 timer ved stuetemperatur (eller natten over ved 4 ° C) i et fugtigt kammer.
- Vask sektioner med 1x PBS i 5 min.
- Fjern vaskepufferen og vask sektioner igen i 1 x PBS i 5 min.
- Fjern vaskepufferen og anvende en passende fluorescerende sekundære antistof (1: 1000 i blokerende buffer) til afsnittene i et fugtigt kammer i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern det sekundære antistof og vask sektionerne med 1x PBS i 5min.
- Fjern vaskepufferen og gentag vask med 1x PBS i 5 min. Fjern vaskepufferen og dække sektioner med et dækglas under anvendelse af et vandbaseret medium.
- Identificere de morfologiske træk ved muskel ved hjælp af digitale billeder af den farvede sektion. For at gøre dette, skal du bruge et omvendt fluorescerende lys mikroskop for IF sektioner (en 10X eller 20X forstørrelse er hensigtsmæssig), sammen med et digitalt kamera og billedoptagelse software. Placer en skala bar i hvert digitale billede (20 - 30 tilfældige felter anbefales til hver muskel sektion) for at lette kvantificering af CSA. Billeder skal gemmes i .TIF format til at være kompatibel med billedanalyse software ved hjælp af ImageJ programmet.
- Brug en ImageJ macro at skelne bindevæv fra kontraktilt væv (myofiber størrelse) gennem tilstedeværelsen af det fluorescerende sekundære antistof i endomysium 20.
BEMÆRK: makro og instruktioner er tilgængelige fra authors, Richard Lieber og Shannon Bremner. - Åbn ImageJ programmet ved at dobbeltklikke på ikonet på skrivebordet.
- Læg CSA makroen ved at klikke én gang på "Plugins" fanen. Flyt markøren ned for at vælge indstillingen "Install" ved at klikke på det én gang.
- Læg tværsnits- makro ved at vælge det fra mappen den er blevet gemt i, og klik derefter på "Åbn".
- Når makroen er blevet åbnet, skal du åbne den histologiske billede, der indeholder skalalinjen ved at klikke på "File" og derefter "Åbn" fra ImageJ værktøjslinjen.
- Når billedet er åbnet, skal du vælge "lige linje værktøj" i ImageJ programmet ved at klikke på ikonet med den lige linje.
- Når "Straight line værktøj" er valgt, skal du klikke én gang på længst til venstre ende af skalaen bar og derefter klikke én gang på højre mest ende af skalaen bar. Når det gøres korrekt, bør der være en gul linje overlejret på skalaen bar.
- At sikre, at yellow linje stadig oven på skalaen bar, skal du vælge "Analyser" fanen fra ImageJ værktøjslinjen ved at klikke på det én gang.
- I fanebladet "Analyser", flytte markøren ned og vælg "sæt skala" ved at klikke på det én gang.
- I "Indstil skalaen" vinduet, ændrer ikke værdien i "Distance i pixels" boksen. Indtast den kendte afstand af skalaen bar i boksen "Kendt distance". Skift enhederne i "enhed længde" boksen for at korrespondere med Målestokken enheder (dvs. mikrometer = um). Endelig skal du vælge "global" ved at klikke på boksen til venstre for "Global" én gang.
- Luk "Indstil skalaen" vinduet.
- Åbn det første billede, der skal måles ved at trykke på "O" på tastaturet. Overhold et vindue pop-up, der giver brugeren mulighed for at finde og vælge det billede, der skal måles fra den mappe, den er blevet gemt i. Vælg billedet ved at klikke på det én gang og derefter klikke på "Åbn". <li> Efter åbning bør et vindue vises for udvælgelsen af det acceptable område for CSA målinger og cirkularitet.
- Efter indstilling af CSA rækkevidde og rundhed, observere billedet dækket i røde pixels med en "Threshold" vinduet. Justér tærsklen på billedet ved hjælp søjlerne i "Threshold" vinduet indtil muskelfibrene nøjagtigt udfyldt med røde pixels.
BEMÆRK: Forsøg på at opnå den størst antal fibre, der ikke rører hinanden; hvis fibre er rørende, vil de blive målt som én stor fiber, der skal redigeres nedstrøms. - Efter indstilling af tærskelværdien, skal du trykke på "1" på tastaturet for at måle muskelfibrene.
