Introduction
La fonte musculaire est une complication grave de différentes affections cliniques telles que le cancer, la septicémie, le foie, la cirrhose, l'insuffisance cardiaque et rénale, une maladie pulmonaire obstructive chronique, et le SIDA. En particulier, la fonte musculaire se manifeste dans au moins 50% des patients atteints d' un cancer 1. La perte de muscle squelettique dans le cancer résulte d'une dégradation accrue des protéines en raison de la sur-activation des systèmes squelettique protéolytiques musculaire et / ou de diminution de la synthèse des protéines 6. La lipolyse est également évidente, ce qui conduit à la destruction du tissu adipeux. Cliniquement, la cachexie est associée à une qualité réduite et la durée de vie et est estimée à être la cause de la mort dans 20 - 30% des patients atteints de cancer 7. L'utilisation de modèles expérimentaux qui ressemblent à la maladie humaine aussi près que possible serait bénéfique. Un modèle animal optimale se caractérise par une grande reproductibilité, ainsi que par une interférence limitée de différentes thérapies et des facteurs imprévisiblesl' alimentation, le sexe, et le fond génétique qui sont habituellement associés à l'état clinique 8. Jusqu'à présent, la cachexie cancéreuse a été étudiée principalement sur des modèles animaux caractérisés par la transplantation de cellules cancéreuses ou l'injection de substances cancérigènes, bien qu'une nouvelle méthode consiste à utiliser des souris transgéniques sensibles au développement d'un cancer.
Les souris portant le carcinome du C26 (également appelés côlon-26 et adénocarcinomes) représentent un modèle bien caractérisé et largement utilisé de la cachexie du cancer 2,5. La croissance des résultats de la tumeur C26 dans le corps et la perte de poids de muscle, principalement grâce à une meilleure graisse et de protéines catabolisme 9. En règle générale, une masse tumorale de 10% par rapport poids total du corps est associée à une réduction de 20 à 25% en poids du muscle squelettique et une plus grande diminution de la graisse de 3,10. Hépatomégalie et une splénomégalie sont également observées avec la croissance tumorale, ainsi que l'activation de la réponse en phase aiguë et l'élévation de la pro-inflales niveaux de cytokine mmatory 3,11. Parmi ceux - ci, il est bien connu que l' IL-6 joue un rôle central dans la médiation de l' atrophie musculaire dans le modèle C26, même si cette cytokine est probablement pas le seul inducteur de la cachexie 12. Élévation de l' IL-6 provoque une atrophie musculaire grâce à l' activation de la voie JAK / STAT3, et l' inhibition de ce facteur de transcription peut empêcher la perte de masse musculaire 3,4.
Pendant la fonte musculaire C26-induite, comme dans de nombreuses conditions de l' atrophie musculaire, la masse musculaire est perdu en grande partie grâce à des réductions dans le muscle teneur en protéines à travers les fibres musculaires, non pas par la mort cellulaire ou de la perte de fibres 13. Dans C26 cachexie, un déplacement vers les zones transversales plus petites est observée dans les deux fibres glycolytiques et oxydatives 2. Ceci est également compatible avec réduit la force musculaire 5. De nombreux groupes à travers le monde ont profité du modèle C26 afin de découvrir de nouveaux médiateurs de l'atrophie musculaire ou de médicaments cliniquement pertinentes pour le cancer cacHEXIA. Cependant, de nombreuses procédures différentes pour l'utilisation de ce modèle ont été rapportés, ce qui soulève des préoccupations quant à la cohérence des données obtenues et présentant des obstacles à la reproductibilité dans différentes conditions expérimentales. Nous rapportons ici une utilisation typique de ce modèle pour l'étude de la cachexie du cancer qui produit des données normalisées et reproductibles.
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Protocol
Déclaration éthique: Toutes les études décrites ont été approuvées par les soins et l'utilisation des comités institutionnels animales de l'Université Thomas Jefferson et École de médecine de l'Université d'Indiana.
1. C26 croissance cellulaire et préparation
- Obtenir des cellules de cancer colorectal C26 (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) et préparer le milieu de croissance complet (milieu de Eagle modifié de savoir, de haute glucose Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), du pyruvate de sodium 1 mM, 1% glutamine et 1% de streptomycine / pénicilline).
NOTE: Afin de permettre une meilleure reproductibilité inter-expérimentale, il est préférable d'utiliser des cellules C26 à un passage aussi bas que possible. - Utiliser un compteur de cellules disponible dans le commerce à la plaque de 50.000 cellules / cm2 dans des flacons avec du milieu de croissance complet. Incuber dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à ce que la sous-confluentes. Évitez les cultiver à haute densité prevdifférenciation ent et dérive des phénotypes cellulaires.
- Après le premier passage, suffisamment de cellules de la plaque à implanter dans le nombre prévu d'animaux. Le jour de l' implantation des cellules, la dissociation des cellules par trypsination avec une solution de 0,02 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par cm 2, de neutraliser la trypsine en ajoutant au moins 3 ml de milieu frais par ml de trypsine, de déterminer la concentration cellulaire dans les cellules / ml et remettre en suspension le nombre de cellules nécessaires pour l'expérience (1 x 10 6 cellules par souris) dans du PBS stérile.
REMARQUE: Les cellules atteignent la confluence C26 lorsque la densité est d' environ 500 000 cellules / cm2.
