Introduction
Spiermassaverlies is een ernstige complicatie van verschillende klinische aandoeningen zoals kanker, sepsis, lever, cirrose, hart- en nierfalen, chronische obstructieve longziekte en AIDS. Met name spieratrofie blijkt uit ten minste 50% van kankerpatiënten 1. Verlies van skeletspier bij kanker gevolg van verhoogde afbraak eiwit door de over-activering van de skeletspier proteolytische systemen en / of verminderde eiwitsynthese 6. Lipolyse blijkt ook, leidt tot de afbraak van vetweefsel. Klinisch cachexia is geassocieerd met een verminderde kwaliteit en duur van en wordt geschat op de doodsoorzaak in 20 zijn - 30% van de kankerpatiënten 7. Gebruik van experimentele modellen die de menselijke ziekte zoveel mogelijk lijken gunstig zou zijn. Een optimale diermodel wordt gekenmerkt door hoge reproduceerbaarheid, en door beperkte interferentie van andere therapieën en onvoorspelbare factorendieet, geslacht en genetische achtergrond die gewoonlijk geassocieerd zijn met de klinische toestand 8. Tot dusver is kankercachexia voornamelijk bestudeerd in diermodellen gekenmerkt door transplantatie van kankercellen of injectie carcinogenen, hoewel een nieuwe werkwijze om genetisch gemodificeerde muizen gevoelig voor de ontwikkeling van kanker gebruikt.
Muizen die het C26 carcinoom (ook wel colon-adenocarcinoom en 26) vormen een goed gekarakteriseerde en veel gebruikt model van kanker cachexie 2,5. De groei van de tumor leidt tot C26 lichaam en spieren gewichtsverlies, voornamelijk door meer vet en proteïne katabolisme 9. In het algemeen wordt een 10% tumorgewicht versus totale lichaamsgewicht geassocieerd met een vermindering van 20-25% in de skeletspier gewicht en een grotere depletie vet 3,10. Hepatomegalie en splenomegalie ook waargenomen met tumorgroei, samen met de activering van de acute fase respons en de hoogte van pro-Inflammatory cytokine levels 3,11. Hiervan is bekend dat IL-6 een belangrijke rol speelt bij het veroorzaken spieratrofie in de C26 model, hoewel dit cytokine is waarschijnlijk niet de enige inductor van cachexie 12. Verhoogde IL-6 veroorzaakt spieratrofie door activatie van de JAK / STAT3 route, en het remmen van deze transcriptiefactor kan voorkomen dat spieratrofie 3,4.
Tijdens C26-geïnduceerde spieratrofie, zoals in veel omstandigheden spieratrofie, spiermassa verliest voornamelijk door vermindering van spiereiwit inhoud in spiervezels, niet door celdood of verlies van vezels 13. In C26 cachexie, is een verschuiving naar kleinere dwarsdoorsneden waargenomen in zowel glycolytische en oxidatieve vezels 2. Dit is ook in overeenstemming met verminderde spierkracht 5. Veel groepen over de hele wereld hebben gebruik gemaakt van de C26 model om nieuwe mediatoren van spieratrofie of klinisch relevante geneesmiddelen voor kanker CAC ontdekkenhexia. Maar veel verschillende procedures voor het gebruik van dit model gemeld, hun bezorgdheid over de samenhang van de verkregen gegevens en stellen belemmeringen voor reproduceerbaarheid in verschillende experimentele omstandigheden. Hier melden wij een typisch gebruik van dit model voor de studie van kanker cachexia die gestandaardiseerde en reproduceerbare gegevens oplevert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle studies beschreven, werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies van de Thomas Jefferson University en Indiana University School of Medicine.
1. C26 Cell Groei en Voorbereiding
- Verkrijgen C26 colorectale kankercellen (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) uiteenzetten en compleet groeimedium (dwz hoge glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum (FBS), 1 mM natriumpyruvaat, 1% glutamine en 1% streptomycine / penicilline).
Opmerking: Om beter inter-experimentele reproduceerbaarheid mogelijk, het de voorkeur C26 cellen gebruiken een passage zo laag mogelijk. - Gebruik een los verkrijgbare cel in tegen 50.000 cellen / cm2 plaat in flessen met volledige groeimedium. Incubeer ze in een bevochtigde atmosfeer bij 37 ° C en 5% CO2 totdat subconfluente. Voorkomen dat ze het kweken bij een hoge dichtheid aan prevent differentiatie en driften van de cel fenotypes.
- Na de eerste passage, plaat genoeg cellen om te worden geïmplanteerd in het geplande aantal dieren. Op de dag van celimplantatie, dissociëren de cellen door behandeling met trypsine met 0,02 ml van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing per cm 2, neutraliseren van de trypsine door toevoeging van ten minste 3 ml vers medium per ml trypsine bepalen celconcentratie in cellen / ml en resuspendeer het aantal cellen dat nodig is voor het experiment (1 x 10 6 cellen per muis) in steriele PBS.
OPMERKING: C26 cellen confluentie bereiken wanneer de dichtheid van 500.000 cellen / cm2.
2. Muizen
- CD2F1 willekeurig volwassen muizen (ten minste 8 weken oud) in groepen (meestal controleert en tumor-dragers) met ten minste n = 6 per groep.