- Cirkel de enkelte muskelfibre med en gul linje.Flyt gennem billedet, og fjern artefakter eller dobbelte fibre, der er udvalgt af programmet. For at gøre dette, skal du vælge de strukturer, der ikke er fibre ved at klikke på dem én gang, og tryk derefter på knappen "D" på tastaturet. Dette vil slette dem fra målingerne.
- Vælg og kopiere målingerne fra "Måling værdi vindue", og indsætte dem i et regneark til yderligere analyse.
BEMÆRK: De opnåede værdier kan også anvendes til at vurdere fiberfordelingen analyse, som generelt udgør en nyttig parameter til at afgøre, om tumorvækst fremmer et skift mod mindre muskelfibre. - Luk alle de åbne vinduer i ImageJ ved at klikke på "X" i øverste venstre hjørne af vinduerne.
- Åbn et nyt billede, der skal måles ved at trykke på "O" og gentage trin 8,24-8,29.
BEMÆRK: Disse indstillinger er normalt overladt til deres standardværdier. Men hvis man ønsker at ændre disse indstillinger, skal du sørge for at holde de værdier de samme for hver efterfølgende billede, der skal måles i eksperimentet.
9. Evaluering af Myofiber Størrelse fra H & E Stained Sektioner (Alternativ 2)
- Placer glassetglider ind Coplin-skåle indeholdende filtreret Harris hæmatoxylin i 8 min.
BEMÆRK: Alternativt kan Mayer hematoxylin anvendes, hvis der ønskes en mindre intens plet. - Skyl dias i demineraliseret vand.
- Dyp objektglassene i ledningsvand i op til 5 min.
- Hurtigt skyl dem i deioniseret vand, og derefter inkuberes dem i filtreret 1% eosin løsning til mindre end 2 min.
BEMÆRK: Hvis der ønskes en mere intens plet, tilsættes 1 - 2 dråber eddikesyre (0,01% eller mindre) til eosin opløsning. - Begynd de dehydrering trin. Skyl dias i 70% ethanol i mindre end 1 min.
- Dyp dias i 90% ethanol i 1 min.
- Dyp dias i 95% ethanol i 1 min.
- Dyp dias i 100% ethanol i 2 min.
- Dyp dias i xylen i 2 min. Flyt dias til en anden Copley krukke indeholder frisk xylen til 2 mere min.
BEMÆRK: Hold dias i xylen (ikke længere end 1 time), indtil de er dækglas. - Placer coverslips på muskel sektioner ved hjælp Permount eller en Xylen-baserede montering foretrukne medie.
- Overhold H & E-farvede objektglas under et mikroskop med en 20X forstørrelse, og erhverve billeder af hele musklen sektionen område. Få billeder ved hjælp af en lys-lysmikroskop, digital kamera, og billedoptagelse software.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af en skala bar eller billede af en mikrometer taget ved samme forstørrelse vil være nødvendigt at foretage CSA. Som ovenfor rekord mindst 20 - 30 tilfældige felter for hver muskel sektion. - Vurdere myofiber størrelse ved hjælp ImageJ software. Åbent hver digitalt billede. Indstil skalaen som ovenfor. Mål mindst 1.500-2.000 muskelfibre pr muskel ved hjælp af frihånd markeringsværktøjet, opsporing omkreds fiberen med en mus eller, for hurtigere input, med en tablet inputenhed og pen.
10. Dataindsamling og analyse
- For at fastslå muskelfibrene størrelse, vurdere den gennemsnitlige fiber "område."Beregn midler og SD til målingerne opnået for hver muskel, herunder både området og Feret diameter. Desuden for at vurdere, om den eksperimentelle indstilling er forbundet med et skift i retning enten mindre eller større muskelfibre, analysere" distribution fiber . "
- Vurdere betydningen af resultatet ved at udføre en uparret t-test for to grupper. Bestemmes forholdet mellem de opnåede værdier for C26 mus gruppe og for kontrolgruppen. Plot værdierne på en graf rapportering af midler SD og frekvensfordelingen / histogram til formål at dokumentere skift i fiber størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C26 tumor vækstkinetik viser en lag-fase for første 7 - 8 d efter injektion, efterfulgt af eksponentiel cellevækst (4 - 5d). Tumormassen når til sidst ~ 10% af legemsvægten (ca. 2 g; Figur 1A-B). Under den første fase, kan tumoren lokaliseres ved kun palpering og vises som en lille fremspring af huden. I den anden fase, er tumoren observeret som en masse under huden. Sjældent tumoren bliver sår, hvilket resulterer i et åbent sår; i dette tilfælde er musen udelukket fra forsøgsgruppen og humant aflivet.