2. Souris
- Randomize adultes CD2F1 souris (au moins 8 semaines d'âge) en groupes (contrôle habituellement et tumoraux porteurs) avec au moins n = 6 par groupe.
NOTE: Les tumeurs C26 poussent dans des souris Balb / c aussi bien. Cependant, d'après notre expérience, les souris CD2F1 représentent un hôte plus polyvalent et économique pour ce modèle particulier de tumeur. De plus,similaires aux paramètres cliniques et aux résultats rapportés dans d' autres modèles expérimentaux de muscle associé au cancer de gaspiller 14-16, les différences de sexe dans la réponse à C26 cachexie peut également être observé 17 (voir également le tableau 1). - Anesthésier la souris à l'aide d'isoflurane par inhalation (3% d'oxygène). Maintenir l'animal sous anesthésie exclusivement pendant le temps nécessaire pour effectuer l'inoculation de la tumeur. Assurez-vous que la souris se trouve sur un coussin chauffant afin d'éviter la perte de chaleur corporelle. Avant de commencer la procédure d'injection de la tumeur, confirmer anesthetization correcte en pinçant doucement les orteils arrière.
NOTE: En raison de la durée de cette procédure (généralement quelques secondes), l'utilisation de pommade oculaire vétérinaire est pas nécessaire. Pour la même raison, les animaux témoins subissant l'opération fictive ne devraient pas perdre du poids. - En utilisant une seringue de 1 ml d'insuline stérile avec une aiguille de calibre 26, d'injecter rapidement 250 ul de la solution contenant le tumor cellules sous-cutanée et intrascapularly dans le pad de la souris de graisse.
REMARQUE: Les animaux témoins reçoivent 250 ul de solution saline stérile intrascapularly dans le coussinet adipeux. - Placez le dos de l'animal dans sa cage. Observer directement la souris au moins une fois toutes les 15 minutes jusqu'à ce qu'il puisse répondre à la manipulation douce et a retrouvé un réflexe de redressement.
REMARQUE: Ne pas laisser la souris sans surveillance, et le garder dans une cage de récupération à chaud qui contient un substrat solide. En outre, ne pas retourner la souris à la salle des animaux jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli de l'anesthésie. En général, les souris ne doivent pas nécessairement être logés individuellement à moins que le chercheur a pour but d'évaluer la prise alimentaire individuelle. Si tel est le cas et l'utilisation de cages métaboliques automatiques ne sont pas disponibles, l'enregistrement manuel de la consommation alimentaire doit être effectuée, éventuellement tous les jours et à la même heure chaque jour. - Vérifiez les souris quotidiennement et enregistrer leur poids corporel.
REMARQUE: Enregistrement de la note d'état corporel etcomportements à la maison de la cage peuvent différencier les degrés de la cachexie et la maladie comportement, ce qui est utile pour les études de traitement 18.
3. Euthanasie et de prélèvement sanguin
- Lorsque la perte de poids corporel chez les hôtes de la tumeur par rapport aux témoins atteint 5%, 10% ou 15% (cachexie légère, modérée et sévère, respectivement) par rapport à leur poids corporel initial, euthanasier les souris.
NOTE: Une expérience typique sera effectuée jusqu'à ce qu'un groupe atteint 10% de perte de poids, sur laquelle tous les groupes sont euthanasiés. Perte de poids corporel est évaluée en mesurant le poids du corps y compris de la tumeur. - Placer la souris sous anesthésie générale à l'isoflurane (3% d'oxygène). Prélever du sang au moyen d'une ponction cardiaque (environ 1 - 1,5 ml).
- Recueillir le sang dans K 2 EDTA (18 mg) tubes vides et placez - les sur la glace. Centrifuger le sang (2000 xg pendant 15 min à 4 ° C) et recueillir le plasma / sérum.
- Euthanasier la souris au moyen de cdislocation ervical. Passez à l'excision des tissus et de la collecte d'organes.
4. tissus et d'organes Excision
NOTE: Pour l'utilisation de tissus dans des analyses de biologie biochimiques ou moléculaires, l'intention de peser chaque organe et de tissu et placer immédiatement un fragment dans des cryotubes pré-étiquetés. Snap congeler dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.
- Afin d'éviter la contamination des échantillons de tissus avec de la fourrure, vaporisez éthanol à 70% sur tout le corps.
- Placez la souris sur un lit de dissection dans une position couchée et étendre une branche verticale en fixant le pied à une burette clamp élevée.
- Attrapez la peau du membre inférieur avec une pince Dumont et utiliser les ciseaux fins incurvées pour enlever délicatement la peau et le fascia, exposant les ventres musculaires sous-jacents du membre inférieur.
- Identifier le muscle gastrocnémien sur le membre postérieur inférieur par son origine au niveau des condyles latéral et médial du fémur sur le postérieur et son insertion àcalcanéum via le tendon calcanéen.
- Passez à couper le tendon gastrocnémien calcanéenne. Saisir l'extrémité distale du gastrocnémien avec une pince Dumont et tirez sur le ventre du muscle vers son origine. Avec des ciseaux, couper le muscle à l'origine aussi près que possible du fémur. Placez le muscle dans un plat. Peser immédiatement et de les congeler dans un tube dans de l'azote liquide.