OPMERKING: C26 tumoren groeien in Balb / c-muizen ook. Echter, gebaseerd op onze ervaring, CD2F1 muizen vertegenwoordigen een meer veelzijdige en economische gastheer voor dit specifieke tumor model. Bovendien,vergelijkbaar met de klinische bevindingen en in andere experimentele modellen van kanker-geassocieerde spieratrofie 14-16, geslacht verschillen in de respons op C26 cachexie kan ook worden waargenomen 17 (zie ook tabel 1). - Verdoven van de muis met behulp van isofluraan bij inademing (3% zuurstof). Blijf de dieren onder narcose uitsluitend zolang als nodig is om de tumor inoculatie uitgevoerd. Of de muis ligt op een verwarmd kussen om het warmteverlies te voorkomen. Voor aanvang van de tumor injectie procedure, bevestigt de juiste verdoving door zachtjes knijpen de achterste tenen.
Opmerking: Door de tijdsduur van deze procedure (meestal een paar seconden), wordt het gebruik van de veterinaire oogzalf niet vereist. Om dezelfde reden zijn de controledieren schijnoperatie ondergaan naar verwachting niet afvallen. - Met behulp van een steriele 1 ml insulinespuit met een 26-gauge naald snel injecteer 250 ul van de oplossing die het tumor cellen subcutaan en intrascapularly in het vet pad van de muis.
LET OP: De controle dieren zal 250 ul steriele zoutoplossing ontvangen intrascapularly in het vet pad. - Plaats het dier opnieuw in de kooi. Direct waar te nemen van de muis ten minste eenmaal per 15 minuten totdat het kan reageren op zachte manipulatie en heeft herwonnen een oprichtende reflex.
NB: Laat de muis niet onbeheerd achter, en bewaar het in een warme herstel kooi die een vast substraat bevat. Bovendien de muis niet terug naar de dierkamer totdat deze volledig is hersteld van anesthesie. Over het algemeen hebben de muizen niet nodig om individueel worden gehuisvest, tenzij de onderzoeker is gericht op de individuele voedselinname te beoordelen. Als dit het geval is en het gebruik van geautomatiseerde metabolische kooien niet beschikbaar is, moet de handmatige registratie van voedselconsumptie worden uitgevoerd, eventueel dagelijks en op hetzelfde tijdstip van de dag. - Controleer de muizen dagelijks en hun lichaamsgewichten opgenomen.
LET OP: Het opnemen van de conditiescore enkooi gedrag kan graden van cachexia en ziekte gedrag, wat handig is voor de behandeling studies 18 onderscheiden.
3. Euthanasie en bloedafname
- Wanneer gewichtsverlies in de tumor gastheren versus controle 5%, 10% of 15% (mild, matig en ernstig cachexie, respectievelijk) in vergelijking met de initiële lichaamsgewicht, bereikt euthanaseren de muizen.
OPMERKING: Een typisch experiment wordt uitgevoerd totdat een groep 10% gewichtsverlies, na welke tijd alle groepen gedood bereikt. Gewichtsverlies wordt bepaald door meting van het lichaamsgewicht inclusief de tumor. - Plaats de muis onder isofluraan narcose (3% zuurstof). Trekken bloed door middel van een cardiale punctie (ongeveer 1-1,5 ml).
- Verzamel de bloed in K 2 EDTA (18 mg) lege buizen en leg ze op ijs. Centrifugeer het bloed (2000 g gedurende 15 min bij 4 ° C) en laat de plasma / serum.
- Euthanaseren de muis door middel van cervical dislocatie. Ga verder met weefsel excisie en orgel collectie.
4. weefsels en organen Excision
LET OP: Voor het gebruik van weefsels in biochemische of moleculaire biologie assays, zijn van plan om elk orgaan en weefsel te wegen en plaats een fragment meteen in pre-gelabelde cryotubes. Snap bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.
- Om vervuiling van weefselmonsters met bont voorkomen spuit 70% ethanol over het hele lichaam.
- Plaats de muis op een dissectie bed in een liggende positie en uit te breiden een ledemaat verticaal door het aanbrengen van de voet tot een verhoogde buret klem.
- Pak de huid van de onderste ledemaat met Dumont pincet en gebruik de gebogen fijne schaar om de huid en fascia verwijder, waardoor de onderliggende spierbuiken van de onderste ledematen.
- Identificeer de gastrocnemius spier aan het achterste onderste ledematen door zijn oorsprong op het laterale en mediale condylen op de achterste dijbeen en de insertie bijde calcaneus via de calcaneal pees.
- Ga verder met de gastrocnemius calcaneal pees te snijden. Pak het distale einde van de gastrocnemius met Dumont pincet en trekt de spier buik in de richting van de herkomst ervan. Met een schaar, knip de spier aan de oorsprong zo dicht mogelijk bij het dijbeen. Plaats de spier in een schotel. Weeg onmiddellijk bevriezen in een buis in vloeibare stikstof.
LET OP: Zorg ervoor dat u niet op de soleus spier te snijden, samen met de gastrocnemius. Als dat gebeurt, verwijder voorzichtig soleus door voorzichtig te trekken met de tang.
- Ga verder met de gastrocnemius calcaneal pees te snijden. Pak het distale einde van de gastrocnemius met Dumont pincet en trekt de spier buik in de richting van de herkomst ervan. Met een schaar, knip de spier aan de oorsprong zo dicht mogelijk bij het dijbeen. Plaats de spier in een schotel. Weeg onmiddellijk bevriezen in een buis in vloeibare stikstof.