Legemsvægt er uændret i den første fase, men den reduceres betydeligt i den anden fase, når den når 10 - 15% af den oprindelige legemsvægt (30% i tilfælde af tumor-fri vægt, figur 1A). Tumorbærende mus vises brændt og viste pjusket pels i slutningen afforsøgsperiode, med et huld (BC) score lig med 1 18 (figur 1C). BC1 betegner en alvorligt afmagret mus, hvor skeletstrukturer er tydelige og ryghvirvler er tydeligt segmenteret. Krop vægttab er hovedsageligt forklares med både skeletmuskulatur og fedtvæv spilde (figur 1B). Vægttab er konsistent med en reduktion på ca. 20 - 30% i skeletmuskulatur vægt, især i gastrocnemius, tibialis anterior, og quadriceps (figur 2). Hjertemusklen er også signifikant reduceret i vægt, selv i mindre grad i forhold til de øvrige skeletmuskulatur (figur 2). Interessant, hepatomegali (+ 16%, p <0,01) og splenomegali (+ 110%, p <0,01) er generelt detekteret i tumor værter, mens fedtmasse, ligner skeletmuskel, er alvorligt depleteret (-70%, p <0,001 ; figur 3).
(figur 4A-B). Især viste frekvensfordelingen analyse et skift mod mindre størrelse fibre i C26-bærende mus, hvilket antyder, at hele musklen undergår atrofi i nærvær af en C26 tumor (figur 4C). Lignende resultater kan observeres ved at udnytte en traditionel H & E-metode til kvantificering af fiber størrelse, men omfanget af ændringen i musklen CSA forbundet med cancervækst er lidt anderledes (38% versus kontrol, p <0,01 for IF -baseret fremgangsmåde; -18% versus kontrol, p <0,01 for H & E-baseret metode, figur 5).
Figur 1: Body Vægte i Kontrol og C26-bærende mus. A) Kropsvægt kurve i kontrol og C26 værter over hele forsøgsperioden (14 dage efter tumor injektion). B) Initial kropsvægt (IBW), sidste tumor-fri kropsvægt (FBW), og tumor vægt i kontrol og C26- bærer dyr. C) Repræsentative billeder af kontroller og C26-bærere på tidspunktet for aflivning (dag 14 efter tumor podning). Data er udtrykt som middelværdien SD. n = 6. Betydningen af forskellene: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 versus kontrolgruppen hjælp t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Muscle Vægte i Kontrol og C26-bærende mus. Tibialis, gastrocnemius, quadriceps, og hjerteproblemer vægt i kontrol og C26 tumor-bærere De rapporteres som vægten / 100 mg IBW. Dataene er udtrykt som den gennemsnitlige SD. n = 6. Betydningen af forskellene: ** p <0,01 og *** p <0,001 versus kontrolgruppen anvendelse af Students t-test.
Figur 3:. Organ Vægte i Kontrol og C26-bærende mus Den lever, milt, og epididymale fedt pad vægt i kontrol og C26 tumor-bærere rapporteres som vægten / 100 mg IBW. Dataene er udtrykt som den gennemsnitlige SD. n = 6. Betydningen af forskellene: ** p <0,01 versus kontrolgruppen.
Figur 4: Morfometri for Myofiber Størrelse af Immunofluorescens. A) Fluorescerende immunhistokemisk reaktion tibialis sektioner ved hjælp af en anti-dystrofin antistof (Vector Laboratories) fra kontrol og C26 værter. Forstørrelse: 10X. Størrelse bar:. 100 um B) Kvantificering af CSA i tibialis muskel målt med ImageJ makro C) Frekvens fordeling af CSA i tibialis muskel kontrol og C26-bærende mus.. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD. n = 6 for hver gruppe. Betydningen af forskellene: ** p <0,01 versus kontrolgruppen anvendelse af Students t-test.