REMARQUE: Veillez à ne pas exciser le muscle soléaire ainsi que le gastrocnémien. Si cela se produit, retirez soigneusement soléaire en tirant doucement le tout avec la pince.
- Passez à couper le tendon gastrocnémien calcanéenne. Saisir l'extrémité distale du gastrocnémien avec une pince Dumont et tirez sur le ventre du muscle vers son origine. Avec des ciseaux, couper le muscle à l'origine aussi près que possible du fémur. Placez le muscle dans un plat. Peser immédiatement et de les congeler dans un tube dans de l'azote liquide.
- Passez à identifier et exciser le muscle tibial antérieur de son origine à la surface antérolatérale du tibia et son insertion au cunéiforme via son tendon distal.
- Afin d'avoir un effet de levier, maintenir le pied en saisissant les chiffres avec l'index et le pouce. Insérer la pointe d'une pince Dumont immédiatement sous le tendon distal superficiel du jambier et déplacer la pince de telle sorte que le blcôté unt peut être utilisé pour détacher le ventre jambier musculaire du tissu conjonctif sous-jacent.
- Couper le tendon distal à l'aide des ciseaux courbes fines, puis couper le muscle à l'origine, aussi près que possible au tibia.
- Ouvrez la cavité abdominale en effectuant une incision sagittale à partir de la région hypogastrique et le déplacement supérieurement à la région épigastrique, arrêter l'incision juste au-dessus du diaphragme.
NOTE: La profondeur de l'incision ne doit être suffisante pour rompre la paroi musculaire abdominale et le fascia péritonéale sous-jacente. - Retirez délicatement le foie en le saisissant avec les pinces épointées, et d'utiliser les ciseaux courbes fines pour disséquer des vaisseaux sanguins ou du tissu conjonctif qui adhèrent le foie à la cavité. Prenez soin de ne pas laisser de lobes derrière. Peser et enclenchez geler le foie dans un tube dans de l'azote liquide.
- Utilisation de la pince épointées, éloignez l'intestin, puis exposer et délicatement retirerla rate. Attrapez la rate doucement avec les pinces épointées et utiliser le dos ou le côté émoussé des ciseaux courbes fines pour disséquer des tissus ou des vaisseaux sanguins conjonctifs adhérentes de la rate à la cavité. Peser et enclenchez le congeler dans un tube dans de l'azote liquide.
- Identifier les coussinets adipeux gonadiques, à côté de l'épididyme (chez les hommes) ou de l'utérus (chez les femmes). Saisir doucement le coussinet adipeux de l'épididyme avec les pinces épointées et tirer le tissu hors de la cavité. En utilisant les ciseaux courbes fines, couper tout tissu gonadique qui peut être attaché au coussinet adipeux. Peser le coussinet adipeux et enclenchez le congeler dans un tube dans de l'azote liquide.
NOTE: En général, ce tissu adipeux est considéré comme représentatif de la masse totale de graisse corporelle chez les souris et diminue de poids avec la cachexie. D'autres tampons de graisse peuvent être identifiés de manière similaire, disséqués, enlevés, et pesés. - Utilisez les ciseaux fins incurvées pour ouvrir le coffre de l'animal. Coupez les côtes attachées aux deux bords latéraux de la sternum. Retirez le sternum. L'utilisation de deux paires de pinces, saisir chaque côté de la cage thoracique et tirez chaque côté latéralement pour ouvrir la cavité thoracique.
- Délicatement tirer le coeur avec la pince. exciser soigneusement le coeur avec les ciseaux fins incurvées en sectionnant l'aorte à l'oreillette gauche. Assurez-vous de vider l'organe de tout sang résiduel par délicatement buvard contre du papier absorbant. Peser et enclenchez le congeler dans un tube dans de l'azote liquide.
5. Muscle de congélation et de montage
- Immerger la moitié inférieure d'un petit bêcher en matière plastique (50 ml) contenant de l'isopentane dans de l'azote liquide. L'isopentane est prêt à utiliser quand il devient légèrement visqueux et forme un revêtement stratifié solide blanc à l'intérieur du bêcher (température: -160 ° C).
REMARQUE: Toujours utiliser des outils anti-étincelles à la main en bronze ou en aluminium. Éviter de respirer les vapeurs du produit. Utiliser avec une ventilation adéquate. Si vous traitez avec un déversement et de ventilation est impossible ou impractical, porter un appareil respiratoire approprié. - Geler un certain milieu d'enrobage sur un mandrin (liège) en le plongeant brièvement (10 sec) en isopentane.
- Traiter le muscle (par ex., Le jambier ou gastrocnémien) en le tenant par le tendon, verticalement par rapport au bouchon, afin de maintenir l'orientation des fibres et pour permettre des coupes transversales.
- Positionner soigneusement la partie d'extrémité du muscle frais sur le dessus du milieu d'enrobage congelé.
NOTE: Le muscle va coller. Il est important de ne pas entourer complètement le muscle avec milieu d'inclusion. Il est également important de maintenir l'orientation verticale pour la détermination ultérieure de la surface en coupe transversale. - Tremper le mandrin avec le muscle attaché dans le bain d'isopentane (le temps de congélation est habituel 7-15 s, en fonction de la taille de l'échantillon et de la composition).