- Ga verder te identificeren en accijnzen de tibialis anterior spier van zijn oorsprong in de anterolaterale oppervlak van het scheenbeen en de invoeging in de mediale spijkerschrift via zijn distale pees.
- Om zo een hefboomeffect hebben, houdt de voet door grijpen de cijfers met de wijsvinger en duim. Steek de punt van Dumont tang direct onder de oppervlakkige distale pees van de tibialis en beweeg de tang, zodanig dat de blunt zijde kan worden gebruikt om de tibialis buik los van het onderliggende bindweefsel.
- Snijd het distale pees met de fijne gebogen schaar en knip de spier in de oorsprong, zo dicht mogelijk bij de tibia.
- Open de buikholte door het uitvoeren van een sagittale insnijding begint in de hypogastric regio verplaatsen superieur aan de epigastrische regio, stoppen de incisie net boven het membraan.
OPMERKING: De diepte van de incisie moet enkel genoeg zijn om de abdominale spierwand en de onderliggende fascia peritoneale strijd zijn. - Verwijder voorzichtig de lever door vast te pakken met de stompe getipt tang, en het gebruik van het fijne gebogen schaar om het even welke bloedvaten of bindweefsel dat de lever naar de holte houden weg te ontleden. Zorg ervoor dat u geen kwabben achter te laten. Weeg en snap bevriezen van de lever in een buis in vloeibare stikstof.
- Met behulp van de stompe getipt tang, af te stappen van de darm en vervolgens bloot te leggen en delicaat verwijderende milt. Pak de milt voorzichtig met de botte getipt pincet en gebruik de rug of botte kant van de boete gebogen schaar om het even welke bindweefsel of bloedvaten hechten van de milt om de holte weg te ontleden. Weeg en snap bevriezen in een buis in vloeibare stikstof.
- Identificeer de gonadale vetkussentjes, naast de bijbal (bij mannen) of baarmoeder (bij vrouwen). Voorzichtig pakt u de epididymis vet pad met de stompe getipt pincet en trek het weefsel uit de holte. Met de fijne gekromde schaar wegsnijden elke gonadale weefsel dat voor het vetkussentje zijn bevestigd. Weeg het vetkussentje en snap bevriezen in een buis in vloeibare stikstof.
LET OP: In het algemeen wordt dit vetweefsel beschouwd als representatief voor de totale vetmassa bij muizen en dalingen in gewicht met cachexia. Andere vetkussentjes kunnen eveneens worden geïdentificeerd, ontleed, verwijderd en gewogen. - Met de gebogen fijne schaar om de borstkas van het dier geopend. Knip de ribben verbonden aan beide laterale grenzen van het sternum. Verwijder het borstbeen. Gebruik van twee paar pincetten, grijpen beide zijden van de borstkas en trek weerszijden zijdelings naar de borstholte geopend.
- Fijn trek het hart met de tang. Voorzichtig accijnzen het hart met de gebogen fijne schaar door het doorsnijden van de aorta in de linker atrium. Zorg ervoor dat het orgaan van eventuele resterende bloed leegmaken door subtiel te deppen tegen sommige absorberend papier. Weeg en snap bevriezen in een buis in vloeibare stikstof.
5. Muscle Invriezen en Montage
- Dompel de onderste helft van een kleine plastic beker (50 ml) bevattende isopentaan in vloeibare stikstof. De isopentaan is klaar voor gebruik wanneer het ietwat viskeus en vormt een effen witte laminaat voering de binnenzijde van de beker (temperatuur: -160 ° C).
LET OP: Gebruik altijd vonkvrije brons of aluminium handgereedschap. Vermijd het inademen van dampen product. Gebruik bij voldoende ventilatie. Als de behandeling van een lekkage en ventilatie is onmogelijk of impractical, draag een geschikt gasmasker. - Freeze sommige inbedding medium op een boorkop (kurk) door dompelen kort (10 sec) in isopentaan.
- Behandel de spier (bijv., De tibialis of gastrocnemius) vast door de pees, verticaal ten opzichte van de kurk, teneinde de oriëntatie van de vezels te handhaven en om te kunnen dwarsdoorsneden.
- Plaats zorgvuldig het eindgedeelte van de verse spier bovenop de bevroren inbedding medium.
NB: De spier blijft plakken. Het is belangrijk om niet aan de spier met inbeddingmedium volledig omringen. Het is ook belangrijk om de verticale afstelling voor daaropvolgende bepaling van de doorsnede handhaven. - Dompel de boorkop met de bijbehorende spieren in de isopentaan bad (de gebruikelijke bevriezing bedraagt 7-15 sec, afhankelijk van het monster en samenstelling).
OPMERKING: Onderdompeling in de bevriezing oplossing niet meer dan nodig is om het monster volledig bevriezen duren. Invriezen te lang wil fractuur de weefselblokje, terwijl te korte tijd ijskristalvorming veroorzaken. Een goed bevroren monster wordt krijtwit zijn. - Na bevriezen van de specimen, plaats het in een plastic zak of specimenbuis (50 ml) en direct opslaan in een diepvriezer bij -80 ° C of in vloeibare stikstof.