Figur 5: Morfometri for Myofiber Størrelse af H & E. A) Hematoxylin & eosin-farvning af tibialis afsnit fra kontrol og C26 værter. Forstørrelse: 20X. Størrelse bar:. 100 um B) Kvantificering og frekvensfordelingen afCSA i tibialismuskel. Dataene er udtrykt som den gennemsnitlige SD. n = 6. Betydningen af forskellene: *** p <0,001 versus kontrolgruppen anvendelse af Students t-test.
| Forfattere | stammen Mouse | mus køn | Mobilnummer | Oprindelse | Implanteret som fast tumor? | Injektionsstedet | Dage |
| Lazarus et al., 1999 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NCI | INGEN | rygregionen | 17 |
| Al-Majid og McCarthy 2001 | CD2F1 | F | 2,5 x 10 6 | OSUMC | INGEN | rygregionen | 17 |
| Samuels et al., 2001 | Balb / c | M | 0,5 g / ml tumor suspension | ns | JA | rygregionen | Op til 11 |
| Acharyya et al., 2004 | CD2F1 | M | 1 x 10 7 | OSUMC | INGEN | højre flanke | Op til 24 |
| Aulino et al. 2010 | Balb / c | ns | 0,5 mm 3 | NCI | JA | rygregionen | 21 |
| Benny-Klimek et al., 2010 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | INGEN | rygregionen | 14 |
| Bonetto et al, 2011.; 2012 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | INGEN | rygregionen | |
| Cosper og Leinwand 2010 | CD2F1 | M + F | 5 x 10 5 | ns | INGEN | højre flanke | Op til 27 |
| Murphy et al. 2012 | CD2F1 | ns | 5 x 10 5 | NCI / OSUMC | INGEN | rygregionen | 14 |
| Cornwell et al., 2014 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NCI | INGEN | Right & Venstre flanke | Op til 26 |
| Assi et al., 2016 | Balb / c | ns | 1 x 10 6 | Celle-linje service | INGEN | rygregionen | Op til 22 |
Tabel 1:. Sammenligning af de forskellige protokoller, der anvendes til C26 Implantation Different protokoller for C26 implantation er forsynet med særlig henvisning til muse anvendte stamme cellen antallet og typen af tumor podet, cellen oprindelse, injektionsstedet, og længden af den eksperimentelle periode. OSUMC: Ohio State University Medical Center. NCI: National Cancer Institute. Kommerciel cellelinje tjeneste NS: ikke specificeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Især i sine seneste stadier, er kolorektal cancer forbundet med udviklingen af kakeksi, som er ansvarlig for fattigere resultater og reduktioner i patientens livskvalitet. Mange undersøgelser har fokuseret på behandling af tilstande sekundært til cancer; Men trods mange bestræbelser i denne retning, er der stadig ingen godkendt behandling for cancer kakeksi 21. Således er det bydende nødvendigt, at dyremodeller ligne den menneskelige patologi så tæt som muligt for at maksimere oversættelse af resultater.
C26 tumorbærende mus er en almindeligt anvendt eksperimentel model for cancer kakeksi 22-24. Denne model ligner den humane sygdom, der viser reduktioner i kroppen, muskler og fedtmasse, samt muskelfibrene atrofi og forøget ekspression af inflammatoriske gener og ubiquitin ligaser overensstemmelse med markant protein hyperkatabolisme 2,5. På trods af dette, et par forskelle med data opnået i kræft patieNTS er blevet rapporteret 25,26. Faktisk er nogle træk ved modellens, herunder den ikke-fysiologiske vækstmiljø (fx en ektopisk tumor vokset subkutant i stedet for orthotopisk implanteret i mavetarmkanalen), den relativt korte forsøgsperiode i forhold til andre modeller (fx genetisk eller ortotopisk injektion af tumorer), afhængigheden af IL-6 handling, og den nødvendige brug af CD2F1 eller Balb / c mus kan udgøre alvorlige begrænsninger og kunne begrænse fortolkningen af resultaterne.
Den nuværende protokol har vist sig at være meget reproducerbar tværs af mange eksperimenter udført i vores laboratorium, opretholdelse af de samme egenskaber og tillader sammenligninger mellem resultaterne opnået på forskellige tidspunkter, på forskellige geografiske steder, og af forskellige forskere 3,10. Men for at fremme reproducerbarheden af data, er det vigtigt at fastsætte klare og fælles retningslinjer.