NOTE: L'immersion dans la solution de congélation ne doit pas durer plus que nécessaire de geler complètement le spécimen. Congélation trop longtemps volonté fracture du bloc de tissu, alors que trop peu de temps va provoquer la formation de cristaux de glace. Un spécimen bien congelés sera blanc crayeux. - Après congélation de l'échantillon, le placer dans un petit sac en plastique ou un tube d'échantillon (50 ml) et immédiatement le stocker dans un congélateur à -80 ° C ou dans de l'azote liquide.
6. Analyse des données brutes
- Afin de contrôler les variations de la taille des souris, normaliser le poids corporel final (FBW); poids corporel sans tumeur; et la carcasse, l'orgue et le poids des tissus (exprimée en grammes) en fonction du poids corporel initial (IBW), et de les exprimer comme "poids / 100 mg IBW".
NOTE: Par ailleurs, certains enquêteurs normaliser la masse musculaire à la longueur du tibia. - Utilisez un logiciel d'analyse des données. Trouver la moyenne et SD des poids normalisés. Effectuer une analyse statistique avec des tests t de Student non apparié entre les contrôles et les souris C26-portant.
REMARQUE: Les résultats peuvent être présentés par rapport au corps (IBWet poids FBW) sans tumeur, tumeur, organes et tissus.
7. Muscle Sectionnement
- Réglez la température de travail de la chambre intérieure cryostat à environ -23 ° C.
- Laisser l'échantillon (précédemment stocké à -80 ° C) à s'acclimater à la température de travail (quelques heures devrait être suffisant).
- Cut multiples 8 um sections épaisses de l'échantillon (de préférence le jambier antérieur ou muscles gastrocnémiens) et les recueillir sur des lames de verre.
NOTE: Couper la section dans la région mi-ventre du muscle. En outre, par souci de précision, couper les sections perpendiculairement à l'axe de montage. - Gardez les lames de verre à l'intérieur de la chambre de cryostat. Ne les laissez pas dégeler si le but est d'effectuer des études IF / IHC ou coloration enzymatique.
- Stocker les diapositives à -80 ° C pour d'autres analyses.
8. Evaluation de myofibre Taille par laminine immunofluorescence (Alternative 1)
19. Bien que la coloration H & E des sections musculaires représente une méthode utile et pratique pour l'analyse de la morphologie, l'utilisation d'une approche IF 14 est nettement plus rapide et modestement plus précise que la méthode basée sur E H &. méthodes H & E sont décrites ci-dessous.
- Enlever les sections de tissus provenant soit du cryostat ou le stockage du C -80 ° et leur permettre d'atteindre la température ambiante (environ 5-10 minutes).
NOTE: Afin d'éviter des interactions non-spécifiques associés à des anticorps primaires soulevées chez la souris, il est conseillé de soit des anticorps d'utilisation élevés dans une autre espèce ou de faire usage de kits disponibles dans le commerce "souris-sur-souris" immunodétection. - Immerger les sections pré-cooled methanol (-20 ° C) pendant 10 min.
- Laver les sections à température ambiante 1x PBS pendant 5 min.
- Retirez le PBS et utiliser un stylo pour les applications immunohistochimiques pour encercler les sections sur la diapositive. Ne pas laisser les sections complètement sec à tout moment.
- Appliquer un tampon approprié de blocage (5 - 8% de FBS dans du PBS, soit 5% de sérum de chèvre dans du PBS) sur les sections pendant une heure à température ambiante.
- Éliminer le tampon de blocage.
- Appliquer soit un anti- laminine de lapin (1:30) ou l'anti-dystrophine de la souris (1:30) d'anticorps primaire dans du tampon de blocage sur les sections pendant 2 heures à la température ambiante (ou pendant une nuit à 4 ° C) dans une chambre humide.
- Laver les sections avec 1x PBS pendant 5 min.
- Retirez le tampon de lavage et laver à nouveau dans les sections 1x PBS pendant 5 min.
- Retirez le tampon de lavage et d'appliquer un anticorps secondaire fluorescent approprié (1: 1000 dans un tampon de blocage) pour les sections dans une chambre humide pendant 1 heure à température ambiante.
- Retirer l'anticorps secondaire et laver les sections avec 1x PBS pendant 5min.
- Retirez le tampon de lavage et répéter le lavage avec PBS 1x pendant 5 min. Retirez le tampon de lavage et de couvrir les sections avec un verre de couverture en utilisant un milieu aqueux à base.
- Identifier les caractéristiques morphologiques du muscle en utilisant des images numériques de la section tachée. Pour ce faire, utilisez un microscope à lumière fluorescente inversée IF sections (un objectif 10X ou 20X grossissement est approprié), ainsi qu'un logiciel de la caméra et la capture d'image numérique. Placez une barre d'échelle dans chaque image numérique (20 - 30 champs aléatoires sont recommandés pour chaque section de muscle) pour faciliter la quantification de la CSA. Les images doivent être enregistrées au format TIF pour être compatible avec le logiciel d'analyse d'image en utilisant le programme ImageJ.
- Utiliser une macro ImageJ pour distinguer du tissu conjonctif à partir de tissu contractile (taille des fibres musculaires) , grâce à la présence de l'anticorps secondaire fluorescent dans l'endomysium 20.
NOTE: La macro et les instructions sont disponibles à partir de l'autheurs, Richard Lieber et Shannon Bremner. - Ouvrez le programme ImageJ en double-cliquant sur l'icône sur le bureau.