6. Analyse van de ruwe data
- Om te controleren voor verschillen in grootte van de muizen normaliseren het uiteindelijke lichaamsgewicht (FBW); tumorvrij lichaamsgewicht; en karkas, organen en weefsels gewicht (in gram) volgens de aanvankelijke lichaamsgewicht (IBW), en deze in de vorm "weight / 100 mg IBW".
LET OP: Als alternatief, sommige onderzoekers normaliseren van de spiermassa aan het scheenbeen lengte. - Een software van gegevensanalyse. Bereken de gemiddelde en SD van de genormaliseerde gewichten. Voer een statistische analyse met t-toetsen ongepaarde Student's tussen de controles en de C26-dragende muizen.
LET OP: De resultaten kunnen worden voorgelegd ten opzichte van het lichaam (IBWen tumorvrij FBW), tumor, orgel en weefsel gewichten.
7. Muscle-Sectie
- Stel de werktemperatuur van de cryostaat binnenkamer tot ongeveer -23 ° C.
- Laat het monster (was bij -80 ° C bewaard) te acclimatiseren bij de werktemperatuur (een paar uur moet genoeg zijn).
- Cut meerdere 8-pm dikke delen van het monster (bij voorkeur de tibialis anterior en gastrocnemius spieren) en verzamel ze op glasplaatjes.
OPMERKING: Snijd de rubriek aan het midden van de buik gebied van de spier. Ook ter wille van de nauwkeurigheid, de gesneden gedeelten loodrecht op de as montage. - Houd de glaasjes in de cryostaat kamer. Laat ze niet ontdooien als het doel is om IF / IHC studies of enzymatische vlekken uit te voeren.
- Bewaar de objectglaasjes bij -80 ° C voor verdere analyse.
8. Evaluatie van spiervezeloriėntaties Maat door Laminin Immunofluorescentie (Alternatief 1)
19 bepalen. Hoewel de H & E kleuring van secties spier een waardevolle en geschikte methode voor de analyse van de morfologie, het gebruik van een IF benadering 14 is aanzienlijk sneller en nauwkeuriger dan bescheiden de HE-gebaseerde methode. H & E werkwijzen worden hieronder beschreven.
- Verwijderen weefselsecties van ofwel de cryostaat of -80 ° C opslag en laat ze op kamertemperatuur (ongeveer 5-10 min).
Opmerking: Om niet-specifieke interacties geassocieerd met primaire antilichamen opgewekt in muizen te voorkomen, is het raadzaam hetzij gebruik antilichamen die een andere soort of tot gebruik van commercieel beschikbare "mouse-on-muis" immunodetectie kits. - Dompel de secties in de pre-cooled methanol (-20 ° C) gedurende 10 min.
- Was de secties in kamertemperatuur 1x PBS gedurende 5 minuten.
- Verwijder de PBS en gebruik een pen voor immunohistochemische toepassingen aan de secties omcirkelen op de dia. Laat je niet delen helemaal droog op elk punt.
- Breng een geschikte blokkerende buffer (5-8% FBS in PBS en 5% geit serum in PBS) op de secties gedurende 1 uur bij KT.
- Verwijder de blokkerende buffer.
- Zijn hetzij van een konijn anti-laminine (01:30) of muis anti-dystrofine (01:30) primair antilichaam in blokkeerbuffer de secties voor 2 uur bij kamertemperatuur (of overnacht bij 4 ° C) in een vochtige kamer.
- Was de secties met 1x PBS gedurende 5 minuten.
- Verwijder de wasbuffer wassen gedeelten weer in 1x PBS gedurende 5 minuten.
- Verwijder de wasbuffer en pas een goede fluorescerende secundair antilichaam (1: 1000 in blokkerende buffer) aan de secties in een vochtige kamer gedurende 1 uur bij KT.
- Verwijder het secundaire antilichaam en was de secties met 1x PBS gedurende 5min.
- Verwijder de wasbuffer en herhaal het wassen met 1x PBS gedurende 5 minuten. Verwijder de wasbuffer en dek de secties met een deksel glas met behulp van een op water gebaseerde medium.
- Identificeer de morfologische kenmerken van de spier met behulp van digitale beelden van de gekleurde sectie. Om dit te doen, gebruik maken van een omgekeerde tl-licht microscoop voor IF secties (een 10X of 20x vergroting doelstelling is van toepassing), samen met een digitale camera en image capture software. Plaats een schaal bar in elk digitaal beeld (20 - 30 willekeurige velden worden aanbevolen voor elke spier sectie) aan de kwantificering van de CSA te vergemakkelijken. Afbeeldingen moeten in .TIF formaat worden opgeslagen compatibel is met de beeldanalyse software met behulp van de ImageJ programma.
- Gebruik een ImageJ macro bindweefsel van contractiele weefsel (spiervezeloriėntaties grootte) onderscheiden door de aanwezigheid van het fluorescerende secundaire antilichaam in de endomysium 20.
LET OP: De macro en instructies zijn verkrijgbaar bij de authenticatieors, Richard Lieber en Shannon Bremner. - Open het ImageJ programma door te dubbelklikken op het pictogram op het bureaublad.
- Laad de CSA macro door één keer op het tabblad "Plugins" klikken. Beweeg de cursor naar beneden om de optie "Install" selecteren door eenmaal op te klikken.