Som gathered fra litteraturen, kan adskillige advarsler forhindre reproduktion af de samme data i to forskellige laboratorier. Af de samme grunde, kan brugen af forskellige protokoller generere forskellige fænotyper og resultater, samt fører til modstridende og tvivlsomme resultater. Faktisk har forskelle i udførelse af denne dyremodel er rapporteret, hovedsagelig som følge af stamme (Balb / c eller CD2F1) 2,5,27-29 eller køn mus anvendt 17, typen af tumor, der blev implanteret (en cellesuspension 3 , 29 snarere end en fast tumor i et transplantat 2,30), tumor kilde (NCI, ATCC, eller OSUMC), antallet af C26-celler, der blev injiceret, og injektionsstedet eller implantation (flankerne 6,17, 31 eller den dorsale region 3,10,32). Ingen direkte sammenligning af de effekter forbundet med implantation af C26 cellelinjer skabt på forskellige kilder (hovedsageligt OSUMC versus NCI) der nogensinde er blevet udført, hvilket forhindrer os i at tegne en endelig conclusions. er dog sandsynligt, at valget af kilden til celler også signifikant kan påvirke de forventede resultater. Når man overvejer valg af mænd versus kvinder, bør efterforskere blive mindet om betydelige forskelle i resultaterne. Således som rapporteret af Cosper og Leinwand 17, mandlige tumorbærende mus, som følge af fraværet af østrogener, kan vise en mere alvorlig fænotype end hunnerne, herunder større cardiac massetab og dødelighed, en mere robust pro-inflammatoriske respons på tumoren og større hjerte-autofagi.
Især for de efterforskere, der ikke er bekendt med denne model, og kan i første omgang har problemer, baseret på både en magt analyse og vores tidligere erfaringer, brug af mindst 6 dyr pr eksperimentel tilstand (n = 6) er tilrådeligt for at opdage statistisk signifikante forskelle. Det er også afgørende, at randomisering udføres omhyggeligt, således at oprindelige vægte krop på forsøgsdyreneikke afviger væsentligt mellem grupper. Ligeledes anbefales det, at det for at undgå inter-operatør variabilitet samme investigator udføre vævet og organ samling af hvert dyr. Endvidere er det bydende nødvendigt, at væv (især muskel) fryses så hurtigt som muligt for at bevare RNA'er og enzymatisk struktur og aktivitet, især hvis målet med undersøgelsen er at vurdere genekspression eller evaluere enzymatiske aktiviteter. Desuden i forsøget på at bestemme muskel CSA, viste vi, at rapportere det område fiber er almindeligt accepteret og repræsentant for muskelfiber størrelse. Her præsenteres to forskellige metoder til at vurdere muskel CSA. Som vist i figurerne 4-5, begge metoder kunne påvise en signifikant reduktion i myofiber størrelse mellem kontrol og tumor værter, selvom graden af spilde optrådte anderledes.
Denne uoverensstemmelse kan skyldes det faktum, at, selv om begge metoder er acceptable måder at æslers muskelfiber størrelse, kvantificering af muskel egenskaber fra H & E-farvede objektglas er stadig en manuel eller semi-automatisk proces, oftest arbejdskrævende, tidskrævende, og påvirket af begrænset nøjagtighed. Baseret på vores erfaring, mener vi, at IF-metode er en mere præcis teknik til at rapportere muskel CSA. Faktisk er antallet af fibre, der kan måles automatisk ved at udnytte denne teknik er betydeligt større, hvilket øger nøjagtigheden af målingen. Notatet for begge teknikker, en alternativ metode til rapportering muskel størrelse vurderer Feret diameter. Interessant, betragtes dette som en meget pålideligt værktøj på grund af det faktum, at denne parameter er stort set uafhængig af vinklen på sektionering. Andre parametre, såsom "minimal indre diameter" og "minimal ydre diameter" er også ufølsom over planet af sektionering og kan anvendes i stedet for Feret diameter som alternative indikationer af fibER størrelse.
Afslutningsvis selvom kakeksi samfund klart behov for at etablere mere fysiologiske modeller til undersøgelse af tumor-associerede muskelsvind, mener vi, at mus, der bærer C26 colon carcinom udgør et godt standardiseret og let at bruge modellen til at undersøge molekylære forandringer og fysiologiske abnormaliteter normalt påvises efter forekomst af en tumor. Fremtidige ansøgninger vil indebære undersøgelse af, om ortotopisk implantation af C26 celler i tyktarmen kan repræsentere en ordentlig og mere fysiologisk model af kolorektal cancer kakeksi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Flasks | Falcon - Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
- Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
- Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
- Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
- Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
- Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
- Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
- Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
- Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
- Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
- Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
- Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
- Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
- Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
- Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
- Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
- Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
- Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
- Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
- Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
- Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
- Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
- Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
- Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
- Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
- al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
- Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
- Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
- Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).