- Chargez la macro CSA en cliquant une fois sur l'onglet "Plugins". Déplacez le curseur vers le bas pour sélectionner l'option "Install" en cliquant une fois.
- Charger la macro transversale en le sélectionnant dans le dossier, il a été enregistré dans, puis cliquez sur «Ouvrir».
- Une fois que la macro a été ouvert, ouvrez l'image histologique contenant la barre d'échelle en cliquant sur "Fichier" puis "Ouvrir" dans la barre d'outils ImageJ.
- Une fois que l'image est ouverte, sélectionnez l'outil "en ligne droite" dans le programme ImageJ en cliquant sur l'icône avec la ligne droite.
- Une fois l'outil "en ligne droite" est sélectionné, cliquez une fois sur l'extrémité la plus à gauche de la barre d'échelle, puis cliquez une fois sur l'extrême droite fin de la barre d'échelle. Une fois fait correctement, il devrait y avoir une ligne jaune superposée sur la barre d'échelle.
- Faire en sorte que le yelloligne w est toujours superposée sur la barre d'échelle, sélectionnez l'onglet "Analyse" de la barre d'outils ImageJ en cliquant une fois.
- Dans l'onglet "Analyser", déplacez le curseur vers le bas et sélectionnez "échelle set" en cliquant une fois.
- Dans la fenêtre «Définir échelle», NE PAS modifier la valeur de la «Distance en pixels" boîte. Entrez la distance connue de la barre d'échelle dans la zone "distance Connu". Changer les unités dans la zone «Unité de longueur" pour correspondre avec les unités de barres d'échelle (ie, micromètres = um). Enfin, sélectionnez "global" en cliquant sur la case à gauche de "Global" une fois.
- Fermez la fenêtre «Définir échelle».
- Ouvrez la première image à mesurer en appuyant sur la touche "O" sur le clavier. Observer une fenêtre pop-up qui permet à l'utilisateur de trouver et de sélectionner l'image à mesurer à partir du dossier, il a été enregistré dans. Sélectionnez l'image en cliquant dessus une fois, puis en cliquant sur «Ouvrir». <li> Une fois ouvert, une fenêtre devrait apparaître pour la sélection de la plage acceptable pour les mesures de l'ASC et la circularité.
- Après avoir réglé la plage de la CSA et la circularité, observer l'image couverte en pixels rouges avec une fenêtre "Threshold". Réglez le seuil de l'image en utilisant les barres dans la fenêtre "Seuil" jusqu'à ce que les fibres musculaires sont remplis avec précision avec des pixels rouges.
NOTE: Tenter d'obtenir le plus grand nombre de fibres qui ne se touchent pas les uns les autres; si les fibres se touchent, ils seront mesurés comme une grande fibre, qui devra être modifié en aval. - Après avoir réglé le seuil, appuyez sur la touche "1" sur le clavier pour mesurer les fibres musculaires.
- Encerclez les fibres musculaires individuelles avec une ligne jaune.Déplacez-vous dans l'image et supprimer les artefacts ou les fibres doubles qui ont été sélectionnés par le programme. Pour ce faire, sélectionnez les structures qui ne sont pas des fibres en les cliquant une fois, puis appuyez sur la touche "D" sur le clavier. Cela les supprimer à partir des mesures.
- Sélectionnez et copiez les mesures de la "fenêtre de valeur de mesure," et les coller dans une feuille de calcul pour une analyse ultérieure.
Remarque: Les valeurs ainsi obtenues peuvent également être utilisées pour évaluer l'analyse de la distribution des fibres, qui représente généralement un paramètre utile pour déterminer si la croissance tumorale favorise un glissement vers les fibres musculaires plus petites. - Fermez toutes les fenêtres ouvertes dans ImageJ en cliquant sur le «X» dans le coin supérieur gauche de la fenêtre.
- Ouvrir une nouvelle image à mesurer en appuyant sur "O" et répéter les étapes de 8,24 à 8,29.
REMARQUE: Ces paramètres sont généralement laissés à leurs valeurs par défaut. Cependant, si l'on veut modifier ces paramètres, assurez-vous de conserver les valeurs identiques pour chaque image consécutive à mesurer dans l'expérience.
9. Évaluation de myofibre Taille de H & E Stained Sections (Alternative 2)
- Placer le verreglisse dans des bocaux Coplin contenant filtrés Harris hématoxyline pendant 8 min.
NOTE: Sinon, Mayer hématoxyline peut être utilisé si une tache moins intense est souhaitée. - Rincer les lames dans de l'eau déminéralisée.
- Plonger les lames dans l'eau du robinet jusqu'à 5 min.
- Rincer rapidement dans de l'eau déminéralisée, puis les incuber dans filtrée solution éosine 1% pour moins de 2 min.
NOTE: Si une tache plus intense est souhaitée, ajouter 1 - 2 gouttes d'acide acétique (0,01% ou moins) à la solution de l'éosine. - Commencez les étapes de déshydratation. Rincer les lames dans 70% d'éthanol pendant moins de 1 min.
- Plonger les lames dans 90% d'éthanol pendant 1 min.
- Plonger les lames dans 95% d'éthanol pendant 1 min.
- Plonger les lames dans 100% d'éthanol pendant 2 min.
- Plonger les lames dans du xylène pendant 2 min. Déplacer les diapositives dans un autre pot Copley contenant du xylène frais pour encore 2 min.