- Laad de dwarsdoorsnede macro door deze uit de map het is in gered te selecteren, en klik op "Open".
- Zodra de macro is geopend, opent u de histologische afbeelding met de schaal bar door te klikken op "File" en vervolgens op "Open" in de werkbalk ImageJ.
- Zodra de afbeelding is geopend, selecteert u de "straight line tool" in het ImageJ programma door te klikken op het icoontje met de rechte lijn.
- Zodra de "Straight line tool" is geselecteerd, klikt u eenmaal op de meest linkse kant van de schaal bar en klik eenmaal op de meest rechtse kant van de schaal bar. Wanneer correct gedaan, moet er een gele lijn overlay op de schaal bar.
- Ervoor zorgen dat de yellow lijn is nog steeds bedekt op de schaal bar, selecteer de "Analyseren" tab op de werkbalk ImageJ door eenmaal te klikken.
- In het tabblad "Analyseren" Beweeg de cursor naar beneden en kies je 'schaal' door eenmaal op te klikken.
- In het venster "Set schaal", NIET de waarde in de "Distance in pixels" vak te veranderen. Voer de bekende afstand van de schaal bar in het vak "bekende afstand". Verander de eenheden in de "Eenheid van lengte" doos te corresponderen met de schaal bar eenheden (dwz, micrometer = pm). Selecteer ten slotte "globale" door te klikken op het vak aan de linkerkant van de "Global" eens.
- Sluit het venster "Set schaal".
- Open het eerste beeld te meten door op de "O" knop op het toetsenbord. Observeer een venster pop-up waarmee de gebruiker te vinden en selecteer de afbeelding te meten vanuit de map deze is in opgeslagen. Selecteer het beeld door te klikken op het een keer en vervolgens te klikken op 'Openen'. <li> Eenmaal geopend, moet er een venster voor de selectie van het aanvaardbare bereik voor CSA metingen en voor circulariteit.
- Na het instellen van de CSA assortiment en cirkelvormigheid, observeer het beeld bedekt met rode pixels met een raam 'Threshold'. Stel de drempel van het beeld met behulp van de bars in het venster 'Threshold' totdat de spiervezels nauwkeurig worden ingevuld met rode pixels.
OPMERKING: Probeer de grootste aantal vezels die niet raken elkaar te verkrijgen; Als vezels elkaar raken, worden ze gemeten worden als één grote vezel, die zal moeten downstream worden bewerkt. - Na het instellen van de drempel, druk op de "1" toets op het toetsenbord om de spiervezels te meten.
- Cirkel van de individuele spiervezels met een gele lijn.Beweeg door het beeld en verwijder artefacten of dubbele vezels die zijn geselecteerd door het programma. Om dit te doen, selecteert u de structuren die niet zijn vezels door ze eenmaal op te klikken en druk op de "D" knop op het toetsenbord. Dit zal ze te verwijderen uit de metingen.
- Selecteer en kopieer de metingen van de "Meetwaarde venster," en plak ze in een spreadsheet voor verdere analyse.
NB: De verkregen waarden kunnen ook worden gebruikt om de vezel distributieanalyse, die in het algemeen bruikbare parameter vertegenwoordigt bepalen of tumorgroei bevordert een verschuiving naar kleinere spiervezels beoordelen. - Sluit alle geopende vensters in ImageJ door te klikken op de "X" in de linkerbovenhoek van de ramen.
- Open een nieuwe afbeelding te meten door te drukken op "O" en het herhalen van de stappen 8,24-8,29.
LET OP: Deze instellingen zijn meestal overgelaten aan hun standaardwaarden. Echter, als men wil deze instellingen te wijzigen, moet u de waarden hetzelfde te houden voor elk beeld op rij te meten in het experiment.
9. Evaluatie van de spiervezeloriėntaties Maat van H & E gekleurde coupes (Alternatief 2)
- Plaats het glasdia's in Coplin potten met daarin gefilterd Harris hematoxyline gedurende 8 minuten.
OPMERKING: U Mayer hematoxyline kan worden als een minder intense vlek gewenst is gebruikt. - Spoel de dia's in gedemineraliseerd water.
- Dompel de dia's in kraanwater voor maximaal 5 min.
- ze snel spoelen in gedeïoniseerd water, en vervolgens te incuberen in gefiltreerde 1% eosine oplossing minder dan 2 minuten.
OPMERKING: als een meer intense kleuring gewenst, voeg 1-2 druppels azijnzuur (0,01% of minder) aan de eosine-oplossing. - Begin de uitdroging stappen. Spoel de glaasjes in 70% ethanol gedurende minder dan 1 minuut.
- Dompel de glaasjes in 90% ethanol gedurende 1 minuut.
- Dompel de glaasjes in 95% ethanol gedurende 1 minuut.
- Dompel de objectglaasjes in 100% ethanol gedurende 2 minuten.
- Dompel de objectglaasjes in xyleen gedurende 2 min. Verplaats de dia's naar een andere Copley pot met verse xyleen gedurende 2 min.
LET OP: Houd de dia's in xyleen (niet langer dan 1 uur) tot ze worden afgedekt. - Plaats de coverslips op de spier gebieden af met Permount of xyleen gebaseerde fixeermiddel keuze.