REMARQUE: Conservez les lames dans Xylène (pas plus de 1 heure) jusqu'à ce qu'ils soient lamelle. - Placer le coverslips sur les sections du muscle à l'aide de Permount ou d'un support de montage à base Xylène de choix.
- Observer les lames de verre H & E-colorées au microscope avec un grossissement 20X, et d'acquérir des images de l'ensemble de la zone de section de muscle. Obtenir des images en utilisant un microscope lumineux lumière, appareil photo numérique, et le logiciel de capture d'image.
NOTE: La présence d'une barre d'échelle ou de l'image d'un micromètre pris au même grossissement sera nécessaire pour déterminer la CSA. Comme précédemment, enregistrement d'au moins 20 - 30 champs aléatoires pour chaque section du muscle. - Évaluer la taille de myofibre en utilisant le logiciel ImageJ. Ouvrez toutes les images numériques. Réglez l'échelle comme ci-dessus. Mesurer au moins 1500-2000 fibres musculaires par muscle en utilisant l'outil de sélection à main levée, le traçage de la circonférence de la fibre avec une souris ou, pour une saisie plus rapide, avec un dispositif d'entrée de tablette et le stylet.
Collecte de données et analyse 10.
- Afin d'établir la taille des fibres musculaires, d'évaluer la superficie moyenne de la fibre "."Calculer les moyens et SD pour les mesures obtenues pour chaque muscle, y compris à la fois la zone et le diamètre de Feret. En outre, afin d'évaluer si le cadre expérimental est associé à un glissement vers les fibres musculaires, soit plus ou moins grandes, analyser la" distribution de fibres ».
- Évaluer l'importance du résultat en effectuant un test T apparié pour deux groupes. Déterminer les rapports entre les valeurs obtenues pour le groupe de souris C26 et pour le groupe témoin. Tracer les valeurs sur un graphique des rapports moyens SD et la fréquence de distribution / histogramme visant à démontrer l'évolution de la taille des fibres.
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Representative Results
C26 cinétique de croissance de la tumeur montrent une phase de latence de la première 7 - 8 jours après l'injection, suivie d'une croissance cellulaire exponentielle (4 - 5 d). La masse tumorale atteint finalement ~ 10% du poids corporel (environ 2 g, figure 1A-B). Pendant la première phase, la tumeur peut être localisée uniquement par palpation et apparaît comme une petite saillie de la peau. Dans la deuxième phase, la tumeur est observée comme une masse sous la peau. Rarement, la tumeur devient ulcérée, ce qui entraîne une plaie ouverte; dans ce cas, la souris est exclu du groupe expérimental et est humainement euthanasié.
Le poids corporel est inchangé dans la première phase, mais elle est considérablement réduite dans la seconde phase, lorsqu'elle atteint 10 à 15% du poids corporel initial (30% dans le cas de poids sans tumeur, figure 1A). les souris porteuses de tumeurs apparaissent gaspillées et ont montré la fourrure ébouriffée à la fin de lapériode expérimentale, avec une condition corporelle (BC) score égal à 1 18 (figure 1C). BC1 représente une souris sévèrement émaciée, où les structures squelettiques sont évidents et les vertèbres sont nettement segmentée. Perte de poids corporel est principalement expliquée par les deux squelettiques atrophie du tissu musculaire et la graisse (figure 1B). La perte de poids corporel est cohérente avec une réduction d'environ 20 - 30% en poids des muscles squelettiques, en particulier dans le gastrocnémien, tibial antérieur et quadriceps (figure 2). Le muscle cardiaque est également réduite de manière significative en poids, bien que dans une moindre mesure, par rapport aux autres muscles squelettiques (Figure 2). Fait intéressant, une hépatomégalie (+ 16%, p <0,01) et une Splenomegalie (+ 110%, p <0,01) sont généralement détectés dans les hôtes de la tumeur, tandis que la masse grasse, semblable à un muscle squelettique, est fortement appauvrie (-70%, p <0,001 La figure 3).
(figure 4A-B). En particulier, l'analyse de la distribution des fréquences montre un déplacement vers les fibres de plus petite taille chez les souris porteuses C26, suggérant ainsi que l'ensemble du muscle subit une atrophie de la présence d'une tumeur C26 (figure 4C). Des résultats similaires peuvent être observés en tirant profit d'une méthode traditionnelle à base d'E H & pour la quantification de la taille de la fibre, bien que l'ampleur de la variation de l'ASC musculaire associée à la croissance du cancer est légèrement différent (38% par rapport au témoin, p <0,01 pour la FI méthode à base; -18% par rapport au témoin, p <0,01 pour la méthode basée sur E H &; Figure 5).
Figure 1: poids du corps dans le contrôle et la souris C26-portant. A) courbe de poids du corps dans le contrôle et les hôtes C26 sur toute la période expérimentale (14 jours après l' injection de la tumeur). B) de poids corporel initial (IBW), poids corporel final sans tumeur (FBW), et le poids de la tumeur dans le contrôle et C26- animaux porteurs. C) images représentatives des contrôles et C26 porteurs au moment du sacrifice (jour 14 après l' inoculation de la tumeur). Les données sont exprimées sous forme de moyenne SD. n = 6. Signification des différences: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 par rapport au groupe témoin utilisant le test t de Student. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Muscle poids dans le contrôle et C26 portant souris. Les tibialis, gastrocnémien, les quadriceps, et du poids du cœur dans le contrôle et la C26 tumoraux porteurs sont signalés comme étant le poids / 100 mg IBW. Les données sont exprimées en moyenne ± écart type. n = 6. Signification des différences: ** p <0,01 et *** p <0,001 par rapport au groupe témoin utilisant le test t de Student.
Figure 3:. Poids des organes de contrôle et de souris C26 portant le foie, la rate et l' épididyme poids pad de graisse dans le contrôle et la C26 tumoraux porteurs sont signalés comme étant le poids / 100 mg IBW. Les données sont exprimées en moyenne ± écart type. n = 6. Signification des différences: ** p <0,01 par rapport au groupe témoin.
Figure 4: Morphométrie pour myofibre Taille par immunofluorescence. A) la réaction immunohistochimique de sections de fluorescence tibial à l' aide d' un anticorps anti-dystrophine (Vector Laboratories) et des hôtes de contrôle C26. Grossissement: 10X. Taille bar:. 100 um B) Quantification de la CSA dans le muscle tibial mesuré avec la distribution ImageJ macro C) Fréquence de la CSA dans le muscle tibial de contrôle et des souris C26-portant.. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. n = 6 pour chaque groupe. Importance des différences: ** p <0,01 par rapport au groupe témoin utilisant le test t de Student.
Figure 5: Morphométrie pour myofibre Taille par H & E. A) hématoxyline & éosine des sections tibial du contrôle et des hôtes C26. Grossissement: 20X. Taille bar:. 100 um B) Quantification et la fréquence de distribution desCSA dans le muscle tibial. Les données sont exprimées en moyenne ± écart type. n = 6. Signification des différences: *** p <0,001 par rapport au groupe témoin utilisant le test t de Student.
| Auteurs | souche de souris | égalité des souris | Numéro de téléphone | Origine | Implantés comme tumeur solide? | Site d'injection | Journées |
| Lazarus et coll., 1999 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NCI | NON | Dorsale région | 17 |
| Al-Majid et McCarthy, 2001 | CD2F1 | F | 2,5 x 10 6 | OSUMC | NON | Dorsale région | 17 |
| Samuels et al., 2001 | Balb / c | M | 0,5 g / ml de suspension de tumeurs | ns | OUI | Dorsale région | Jusqu'à 11 |
| Acharyya et al., 2004 | CD2F1 | M | 1 x 10 7 | OSUMC | NON | flanc droit | Jusqu'à 24 |
| Aulino et al., 2010 | Balb / c | ns | 0,5 mm 3 | NCI | OUI | Dorsale région | 21 |
| Benny-Klimek et al., 2010 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NON | Dorsale région | 14 |
| Bonetto et al . , 2011; 2012 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NON | Dorsale région | |
| Cosper et Leinwand 2010 | CD2F1 | H + F | 5 x 10 5 | ns | NON | flanc droit | Jusqu'à 27 |
| Murphy et al., 2012 | CD2F1 | ns | 5 x 10 5 | NCI / OSUMC | NON | Dorsale région | 14 |
| Cornwell et al., 2014 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NCI | NON | Droit & flanc gauche | Jusqu'à 26 |
| Assi et al., 2016 | Balb / c | ns | 1 x 10 6 | Service de la lignée cellulaire | NON | Dorsale région | Jusqu'à 22 |
Tableau 1:. Comparaison des différents protocoles utilisés pour C26 Implantation Différent protocoles pour l'implantation C26 sont prévus, avec une référence particulière à la souche de souris utilisée, le nombre de cellules et le type de tumeur inoculée, l'origine cellulaire, le site d'injection, et la longueur de la période expérimentale. OSUMC: Ohio State University Medical Center. NCI: National Cancer Institute. Service commercial NS lignée cellulaire: non précisé.
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Discussion
Surtout dans ses derniers stades, le cancer colorectal est associé au développement de la cachexie, qui est responsable des résultats et des réductions de la qualité de vie des patients les plus pauvres. De nombreuses études ont porté sur le traitement des pathologies secondaires au cancer; cependant, en dépit de nombreux efforts dans ce sens, il n'y a toujours aucun traitement approuvé pour la cachexie du cancer 21. Ainsi, il est impératif que les modèles animaux ressemblent aussi étroitement que possible la pathologie humaine, afin de maximiser l'application des résultats.
Des souris portant une tumeur C26 sont un modèle expérimental couramment utilisée de la cachexie cancéreuse 22-24. Ce modèle ressemble beaucoup à la maladie humaine, montrant des réductions dans le corps, les muscles et la masse grasse, ainsi que l' atrophie musculaire de la fibre et l' augmentation de l' expression de gènes inflammatoires et ubiquitine ligases compatibles avec la protéine marquée hypercatabolisme 2,5. Malgré cela, quelques disparités avec les données obtenues patie du cancernts ont été signalés 25,26. En effet, certaines caractéristiques du modèle, y compris l'environnement de croissance non physiologique (par exemple, une tumeur ectopique cultivées sous - cutanée au lieu de orthotopique implanté dans le tractus gastro - intestinal), la période expérimentale relativement courte par rapport à d' autres modèles (par exemple, l' injection génétique ou orthotopique de tumeurs), la dépendance à l'IL-6 l'action, et l'utilisation nécessaire de souris / c CD2F1 ou Balb peut représenter des limitations sévères et pourrait limiter l'interprétation des résultats.