- Houd u aan de H & E-glas dia's onder een microscoop met een 20x vergroting, en het verwerven van foto's van de hele spier sectie omgeving. Verkrijgen van beelden met behulp van een fel licht microscoop, digitale camera en beeld capture software.
OPMERKING: De aanwezigheid van een schaalbalk of afbeelding van een micrometer genomen bij dezelfde vergroting nodig zijn om de CSA te bepalen. Zoals hierboven plaat tenminste 20 - 30 willekeurige velden per spiersectie. - Evalueer de spiervezeloriėntaties formaat met behulp van ImageJ software. Open elke digitaal beeld. Zet de schaal zoals hierboven. Meet minstens 1500-2000 spiervezels per spier met behulp van de vrije hand selectie-instrument, het traceren van de vezel omtrek met een muis of een, voor snellere invoer, met een tablet invoerapparaat en pen.
10. gegevensverzameling en analyse
- Om spiervezels grootte vast te stellen, beoordeelt de gemiddelde vezel "gebied."Bereken middelen en SD voor de voor elke spier, dat zowel de stippellijn Feret de diameter metingen. Daarnaast om te beoordelen of de experimentele setting wordt geassocieerd met een verschuiving naar ofwel kleiner of groter spiervezels, analyseren de" vezelverdelingskromme . '
- Evalueer de betekenis van het resultaat van het uitvoeren van een ongepaarde t-test voor twee groepen. Bepaal de verhoudingen tussen de waarden voor de C26 muizen groep en de controlegroep. Plot van de waarden in een grafiek rapportage van de middelen SD en de frequentieverdeling / histogram gericht op het aantonen van de verschuiving in de vezel maten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C26 tumorgroei kinetiek tonen een vertragingsfase de eerste 7-8 d na injectie, gevolgd door exponentiële celgroei (4-5 d). De tumormassa bereikt uiteindelijk ~ 10% van het lichaamsgewicht (ongeveer 2 g Figuur 1A-B). Tijdens de eerste fase kan de tumor worden gelokaliseerd door palpatie en alleen verschijnt als een kleine uitstulping van de huid. In de tweede fase wordt de tumor waargenomen als een massa onder de huid. Zelden wordt de tumor zweren, waardoor een open wonde; in dit geval wordt de muis buiten de experimentele groep en humaan gedood.
Lichaamsgewicht onveranderd in de eerste fase, maar wordt aanzienlijk verminderd in de tweede fase, wanneer het 10 bereikt - 15% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht (30% bij tumorvrije gewicht Figuur 1A). Tumordragende muizen lijken verspild en liet verwarde pels aan het einde van deexperimentele periode, met een lichaamsconditie (BC) score gelijk is aan 1 of 18 (figuur 1C). BC1 vertegenwoordigt een ernstig uitgehongerd muis, waarbij het skelet structuren zijn duidelijk en de wervels zijn duidelijk gesegmenteerd. Gewichtsverlies is voornamelijk toe te schrijven aan zowel de skeletspieren en vetweefsel wasting (Figuur 1B). Gewichtsverlies stemt overeen met een reductie van ongeveer 20 - 30% in gewicht skeletspier, in het bijzonder in de gastrocnemius, tibialis anterior en quadriceps (figuur 2). De hartspier is verkleind in gewicht, hoewel in mindere mate in vergelijking met de andere skeletspieren (figuur 2). Interessant hepatomegalie (+ 16%, p <0,01) en splenomegalie (+ 110%, p <0,01) in het algemeen aangetroffen in tumor gastheren, terwijl vetmassa, vergelijkbaar met skeletspier, ernstig uitgeput (-70%, p <0,001 Figuur 3).
(Figuur 4A-B). Met name de frequentieverdeling analyse toonde een verschuiving naar kleinere grootte vezels in C26-dragende muizen, wat erop wijst dat de gehele spier atrofie ondergaat in aanwezigheid van een C26 tumor (Figuur 4C). Soortgelijke resultaten kunnen worden waargenomen door gebruik te maken van een traditionele HE-gebaseerde methodologie voor het kwantificeren van vezelgrootte, hoewel de omvang van de verandering in de spier CSA geassocieerd met kankergroei iets anders (38% versus controle, p <0,01 voor de IF gevestigde werkwijze; -18% versus controle, p <0,01 voor H & E-gebaseerde methode Figuur 5).
Figuur 1: Body Gewichten in Controle en C26-dragende muizen. A) Lichaamsgewicht curve in de controle en C26 gastheren over de gehele experimentele periode (14 dagen na tumor injectie). B) Initiële lichaamsgewicht (IBW), final tumor-vrij lichaamsgewicht (FBW), en tumor gewicht onder controle en C26- dragende dieren. C) Representatieve beelden van de controles en C26-dragers ten tijde van opoffering (dag 14 na tumor inoculatie). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. n = 6. Belang van de verschillen: * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001 ten opzichte van de controlegroep met behulp van t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Muscle Gewichten in Controle en C26-dragende muizen. De tibialis, gastrocnemius, quadriceps, en hart gewichten in controle en C26 tumor-dragers worden gerapporteerd als het gewicht / 100 mg IBW. De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± SD. n = 6. Belang van de verschillen: ** p <0,01 en *** p <0,001 versus de controlegroep behulp t-toets.