Le protocole actuel est avéré être hautement reproductible à travers de nombreuses expérimentations effectuées dans notre laboratoire, en conservant les mêmes caractéristiques et permettant des comparaisons entre les résultats obtenus à différents moments dans différents lieux géographiques, et par différents chercheurs 3,10. Toutefois, afin de promouvoir la reproductibilité des données, il est important d'établir des lignes directrices claires et communes.
Comme gathered de la littérature, plusieurs mises en garde pourrait empêcher la reproduction des mêmes données dans deux laboratoires différents. Pour les mêmes raisons, l'utilisation de différents protocoles peut générer différents phénotypes et les résultats, ainsi que conduisent à des résultats contradictoires et discutables. En effet, les différences dans l' exécution de ce modèle animal ont été rapportés, résultant principalement de la souche (Balb / c ou CD2F1) 2,5,27-29 ou le sexe des souris utilisées 17, le type de tumeur qui a été implantée (une suspension cellulaire 3 , 29 plutôt que d' une tumeur solide chez un greffon 2,30), la source de la tumeur (NCI, ATCC ou OSUMC), le nombre de cellules qui ont été injectés C26 et du site d'injection ou d' implantation (6,17 flancs, 31 ou dans la région dorsale 3,10,32). Aucune comparaison directe des effets associés à l'implantation de lignées cellulaires C26 obtenues à partir de différentes sources (principalement OSUMC contre NCI) n'a jamais été réalisé, nous empêchant ainsi de tirer aucune conclusi définitiveons. Cependant, il est probable que le choix de la source de cellules peut également influencer de manière significative les résultats escomptés. Lorsque l'on considère le choix des hommes contre les femmes, les enquêteurs devraient être rappelés des différences significatives dans les résultats. En effet, comme indiqué par Cosper et Leinwand 17, les souris porteuses de tumeurs mâles, en raison de l'absence d'oestrogènes, peuvent présenter un phénotype plus sévère que chez les femmes, y compris une plus grande perte de la masse cardiaque et la mortalité, une réponse pro-inflammatoire plus robuste à la tumeur , et une plus grande autophagie cardiaque.
Surtout pour les enquêteurs qui ne sont pas familiers avec ce modèle et peut d'abord faire face à des problèmes, basée à la fois sur une analyse de puissance et de notre expérience antérieure, l'utilisation d'au moins 6 animaux par condition expérimentale (n = 6) est conseillé afin de détecter statistiquement différences significatives. Il est également essentiel que la randomisation est réalisée avec soin, de sorte que le poids corporel initial dans les animaux de laboratoirene diffèrent pas significativement entre les groupes. De même, il est conseillé que, afin d'éviter la variabilité inter-opérateur, le même enquêteur effectuer la collecte de tissus et d'organes sur chaque animal. En outre, il est impératif que les tissus (en particulier musculaires) sont gelés aussi vite que possible afin de préserver les ARN et la structure et l'activité enzymatique, en particulier si le but de l'étude est d'évaluer l'expression du gène ou d'évaluer les activités enzymatiques. Par ailleurs, dans le but de déterminer la CSA musculaire, nous avons montré que les rapports de la surface des fibres est généralement acceptée et représentative de la taille des fibres musculaires. Ici, nous présentons deux méthodes distinctes pour évaluer CSA musculaire. Comme on le voit sur les figures 4-5, les deux méthodes ont été capables de détecter une diminution significative de la taille des fibres musculaires entre les témoins et les hôtes de la tumeur, bien que le degré de dépérissement est apparu différent.
Cet écart peut résulter du fait que, bien que les deux méthodes sont des moyens acceptables pour les âness muscle taille des fibres, la quantification des caractéristiques musculaires de diapositives H & E-tachées est encore un processus manuel ou semi-automatique, le plus souvent de main-d'œuvre, de temps, et affectées par une précision limitée. Sur la base de notre expérience, nous croyons que la méthode basée-IF est une technique plus précise signaler CSA musculaire. En effet, le nombre de fibres qui peuvent être mesurés automatiquement en tirant avantage de cette technique est beaucoup plus importante, augmentant ainsi la précision de la mesure. Il convient de noter, pour les deux techniques, une méthode alternative de la taille du muscle de rapport évalue le diamètre du Feret. Fait intéressant, cela est considéré comme un outil très fiable en raison du fait que ce paramètre est en grande partie indépendante de l'angle de coupe. D'autres paramètres, tels que le "diamètre intérieur minimal" et le "diamètre extérieur minimal» sont également insensibles au plan de la coupe et peuvent être utilisés à la place du diamètre de Feret comme le remplacement des indications sur la fibtaille de er.
En conclusion, bien que la communauté de cachexie a clairement besoin d'établir des modèles plus physiologiques pour l'étude de l'atrophie musculaire associée à la tumeur, nous croyons que les souris portant le carcinome du côlon C26 représentent un modèle bien standardisé et facile à utiliser pour étudier les altérations moléculaires et anomalies physiologiques généralement détectés après l'apparition d'une tumeur. Les applications futures comprendront l'enquête de savoir si l'implantation orthotopique de cellules C26 dans le côlon peut représenter un modèle adéquat et plus physiologique de la cachexie du cancer colorectal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Flasks | Falcon - Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
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