Figuur 3:. Het gewicht van organen Controle en C26-dragende muizen De lever, milt en epididymaal vetkussentje gewichten controle en C26 tumor-dragers worden vermeld als gewicht / 100 mg IBW. De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± SD. n = 6. Belang van de verschillen: ** p <0,01 versus de controlegroep.
Figuur 4: Morphometry voor spiervezeloriėntaties Size door immunofluorescentie. A) TL immunohistochemische reactie van tibialis secties gebruik van een anti-dystrofine antilichaam (Vector Laboratories) van de bedienings- en C26 gastheren. Vergroting: 10X. Grootte bar. 100 um B) Kwantificering van CSA in de tibialis gemeten met de ImageJ macro C) Frequentie verdeling van CSA in de tibialis spier van controle en C26-dragende muizen.. De gegevens zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. n = 6 voor elke groep. Significantie van de verschillen: ** p <0,01 versus de controlegroep behulp t-toets.
Figuur 5: Morphometry voor spiervezeloriėntaties Maat door H & E. A) hematoxyline & eosine kleuring van tibialis secties van de bedienings- en C26 gastheren. Vergroting: 20X. Grootte bar. 100 um B) Kwantificatie en frequentieverdeling vanCSA in de tibialis spier. De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± SD. n = 6. Belang van de verschillen: *** p <0,001 versus de controlegroep behulp t-toets.
| auteurs | muizenstam | muis geslacht | Gsm-nummer | Oorsprong | Geïmplanteerd als vaste tumor? | Injectieplaats | dagen |
| Lazarus et al., 1999 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NCI | NEE | regio dorsale | 17 |
| Al-Majid en McCarthy, 2001 | CD2F1 | F | 2,5 x 10 6 | OSUMC | NEE | regio dorsale | 17 |
| Samuels et al., 2001 | Balb / c | M | 0,5 g / ml suspensie tumor | NS | JA | regio dorsale | Tot 11 |
| Acharyya et al., 2004 | CD2F1 | M | 1 x 10 7 | OSUMC | NEE | rechterflank | Tot 24 |
| Aulino et al., 2010 | Balb / c | NS | 0,5 mm 3 | NCI | JA | regio dorsale | 21 |
| Benny-Klimek et al., 2010 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NEE | regio dorsale | 14 |
| Bonetto et al, 2011.; 2012 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NEE | regio dorsale | |
| Cosper en Leinwand, 2010 | CD2F1 | M + F | 5 x 10 5 | NS | NEE | rechterflank | Tot 27 |
| Murphy et al., 2012 | CD2F1 | NS | 5 x 10 5 | NCI / OSUMC | NEE | regio dorsale | 14 |
| Cornwell et al., 2014 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NCI | NEE | Rechter & Linker flank | Tot 26 |
| Assi et al., 2016 | Balb / c | NS | 1 x 10 6 | Cell Line Service | NEE | regio dorsale | Tot 22 |
Tabel 1:. Vergelijking van de verschillende protocollen voor C26 Implantatie Verschilt protocollen voor C26 implantatie worden voorzien, met name over de muizenstam gebruikt, het aantal cellen en type tumor geïnoculeerd, de cel oorsprong, de injectieplaats, en de lengte van de experimentele periode. OSUMC: Ohio State University Medical Center. NCI: National Cancer Institute. Commerciële cellijn dienst NS: niet gespecificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vooral in de laatste stadia wordt colorectaal kanker geassocieerd met de ontwikkeling van cachexie, dat verantwoordelijk is voor slechtere resultaten en vermindering van levenskwaliteit van de patiënt. Vele studies hebben zich gericht op de behandeling van aandoeningen secundair aan kanker; Ondanks vele pogingen in deze richting is er nog geen goedgekeurde therapie voor kanker cachexie 21. Derhalve is het noodzakelijk dat diermodellen lijken op humane pathologie zo nauw mogelijk om de vertaling van bevindingen maximaliseren.
C26-tumor-dragende muizen een veel gebruikte experimentele model van kanker cachexie 22-24. Dit model lijkt sterk op de menselijke ziekte, tonen verlagingen lichaam, spieren en vetmassa, alsmede spiervezel atrofie en verhoogde expressie van inflammatoire genen en ubiquitine ligasen overeenstemming met gemarkeerde eiwit hyperkatabolisme 2,5. Ondanks dit, een paar verschillen met de gegevens die zijn verkregen bij kanker PatieNTS gemeld 25,26. Sterker nog, een aantal kenmerken van het model, met inbegrip van de non-fysiologische groei omgeving (bijvoorbeeld, een buitenbaarmoederlijke tumor gegroeid subcutaan in plaats van orthotopically geïmplanteerd in het maag-darmkanaal), de relatief korte experimentele periode in vergelijking met andere modellen (zoals genetische of orthotope injectie van tumoren), de afhankelijkheid van IL-6 actie, en het noodzakelijke gebruik van CD2F1 of Balb / c muizen kan ernstige beperkingen te vertegenwoordigen en kan de interpretatie van de resultaten te beperken.
Het huidige protocol heeft bewezen zeer reproduceerbare in vele experimenten in ons laboratorium, met behoud van dezelfde kenmerken en toelaat vergelijkingen tussen de resultaten verkregen op verschillende tijdstippen te zijn in verschillende geografische locaties, en door verschillende onderzoekers 3,10. Echter, om de reproduceerbaarheid van de gegevens te bevorderen, is het belangrijk om duidelijke en van gezamenlijke richtlijnen.
zoals gathered uit de literatuur, kan enkele restricties de reproductie van dezelfde gegevens voorkomen in twee verschillende laboratoria. Om dezelfde redenen kan het gebruik van verschillende protocollen verschillende fenotypes en resultaten, alsmede leiden tot tegenstrijdige en twijfelachtige resultaten oplevert. Inderdaad geven de verschillen in de uitvoering van dit diermodel gemeld, voornamelijk door de stam (Balb / c of CD2F1) 2,5,27-29 of het geslacht van muizen die 17, het type tumor dat was geïmplanteerd (een celsuspensie 3 , 29 in plaats van een vaste tumor in een graft 2,30), de tumor bron (NCI, ATCC of OSUMC), het aantal C26 cellen die werden geïnjecteerd en de plaats van injectie of implantatie (de flanken 6,17, 31 of de dorsale regio 3,10,32). Geen directe vergelijking van de effecten in verband met de implantatie van C26 cellijnen verkregen uit verschillende bronnen (voornamelijk OSUMC versus NCI) ooit is uitgevoerd, waardoor we voorkomen tekenen definitieve conclusions. Het is echter waarschijnlijk dat de keuze van de bron van cellen kan ook aanzienlijk beïnvloeden de verwachte resultaten. Bij het overwegen van de keuze van de mannen versus vrouwen, moeten onderzoekers herinnerd worden aan significante verschillen in de uitkomsten. Zoals gerapporteerd door Cosper en Leinwand 17, man-tumordragende muizen, door het ontbreken van oestrogenen, kan een ernstiger fenotype dan vrouwtjes en een versterkte cardiale massaverlies en mortaliteit, een robuustere pro-inflammatoire reactie op de tumor tonen , en een grotere cardiale autofagie.
Speciaal voor de onderzoekers die niet bekend zijn met dit model en aanvankelijk geconfronteerd met problemen via zowel een poweranalyse en onze ervaring, het gebruik van ten minste 6 dieren per experimentele conditie (n = 6) wordt aanbevolen om statistisch detecteren significante verschillen. Het is ook belangrijk dat randomisatie zorgvuldig wordt uitgevoerd, zodat aanvankelijke lichaamsgewicht bij de proefdierenniet significant verschillen tussen groepen. Evenzo wordt geadviseerd dat, om inter-operator variabiliteit voorkomen, dezelfde onderzoeker voert de weefsels en organen collectie op elk dier. Verder is het noodzakelijk dat weefsels (vooral spier) zo snel mogelijk ingevroren om de RNAs en enzymatische structuur en activiteit behouden, vooral wanneer het doel van de studie is om genexpressie te beoordelen of enzymatische activiteiten te evalueren. Bovendien, in de poging om spieren CSA te bepalen, hebben we aangetoond dat het melden van het vezeloppervlak wordt algemeen aanvaard en representatief spiervezel formaat. Hier presenteren we twee verschillende methodes om spier CSA beoordelen. Zoals getoond in figuren 4-5, beide methoden konden een significante vermindering van myofiber grootte tussen controle en tumor gastheren detecteren, hoewel de mate van verspilling verschillende verscheen.
Deze discrepantie kan voortvloeien uit het feit dat, hoewel beide methoden aanvaardbaar manieren ezelss spiervezel formaat, kwantificering spier kenmerken van H & E-gekleurde coupes nog een manuele of semi-automatisch proces, meestal arbeidsintensieve, tijdrovende en met geringe nauwkeurigheid. Gebaseerd op onze ervaring, geloven wij dat de IF-gebaseerde methode geeft beter techniek om spier CSA melden. Inderdaad, het aantal vezels die automatisch kan worden gemeten door gebruik te maken van deze techniek is aanzienlijk groter, waardoor de nauwkeurigheid van de meting verhogen. Van de nota, voor beide technieken, een alternatieve wijze van rapporteren spiermassa wordt het beoordelen van de diameter van de Feret's. Interessant is dat deze wordt beschouwd als een zeer betrouwbaar instrument vanwege het feit dat deze parameter is grotendeels onafhankelijk van de hoek snijden. Andere parameters, zoals de "minimale binnendiameter" en "minimale buitendiameter" ook ongevoelig voor het vlak van snijden en kan worden gebruikt in plaats van de diameter van de Feret als alternatieve aanduidingen van de fibER grootte.
Concluderend, hoewel de cachexie gemeenschap moet duidelijk meer fysiologische modellen stellen voor de studie van tumor geassocieerde spieratrofie, geloven wij dat muizen met de C26 coloncarcinoom vormen een goed gestandaardiseerde en gemakkelijk te gebruiken model moleculaire veranderingen te onderzoeken en fysiologische afwijkingen meestal ontdekt na het optreden van een tumor. Toekomstige toepassingen zal het onderzoek naar de vraag of orthotope implantatie van C26 cellen in de dikke darm een goede en meer fysiologische model van colorectale kanker cachexia zouden kunnen betekenen betrekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Flasks | Falcon - Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
- Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
- Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
- Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
- Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
- Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
- Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
- Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
- Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
- Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
- Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
- Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
- Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
- Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
- Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
- Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
- Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
- Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
- Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
- Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
- Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
- Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
- Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
- Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
- Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
- al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
- Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
- Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
- Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).
